Análisis de microscopía de video de alta velocidad para el diagnóstico de primera línea de discinesia ciliar primaria
19 de enero de 2022
El análisis de microscopía de video de alta velocidad es una herramienta relativamente fácil de realizar, rápida, rentable y, en manos experimentadas, una herramienta considerablemente confiable para el diagnóstico de primera línea de la discinesia ciliar primaria, que debe estar disponible en todos los centros involucrados en el diagnóstico y el tratamiento de enfermedades pulmonares graves.
El análisis de microscopía de video de alta velocidad es una herramienta confiable para el diagnóstico de primera línea de la discinesia ciliar primaria. Esta técnica es relativamente fácil de realizar, rápida, rentable y, en manos experimentadas, una herramienta muy confiable. Y es aplicable para pacientes de todos los grupos de edad.
La microscopía de video también revela la función ciliar secundaria. Como, por ejemplo, debido a infecciones bacterianas o virales. Pero se ha utilizado principalmente para diagnosticar la discinesia ciliar primaria.
Los científicos utilizan este método también para visualizar procesos intracelulares o funciones biológicas en células vivas. Me asistirá en este procedimiento la Sra. Tina Peromaa, nuestra técnica de laboratorio.
Antes de recolectar las células epiteliales respiratorias, pídale al paciente que se suene bien la nariz. Cuando el paciente esté listo, mantenga la cabeza del paciente fija con una mano y use un cepillo interdental de 0,6 milímetros de tamaño en la otra mano para cepillar el cornete inferior de la fosa nasal para recolectar suficientes tiras de células epiteliales. Deje caer las tiras de células cosechadas en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros que contiene el DMEM nutrido por la célula.
Después de cerrar la tapa del tubo de la microcentrífuga, sostenga el tubo contra la fuente de luz y agite el tubo para descubrir las tiras y conglomerados celulares cosechados. Posteriormente, coloque los tubos de la microcentrífuga con las tapas correctamente cerradas en una caja de poliestireno. Antes de cerrar la caja herméticamente, asegúrese de que los tubos estén fijos dentro de la caja.
Luego agregue una compresa fría a la caja mientras evita congelar la muestra. Después de retirar los tubos de micro centrífuga que contienen las muestras de la caja de poliestireno, coloque un tubo debajo de una campana de la unidad de calentamiento del microscopio para calentar hasta 37 grados centígrados para el análisis de microscopía de video de alta velocidad o HSVMA. A continuación, inicie la cámara y el software de la unidad de video en la computadora.
Use una pipeta para tomar una muestra pequeña y coloque dos gotas de la muestra en una cubeta. Cubra la cubeta con una tapa antes de colocarla bajo el microscopio. Use una lente de inmersión en aceite con un aumento de 100x y coloque una gota de aceite de inmersión en la superficie de la óptica.
Mientras se acerca al fondo del plato con la lente del microscopio, busque los grupos de células sin glóbulos rojos y con bajo contenido de moco. Después de encontrar una región representativa de interés, o ROI, concéntrese en un grupo de cilios golpeadores con los movimientos de cilios más grandes y grabe una secuencia de video. Graba las células con cilios golpeados lateralmente y desde arriba.
El análisis representativo muestra movimientos normales de los cilios vistos lateralmente y desde arriba. La muestra de un paciente con discinesia ciliar primaria, o PCD, con una mutación en el gen DNAH11 demostró el patrón clásico de latido ciliar rígido y mínimamente móvil. Cuando se ve desde un lado y desde arriba.
En otro paciente con PCD con la misma mutación, se observó un patrón hipercinético pero ineficiente diferente de los cilios golpeadores. También se observó un patrón de latido ciliar patológico y una frecuencia de latido ciliar en un paciente con infecciones recurrentes de las vías respiratorias superiores. Si el procedimiento de cepillado se lleva a cabo rigurosamente, el análisis de HSVMA no se pudo realizar ya que las células epiteliales ciliadas se cubrieron con una capa de glóbulos rojos.
El paso más importante en el procedimiento es obtener suficientes células respiratorias de los cepillados y mantener este material bien conservado para el análisis de video. El material restante se puede utilizar para realizar microscopía electrónica o microscopía inmunoflourescense para detectar posibles defectos estructurales en los cilios o para revelar defectos y la síntesis de proteínas ciliares.
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Descripción general
El análisis mediante microscopía de video de alta velocidad es una herramienta confiable y rentable para el diagnóstico de la disquinesia ciliar primaria. Es fácil de realizar y aplicable en todos los grupos de edad, lo que la convierte en un recurso esencial para centros que tratan enfermedades pulmonares graves.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Medicina respiratoria
- Técnicas de diagnóstico
Antecedentes
- La displasia ciliar primaria es una afección que afecta la función de los cilios.
- La microscopía de video de alta velocidad puede revelar tanto la función ciliar primaria como secundaria.
- Esta técnica es particularmente útil para diagnosticar problemas respiratorios relacionados con la disfunción ciliar.
- Es importante que los clínicos tengan acceso a herramientas diagnósticas confiables.
Objetivo del estudio
- Evaluar la eficacia de la microscopía de video de alta velocidad en el diagnóstico de la displasia ciliar primaria.
- Evaluar la aplicabilidad de esta técnica en diferentes grupos de edad de pacientes.
- Destacar la importancia de esta herramienta diagnóstica en entornos clínicos.
Métodos Utilizados
- Análisis mediante microscopía de video de alta velocidad.
- Evaluación del movimiento y función de los cilios.
- Comparación de resultados entre diversas demografías de pacientes.
- Evaluación de la función ciliar secundaria en relación con infecciones.
Resultados principales
- La microscopía de video de alta velocidad es eficaz para diagnosticar la disquinesia ciliar primaria.
- La técnica es confiable cuando la realizan personal experimentado.
- Proporciona información sobre la función ciliar secundaria.
- Aplicable a pacientes de todas las edades, lo que mejora su utilidad en la práctica clínica.
Conclusiones
- La microscopía de video de alta velocidad debería ser una herramienta diagnóstica estándar en medicina respiratoria.
- Su facilidad de uso y fiabilidad la hacen adecuada para el diagnóstico de primera línea.
- La disponibilidad generalizada puede mejorar los resultados en pacientes con enfermedades pulmonares graves.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El análisis mediante microscopía de video de alta velocidad (HSVMA) proporciona un método rápido y rentable para el diagnóstico inicial de la displasia ciliar primaria (PCD), un trastorno genético raro que afecta la eliminación mucociliar. Al permitir la visualización directa de los patrones de movimiento ciliar en células epiteliales respiratorias vivas, el HSVMA favorece la detección temprana y reduce la dependencia de técnicas más exigentes en recursos, como la microscopía electrónica de transmisión. Esta capacidad mejora el rendimiento diagnóstico en centros de neumología y enfermedades raras, facilitando intervenciones oportunas y reduciendo las complicaciones pulmonares a largo plazo.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación funcional de la motilidad ciliar en células derivadas de pacientes, lo que apoya la validación de dianas en la investigación de ciliopatías.
- Valor operativo: Ofrece un indicador reproducible para evaluar intervenciones genéticas o farmacológicas sobre la función ciliar.
- Valor predictivo: Distingue entre defectos estructurales y funcionales, mejorando la confianza en las hipótesis mecanicistas.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Genera datos cuantitativos sobre la frecuencia de latido y la forma de onda de los cilios para la estandarización de ensayos.
- Valor operativo: Facilita el desarrollo de protocolos estandarizados para la obtención de imágenes en células vivas en modelos de enfermedades respiratorias.
- Escalabilidad: Permite el análisis de alto contenido de la dinámica ciliar en múltiples muestras de pacientes o variantes genéticas.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Continuidad Translacional: Relaciona hallazgos in vitro con fenotipos clínicos mediante la correlación de los resultados de HSVMA con la gravedad de la enfermedad.
- Reducción de Riesgos Mecanicistas: Identifica la recuperación funcional en modelos preclínicos mediante la restauración del latido cilial normal.
- Alineación de Biomarcadores: Proporciona lecturas funcionales que complementan los biomarcadores estructurales o moleculares en la DPQ.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
HSVMA se integra en el continuo de descubrimiento desde la validación del blanco hasta la evaluación preclínica, ofreciendo un ensayo funcional para el desarrollo de terapéuticas ciliares.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la comprobación de hipótesis sobre genes implicados en la formación y motilidad de los cilios, como DNAH11.
- Selección: Proporciona lecturas cuantitativas en tiempo real adecuadas para la selección de compuestos en modelos de ciliopatías.
- Análisis: Permite la comparación estadística de los parámetros del latido ciliar entre diferentes condiciones, apoyando decisiones basadas en datos.
- Investigación Traducional: Conecta los fenotipos celulares con resultados clínicos, facilitando la transición de la fase preclínica a la clínica.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable para evaluar la función ciliar en diversos modelos de enfermedades respiratorias.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Reduce la ambigüedad mecanicista al proporcionar una visualización directa de la dinámica ciliar en contextos celulares nativos.
- Valor operativo: Asegura la estandarización y reproducibilidad mediante protocolos definidos de muestreo, preservación e imagen.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción en la validación de dianas al confirmar la relevancia funcional de los hallazgos genéticos.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de dianas de ciliopatías basada en evidencia de rescate funcional.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en la recolección de células, operación de microscopía y análisis de video para una interpretación precisa.
- Depende de sistemas de microscopía de video de alta velocidad con óptica de inmersión en aceite y control ambiental.
- Necesita procedimientos estandarizados para el manejo de muestras a fin de prevenir contaminación o degradación.
- La adaptación entre sistemas modelo puede requerir la optimización de las condiciones de cultivo y los parámetros de imagen.
- Está limitado por la necesidad de muestras epiteliales viables y sin contaminación; la presencia de glóbulos rojos o moco puede obstaculizar el análisis.
Preguntas frecuentes sobre biofármacos
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:06
Collection and Transport of Respiratory Epithelial Cells
2:20
High-Speed Video Microscopy Analysis (HSVMA)
3:43
Results: Analysis of Ciliary Motion in Healthy Individual and Primary Ciliary Dyskinesia (PCD) Patients
4:49
Conclusion
