Name: Inducción de la inflamación intestinal por transferencia adoptiva de células T CD4+ transgénicas CBir1 TCR a ratones inmunodeficientes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-16T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 34 s
Description: Aprende a inducir colitis mediante transferencia adoptiva de células T CD4+ transgénicas CBir1 TCR a ratones Rag1-/-. Este modelo permite estudiar los mecanismos de la enfermedad inflamatoria intestinal y evaluar terapias potenciales.

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Este trabajo fue apoyado en parte por las subvenciones DK125011, AI150210 y DK124132 de los Institutos Nacionales de Salud, el premio STARs del Sistema de la Universidad de Texas (Y.C.) y el Fondo de Becas James W. McLaughlin de la Rama Médica de la Universidad de Texas en Galveston (W.Y.). La Figura 1 se creó con BioRender.com.

Todos los procedimientos con animales se realizaron de acuerdo con el Comité sobre el Uso y Cuidado de los Animales de la Rama Médica de la Universidad de Texas. Los ratones CBir1 TCR Tg fueron proporcionados por el Dr. Charles Elson de la Universidad de Alabama en Birmingham. Los ratones CBir1 TCR Tg pueden ser hembra o macho, pero deben ser a las 8-12 semanas. Los ratones Rag1-/- en el fondo C57BL/6 se obtuvieron del Laboratorio Jackson10. Los ratones Rag1-/- deben ser de género y edad, y se puede usar macho o hembra, pero deben ser a las 8-12 semanas. Todo el protocolo se resume en la Figura 1.
1. Preparación de los ratones receptores
<ol><li>Prepare ratones Rag1-/- en el fondo C57BL/6, criados en la misma instalación animal específica libre de patógenos. Calcular el número de ratones por grupo mediante análisis de potencia11. NOTA: Los ratones Rag1-/- no tienen células T maduras y células B10.</li>
	<li>Marque los ratones con un golpe de oreja.</li>
	<li>Pesar los ratones el mismo día de la transferencia de células T.</li>
</ol>2. Preparación de los reactivos y soluciones
NOTA: Los reactivos utilizados son tóxicos, o de riesgo biológico y su manejo requiere precauciones y medidas de seguridad.
<ol><li>Prepare el tampón de lavado: agregue 5 ml de penicilina-estreptomicina 100x en 500 ml de medio RPMI 1640. Mézclalo bien y guárdalo a 4 °C.</li>
	<li>Prepare tris-NH4Cl Lysis Buffer.<ol>
<li>Preparar la solución Parte A. Disolver 2,06 g de base Tris en 100 ml de agua de doble destilación (ddH2O) y ajustar el valor de pH a 7,2 con HCl.</li>
		<li>Preparar la solución Parte B. Disolver 7,47 g de NH4Cl en 800 mL de ddH2O.</li>
		<li>Mezcle A y B a fondo. Mide el pH y ajústalo a 7.2 si no.</li>
		<li>Ajuste el volumen total a 1000 ml. Autoclave y luego guárdelo a 4 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare el búfer de aislamiento.<ol>
<li>Añadir 2,5 g de BSA y 500 μL de EDTA (0,5 M, pH 8,0) en 500 mL de 1x PBS. Mézclalo bien.</li>
		<li>Filtre la solución a través de un filtro de tapa de botella desechable accionado al vacío de 0,22 μm (consulte la Tabla de materiales). Guárdelo a 4 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare el búfer FACS. Añadir 1 mL de FBS y 50 μL de EDTA (0,5 M, pH 8,0) en 50 mL de Tampón de lavado (preparado en el paso 2.1). Mezclar bien y almacenar a 4 °C.</li>
	<li>Prepare el medio completo. Agregue 5 ml de FBS en 45 ml de tampón de lavado. Mezclar bien y almacenar a 4 °C.</li>
	<li>Prepare el búfer EDTA-PBS.<ol>
<li>Calcule el volumen del búfer EDTA-PBS necesario. Volumen (mL) = número de ratón x 20.</li>
		<li>Agregue el volumen apropiado de FBS, EDTA y HEPES en el PBS (2% de FBS, 0.5 mM de EDTA, 10 mM de HEPES en PBS) (ver Tabla de Materiales).</li>
		<li>Mézclelo bien y precaliente en un baño de agua a 37 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare el tampón de digestión.<ol>
<li>Calcule el volumen del tampón de digestión necesario. Volumen (mL) = número de ratón x 10.</li>
		<li>Agregue el volumen apropiado de FBS, colagenasa IV y DNasa I en el tampón de lavado (2% de FBS, 0.5 mg / ml de colagenasa IV y 10 U / ml de DNasa I en el tampón de lavado) (consulte la Tabla de materiales).</li>
		<li>Mézclelo bien y precaliente en un baño de agua a 37 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare la solución Percoll.<ol>
<li>Prepara 100% Percoll. Agregue 5 ml de PBS 10x en 45 ml de Percoll original (ver Tabla de materiales).</li>
		<li>Prepare el 2% de FBS en el tampón de lavado. Agregue 1 ml de FBS en 49 ml de tampón de lavado.</li>
		<li>Caulcule el volumen de 40 % de Solución de Percoll y 75 % de Solución de Percoll. Volumen de solución de Percoll al 40% (ml) = número de ratón x 4; Volumen de solución de Percoll al 75% (ml) = número de ratón x 2. NOTA: Los reactivos/soluciones preparados en los pasos 2.1-2.5 se utilizarán en los pasos 3-4, y los preparados en los pasos 2.6-2.8 se utilizarán en el paso 9. Todos los reactivos/soluciones utilizados en el paso 9 deben estar recién preparados. Se recomienda hacer un 5 % de Buffer adicional para todos los pasos.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Aislamiento de células T esplénicas CBir1 TCR Tg CD4+
<ol><li>Eutanasia CBir1 TCR Tg ratón/ratones por una luxación cervical con eutanasia de CO2 (30%-70% de tasa de desplazamiento gas-aire). Humedezca los ratones con etanol al 70%.</li>
	<li>Realice una incisión en el abdomen izquierdo de ~ 1 cm, retire la piel del tejido muscular abdominal, haga una incisión de ~ 3 cm en el tejido muscular abdominal y retire el bazo con tijeras y fórceps estériles. Coloque el bazo en un plato de cultivo que contenga 5 ml de tampón de lavado prefrío (preparado en el paso 2.1).</li>
	<li>Moler el bazo con la superficie rugosa de dos portaobjetos de vidrio estériles. Transfiera la suspensión celular a un tubo centrífugo de 50 ml pasando a través de un colador de células de 100 μm (consulte la Tabla de materiales). Enjuague los portaobjetos de vidrio y el plato de cultivo con 5 ml de tampón de lavado prefrío y transfiera el tampón de lavado al tubo.</li>
	<li>Centrifugar la suspensión celular a 350 x g durante 8 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante y resuspenda las células con 5 ml de tampón de lisis Tris-NH4Cl precalentado (preparado en el paso 2.2) por bazo. Incubar durante 10 min a temperatura ambiente. Agregue 10 ml de tampón de lavado pre-frío al tubo.</li>
	<li>Centrifugar la suspensión celular a 350 x g durante 8 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las celdas con 10 ml de tampón de aislamiento prefrío (preparado en el paso 2.3).</li>
	<li>Cuente las celdas. Mezclar 10 μL de suspensión celular con 10 μL de azul de tripano a fondo. Cargue 10 μL de la mezcla en una diapositiva, inserte la diapositiva en el contador de celdas automatizado (consulte la Tabla de materiales) y obtenga el número de celda viable12. NOTA: Se puede obtener aproximadamente 1 x 108 células de un ratón donante en este paso.</li>
	<li>Centrifugar la suspensión celular restante del paso 3.6 a 350 x g durante 8 min a 4 °C. Descarta todos los sobrenadantes.</li>
	<li>Vórtice las partículas magnéticas CD4 anti-ratón a fondo (ver Tabla de materiales), agregue directamente 50 μL de las partículas por cada 107 células y mezcle con gránulos celulares a fondo. Incubar durante 30 min a 4 °C. NOTA: Cualquier otro kit comercial de enriquecimiento de células T CD4 + se puede utilizar aquí.</li>
	<li>Transfiera la suspensión de partículas celulares a un tubo de recolección estéril. Agregue 3.5 ml de tampón de aislamiento prefrío en el tubo.</li>
	<li>Coloque el tubo en el imán de separación celular (consulte la Tabla de materiales) durante 8 minutos a temperatura ambiente. Aspire cuidadosamente el sobrenadante usando una pipeta de transferencia de 3 ml.</li>
	<li>Retire el tubo del imán de separación celular (consulte la Tabla de materiales), vuelva a suspender las celdas con un tampón de aislamiento prefrío de 3,5 ml y coloque el tubo en el imán durante 4 minutos a temperatura ambiente. Aspire cuidadosamente el sobrenadante usando una pipeta de transferencia de 3 ml.</li>
	<li>Repita el paso 3.11.</li>
	<li>Resuspendir las celdas con 1 ml de tampón FACS prefrío (preparado en el paso 2.4).</li>
</ol>4. Purificación de células T CBir1 TCR Tg naϊve CD4+
<ol><li>Cuente las celdas siguiendo el paso 3.6.</li>
	<li>Si la concentración celular es de >107/ml, agregue un volumen de tampón FACS para asegurarse de que la concentración celular sea ≤ 107/ml. NOTA: Se pueden obtener ~ 1 × 107 células de un ratón donante en este paso.</li>
	<li>Teñir los marcadores de superficie con 10 μL de CD4-APC anti-ratón, 10 μL de CD25-Percp/Cy5.5 anti-ratón y 10 μL de CD62L-PE13 anti-ratón,14 (ver Tabla de Materiales). Mezclar suavemente e incubar durante 30 min a 4 °C en la oscuridad.</li>
	<li>Lave las células con 2 ml de tampón FACS prefrío. Centrifugar la suspensión celular a 350 x g durante 8 min a 4 °C. Aspirar todo el supernatantsusing una pipeta de transferencia de 3 mL.</li>
	<li>Repita el paso 4.4.</li>
	<li>Resuspend las células a la concentración de 40 x 106/mL en tampón FACS pre-frío. NOTA: Para evitar que el clasificador se obstruya, pase las células a través de un colador de 70 μm.</li>
	<li>Añadir 0,1 μg/ml de DAPI. NOTA: DAPI se utiliza para excluir las células muertas.</li>
	<li>Preparar tubos centrífugos de 15 ml que contengan 4 ml de medio completo (preparado en la etapa 2.5) para recoger las células clasificadas.</li>
	<li>Cargue las celdas en el clasificador. Clasificar células T CD4+ naϊve individuales viables (DAPI- CD4+ CD25- CD62L+ células) en modo de pureza (tamaño de la boquilla: 70 μm; Presión: 70 PSI; Tasa de eventos: 8000-12000 eventos/s; Eficiencia: superior al 90%) (Figura 2). NOTA: Las células T Naϊve CD4+ expresan alta expresión de CD62L y carecen del marcador de activación CD2513,14.</li>
	<li>Centrifugar la suspensión celular a 350 x g durante 8 min a 4 °C. Aspira todos los sobrenadantes usando una pipeta de transferencia de 3 mL.</li>
	<li>Resuspend las células en 500 μL de 1x PBS.</li>
	<li>Contar celdas siguiendo el paso 3.6 NOTA: Se pueden obtener ~ 5 × 106 células de un ratón donante en este paso.</li>
</ol>5. Transferencia celular a los ratones receptores
<ol><li>Resuspend las células T CBir1 TCR Tg naϊve CD4+ a la concentración de 5 x 106/mL añadiendo 1x PBS.</li>
	<li>Caliente los ratones Rag-/- bajo una lámpara de calor (ver Tabla de Materiales) durante 4 minutos, y sujete a los ratones usando un retenedor de ratón.</li>
	<li>Transfiera por vía intravenosa 200 μL de la suspensión celular a la vena de la cola de ratones Rag-/- utilizando una jeringa de insulina de 1 ml (27 G) (ver Tabla de Materiales). NOTA: Las células de un ratón donante son suficientes para transferirse a alrededor de cinco ratones receptores.</li>
</ol>6. Monitoreo de los signos clínicos durante la progresión de la colitis
<ol><li>Pesa a los ratones cada semana y aumenta la observación a dos veces por semana una vez que los ratones comienzan a perder >5% de los pesos originales.</li>
	<li>Observe la respuesta / movimiento de los ratones cuando se estimula suavemente.</li>
	<li>Observar otras anomalías clínicas. es decir, la postura y la consistencia de las heces.</li>
</ol>7. Colección de colon y puntuación histopatológica
<ol><li>Sacrificar a los ratones receptores por una luxación cervical con CO2 en un punto temporal de la pérdida de peso >20% del peso original o 6 semanas después de la transferencia celular. Humedezca los ratones con etanol al 70%.</li>
	<li>Realice una incisión cutánea ventral de ~ 1 cm, aleje la piel del tejido muscular abdominal, haga una incisión de ~ 3 cm en el tejido muscular abdominal, identifique el ciego y retire todo el colon con tijeras y fórceps estériles. Humedezca el colon con PBS prefrío en un plato de cultivo.</li>
	<li>Incise el colon a lo largo y enjuáguelo con PBS pre-frío. Corte 1/3 del colon longitudinalmente.</li>
	<li>Coloque la tira de colon en una toalla de papel con el lado luminal hacia arriba. Realice el laminado suizo con un palillo de dientes15.</li>
	<li>Coloque el colon suizo en un cassette y coloque el cassette en formalina tamponada al 10% durante 24 h16, seguido de deshidratación utilizando un procesador automatizado (ver Tabla de materiales) e incrustación de parafina.</li>
	<li>Cortar secciones de tejido de 5 μm en un microtomo, montadas en portaobjetos, y realizar la tinción de hematoxilina y eosina (H&E)17 (ver Tabla de Materiales).</li>
	<li>Determinar las puntuaciones histopatológicas combinando las puntuaciones para cada uno de los seis parámetros para un máximo de 12. Inflamación de la lámina propia (normal, 0; leve, 1; moderada, 2; grave, 3); pérdida de células caliciformes (normal, 0; leve, 1; moderada, 2; grave, 3); cripta anormal (normal, 0; hiperplásica, 1; desorganización, 2; pérdida de cripta, 3); abscesos de cripta (ausente, 0; presente, 1); erosión mucosa y ulceración (normal, 0; leve, 1; moderada, 2; grave, 3); y cambio submucoso (ninguno, 0; submucosa, 1; transmural, 2)18.</li>
</ol>8. Aislamiento y tinción de células de lámina propia intestinal
<ol><li>Después del paso 7.3, corte otros 2/3 del colon en trozos de 0.5-1 cm y lávelo con PBS prefrío.</li>
	<li>Transfiera los segmentos de colon a un tampón EDTA-PBS precalentado de 20 ml en un tubo centrífugo de 50 ml. Incubar a 37 °C con agitación a 250 rpm durante 30 min.</li>
	<li>Vórtice el tubo, deseche los sobrenadantes pasándolo a través de un tamiz estéril (diámetro: 0.01 pulgadas) y resuspenda los segmentos de colon en 20 ml de PBS prefrío en el tubo de 50 ml.</li>
	<li>Repita el paso 8.3 dos veces.</li>
	<li>Coloque los segmentos de colon en un tubo C (ver Tabla de Materiales) que contenga 10 ml de tampón de digestión precalentado.</li>
	<li>Coloque el tubo en una máquina disociadora (ver Tabla de Materiales) e incube bajo el programa de "37C_m_LPDK_1" durante 25 min. NOTA: "37C_m_LPDK_1" es un programa preestablecido estándar en la máquina disociadora utilizada para agitar las muestras y mantenerlas a 37 ° C.</li>
	<li>Compruebe si el tejido se digiere por completo, lo que significa que no hay ningún trozo de tejido en el tampón de digestión. Si no es así, repita el programa de "37C_m_LPDK_1".</li>
	<li>Recoge el sobrenadante pasando por un tamiz metálico y un colador de 100 μL. Enjuague con 10 ml de PBS prefrío.</li>
	<li>Centrifugar la suspensión celular a 350 x g durante 8 min a 4 °C. Aspirar a todos los sobrenadantes.</li>
	<li>Resuspend las células en 4 ml de solución de Percoll al 40% y mezclar bien (preparado en el paso 2.8).</li>
	<li>Transfiera las células resuspendidas a 2 ml de solución de Percoll al 75% en un tubo centrífugo de 15 ml.</li>
	<li>Centrifugar la suspensión celular a 850 x g durante 20 min a 20 °C (Rampa de aceleración: 0; Rampa de freno: 0).</li>
	<li>Retire cuidadosamente la grasa en la capa superior con una pipeta de transferencia de 3 ml y transfiera la capa celular a 20 ml de tampón de lavado en un tubo de 50 ml.</li>
	<li>Centrifugar la suspensión celular a 350 x g durante 8 min a 4 °C. Deseche todos los sobrenadantes y células resuspend en 1 mL de Medio Completado.</li>
	<li>Cuente las celdas siguiendo el paso 3.6.</li>
	<li>Sembrar las células en una placa de 24 pocillos, activarlas con 50 ng/mL de Phorbol-12-miristato 13-acetato y 750 ng/mL de ionomicina durante 2 h, seguido de incubación con 5 μg/mL de Brefeldina A durante 3 h (ver Tabla de Materiales). NOTA: Los reactivos utilizados son tóxicos, y su manejo necesita precauciones y medidas de seguridad.</li>
	<li>Transfiera las células a un tubo FACS, agregue 2 ml de tampón FACS y centrífuga las células a 350 x g durante 8 minutos a 4 °C. Deseche el sobrenadante.</li>
	<li>Incubar las células con 12,5 μg/mL de CD16/3219 anti-ratón en tampón FACS (ver Tabla de Materiales) para bloquear los receptores Fc durante 5 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Mancha para marcador vivo/muerto y de superficie.<ol>
<li>Lavar las células con 2 mL de TAMPÓN FACS y centrifugarlas a 350 x g durante 8 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante.</li>
		<li>Teñir las células con colorantes vivos y marcadores de superficie (es decir, anticuerpos CD3 anti-ratón y anti-ratón CD4)20 (ver Tabla de Materiales) en FACS Buffer a la concentración optimizada durante 30 min a 4 °C en la oscuridad. NOTA: Los reactivos utilizados son tóxicos, y su manejo necesita precauciones y medidas de seguridad.</li>
	</ol></li>
	<li>Realizar la tinción celular y nuclear.<ol>
<li>Añadir 2 mL de TAMPÓN FACS y centrifugar la suspensión celular a 350 x g durante 8 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante.</li>
		<li>Permeabilizar y fijar las células resuspiendo las células con 200 μL de solución de trabajo Transcription Factor Fix (ver Tabla de Materiales) durante 40 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Añadir 2 ml de tampón permanente y centrifugar la suspensión celular a 350 x g durante 8 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante.</li>
		<li>Incubar las células con marcadores celulares y nucleares (es decir, anticuerpos anti-ratón IFNγ, anti-ratón IL-17A y anti-ratón Foxp3)20 en tampón Perm (ver Tabla de Materiales) durante 30 min-1 h a temperatura ambiente.</li>
		<li>Añadir 2 ml de tampón permanente y centrifugar la suspensión celular a 350 x g durante 8 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante.</li>
		<li>Añadir 1 ml de tampón FACS y centrifugar la suspensión celular a 350 x g durante 8 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante.</li>
	</ol></li>
	<li>Resuspend las células con 200 μL de TAMPÓN FACS y ejecute las muestras en un citómetro de flujo (ver Tabla de Materiales).</li>
</ol>

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</ol>

Ningún autor tiene intereses financieros, profesionales o personales en conflicto.

Aunque cada paso es esencial para la reproducibilidad de este modelo de colitis, hay varios pasos críticos. Los ratones Rag-/- receptores deben recibir células T CD4+ naϊve viables adecuadas para inducir la inflamación intestinal. Utilizamos bazos para el aislamiento de células T CD4+ ingenuas en lugar de MLNs. Porque el rendimiento de las células T CD4+ ingenuas en las MLN es mucho menor que en los bazos. CD62L está altamente expresado en linfocitos T naïve, y CD44 y ...

Las enfermedades inflamatorias intestinales (EII), que incluyen principalmente la enfermedad de Crohn (EC) y la colitis ulcerosa (CU), se caracterizan por una inflamación crónica del tracto gastrointestinal recurrente-remitente, que afecta a millones de personas en todo el mundo1. Varios factores se han implicado en el desarrollo y la patogénesis de la EII, incluyendo la susceptibilidad genética, la microbiota intestinal, las respuestas inmunes, la dieta y el estilo de vida2. Sin embargo, el mecanismo exacto de la EII aún no se entiende completamente.
Uno de los intereses particulares es la interacción entre la microbiota intestinal y las respuestas inmunes del huésped en la regulación de la inflamación intestinal3. La microbiota intestinal proporciona una serie de moléculas y antígenos inmunoestimulantes, que pueden activar las respuestas inmunitarias4. Si bien el equilibrio entre las células T efectoras y las células T reguladoras (Tregs) es fundamental para mantener la homeostasis intestinal, la respuesta excesiva de las células T CD4+ de la mucosa intestinal a los antígenos de la microbiota intestinal contribuye a la inflamación intestinal5,6,7. Como antígeno inmunodominante de la microbiota intestinal, la flagelina CBir1 se ha relacionado con la patogénesis del CD8 humano,9. Además, la transferencia de células T transgénicas (Tg) CBir1 TCR induce inflamación intestinal en ratones inmunodeficientes6, muy parecida a la EII humana, lo que indica que este modelo de transferencia de células T ayuda a investigar los mecanismos de la EII humana.
Este trabajo describe el protocolo detallado de inducción de colitis en ratones Rag1-/- mediante transferencia adoptiva de células T CBir1 TCR Tg naϊve CD4+ y la evaluación de la gravedad de la enfermedad. Además, se muestran los resultados anticipados y se discuten los pasos críticos del procedimiento y la solución de problemas, lo que ayudará a los investigadores a investigar los mecanismos de patogénesis de la inflamación intestinal y probar los posibles medicamentos para tratar la EII.

<table><tbody><tr><td>0,22 y micro; m filtro de tapa de botella desechable al vacío</td><td>MilliporeSigma</td><td>SCGPS05RE</td><td></td></tr><tr><td>100x Penicilina-Estreptomicina</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>100-&micro; Filtro m</td><td>BD Biosciences</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta de transferencia de 3 mL</td><td>Fisherbrand</td><td>13-711-9CM</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ratón CD16/32</td><td>Biolegend</td><td>101302</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ratón CD25-Percp/Cy5.5</td><td>Biolegend</td><td>102030</td><td></td></tr><tr><td>Anti-ratón CD3-Percp/Cy5.5</td><td>Biolegend</td><td>100327</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ratón CD4 APC</td><td>Biolegend</td><td></td><td></td>100516</tr><tr><td>Partículas magnéticas anti-ratón CD4</td><td>BD Biosciences</td><td>551539</td><td></td></tr><tr><td>anti-ratón CD4-BV421</td><td>Biolegend</td><td>100544</td><td></td></tr><tr><td>anti-ratón CD62L-PE</td><td>Biolegend</td><td>104408</td><td></td></tr><tr><td>anti-ratón Foxp3-PE</td><td>ThermoFisher</td><td>12-5773-82</td><td></td></tr><tr><td>antiratón IFN&gamma;-FITC</td><td>Biolegend</td><td>505806</td><td></td></tr><tr><td>Anti-ratón IL-17A-PE/Cy7</td><td>Biolegend</td><td>506922</td><td></td></tr><tr><td>Contador de células automatizado</td><td>Bio-rad</td><td>TC20</td><td></td></tr><tr><td>Brefeldin A</td><td>BD Biosciences</td><td>555029</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP1600-1</td><td></td></tr><tr><td>C tubo</td><td>Miltenyi</td><td>130-093-237</td><td></td></tr><tr><td>Imán de separación celular</td><td>BD Biosciences</td><td>552311</td><td></td></tr><tr><td>colagenasa IV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5138</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>Máquina disociadora</td><td>Miltenyi</td><td>130-096-427</td><td></td></tr><tr><td>DNasa I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Corning</td><td>46-034-CI</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (0.5 m, PH 8.0)</td><td>Corning</td><td>46-034-CI</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>R& D Systems</td><td>S11550</td><td></td></tr><tr><td>Citómetro de flujo</td><td>BD Biosciences</td><td>LSD Fortessa</td> Lámpara de calor CoverShield BR40 Hematoxilina y eosina <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> (H&<td></td></tr><tr><td> E) Kit de tinción</td><td>Abcam</td><td>ab245880</td><td></td></tr><tr><td>Jeringas de insulina</td><td>BD Biosciences</td><td>329412</td><td></td></tr><tr><td>ionomicina</td><td>ThermoFisher</td><td>I24222</td><td></td></tr><tr><td>Kit de tinción de células muertas de infrarrojo cercano a infrarrojo vivo/muerto</td><td>ThermoFisher</td><td>L10119</td><td></td></tr><tr><td>MaxQ 6000 Agitadores apilables incubados/refrigerados</td><td>ThermoFisher</td><td>SHKE6000</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Thermo Scientific</td><td>A687-500</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>Forbol-12-miristato 13-acetato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8139</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medio</td><td>Cytiva HyCl</td><td>SH3002702</td><td></td>one</tr><tr><td>Clasificador</td><td>BD Biosciences</td><td>Arial Fusion</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Procesador automático</td><td>ThermoFisher</td><td>STP120</td><td></td></tr><tr><td>Casete de incrustación/procesamiento de tejidos</td><td>Fisher Healthcare</td><td>22048142</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Thermo Scientific</td><td>BP154-1</td><td></td></tr><tr><td>Juego de tampones de factor de transcripción nuclear verdadero (incluido el tampón permanente)</td><td>Biolegend</td><td>424401</td><td></td></tr></tbody></table>

inducción de la inflamación intestinal por transferencia adoptiva de células t cd4+ transgénicas cbir1 tcr a ratones inmunodeficientes

Induction of Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of CBir1 TCR Transgenic CD4+ T Cells to Immunodeficient Mice

Con el aumento de la incidencia, las enfermedades inflamatorias intestinales (EII), que son enfermedades crónicas que afectan el tracto gastrointestinal, imponen una carga financiera y de salud considerable a los individuos y la sociedad. Por lo tanto, es fundamental investigar los mecanismos subyacentes a la patogénesis y el desarrollo de la EII. Aquí, se describe un modelo de colitis por transferencia de células T específica del antígeno de la microbiota intestinal. La flagelina CBir1 ha sido reconocida como el antígeno bacteriano intestinal inmunodominante en la colitis experimental y en pacientes con enfermedad de Crohn. Las células T CD4+ transgénicas CBir1 TCRA T, específicas de la flagelina CBir1, pueden inducir colitis crónica después de la transferencia adoptiva a ratones Rag1-/- inmunodeficientes. La gravedad de la enfermedad se evalúa mediante histopatología. También se determinan los fenotipos de linfocitos T CD4+ en la lámina propia colónica. Este modelo se asemeja mucho al desarrollo de la EII, que proporciona un modelo murino ideal para investigar los mecanismos que impulsan la patogénesis de la EII y probar los medicamentos potenciales para tratar la EII.

Se aislaron aproximadamente 5 x 106 células T CBir1 TCR Tg naϊve CD4+ por bazo de un ratón adulto CBir1 TCR Tg. La transferencia de células T CBir1 TCR Tg naϊve CD4+ indujo colitis crónica en ratones Rag1-/- receptores. Después de la transferencia celular, se monitorearon los signos clínicos para evaluar la progresión de la inflamación intestinal, incluida la pérdida de peso, la consistencia de las heces y la postura encorvada. Como se esperaba, los ratones comenzaron ...

En este protocolo, se describe un modelo de colitis por transferencia adoptiva de células T específicas de antígeno de la microbiota intestinal. Las células T CD4+ se aíslan de ratones transgénicos CBir1 TCR. Estos son específicos para un antígeno inmunodominante de la microbiota intestinal CBir1 flagelina, que se transfiere a los ratones Rag1-/- receptores, lo que lleva a la inflamación intestinal.

Inducción de la inflamación intestinal por transferencia adoptiva de células T CD4+ transgénicas CBir1 TCR a ratones inmunodeficientes

With the increase of incidence, inflammatory bowel diseases (IBD), which are chronic diseases affecting the gastrointestinal tract, impose a considerable ...

La enfermedad inflamatoria intestinal, o EII, impone una carga financiera y de salud considerable a los individuos y a la sociedad. Este modelo de colitis es útil para estudiar los mecanismos de la EII y evaluar los tratamientos para la EII. Este modelo de colitis de transferencia adoptiva específico de células T de Cbir flagelina inmunodominante proporciona información sobre cómo el antígeno de las bacterias intestinales induce respuestas de células T para inducir colitis.Después de la eutanasia del ratón, haga una incisión abdominal izquierda de aproximadamente un centímetro y retire la piel del tejido muscular abdominal. Luego, haga una incisión de aproximadamente tres centímetros en el tejido muscular abdominal. A continuación, retire el bazo con tijeras y fórceps estériles.Coloque el bazo en un plato de cultivo que contenga cinco mililitros de tampón de lavado preenfriado. Moler el bazo con la superficie rugosa de dos portaobjetos de vidrio estériles. Transfiera la suspensión celular a un tubo centrífugo de 50 mililitros pasándola a través de un colador celular de 100 micrómetros.Enjuague los portaobjetos de vidrio y el plato de cultivo con cinco mililitros de tampón de lavado preenfriado y transfiera el tampón de lavado al tubo. Centrifugue la suspensión celular, deseche el sobrenadante y resuspenda las células con cinco mililitros de tampón de lisis de cloruro de amonio Tris precalentado por bazo. Incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente.Agregue 10 mililitros de tampón de lavado preenfriado al tubo. Luego, centrifugue la suspensión celular, deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células con 10 mililitros de tampón de aislamiento preenfriado. Para contar las células, mezcle 10 microlitros cada uno de suspensión celular y azul Trypan a fondo, y cargue 10 microlitros en un portaobjetos.Luego, inserte la diapositiva en el contador de celdas automatizado para obtener el número de celda viable. Centrifugar la suspensión celular restante y desechar todo sobrenadante. Vórtice las partículas magnéticas CD4 anti-ratón, agregue directamente 50 microlitros de las partículas por cada 10 millones de células y mezcle con gránulos celulares a fondo.Incubar la mezcla durante 30 minutos a cuatro grados centígrados. Transfiera la suspensión de partículas celulares a un tubo de recolección estéril. Agregue 3.5 mililitros de tampón de aislamiento preenfriado en el tubo.Coloque el tubo en el imán de separación celular durante ocho minutos a temperatura ambiente. Luego, aspire cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta de transferencia de tres mililitros. Retire el tubo del imán de separación celular.Luego, vuelva a suspender las celdas con 3,5 mililitros de tampón de aislamiento preenfriado y coloque el tubo en el imán durante cuatro minutos a temperatura ambiente. Aspire cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta de tres mililitros. Finalmente, resuspenda las células en un mililitro de tampón FACS preenfriado.Para transferir las células a los ratones receptores, resuspenda las células T CD4 positivas transgénicas sin génicos Cbir1 TCR a 5 millones de células por mililitro en 1x PBS. Caliente a los ratones bajo una lámpara de calor y sujete a los ratones usando un retenedor de ratón. Inyecte por vía intravenosa 200 microlitros de la suspensión celular en la vena de la cola de los ratones.Después de la eutanasia del ratón, haga una incisión en la línea media ventral de aproximadamente un centímetro en la piel. Retire la piel del tejido muscular abdominal. Luego, haga una incisión de tres centímetros en el tejido muscular abdominal.A continuación, identifique el coecum y retire todo el colon con tijeras y fórceps estériles. Humedezca el colon con PBS preenfriado en un plato de cultivo. Incite el colon a lo largo y enjuáguelo con PBS preenfriado.Corte 1/3 del colon longitudinalmente. Coloque la tira de colon en una toalla de papel con el lado lumenal hacia arriba. Realice el laminado suizo con un palillo de dientes.Coloque el colon suizo en un cassette y coloque el cassette en formalina tamponada al 10% durante 24 horas. Deshidratar e incrustar parafina el colon con un procesador automatizado. Luego, corte secciones de tejido de cinco micrómetros en un microtomo.Monte el tejido en portaobjetos y realice tinción de hematoxilina y eosina. Los ratones Knockout Rag comenzaron a perder peso alrededor de tres semanas después de la transferencia celular, y su peso alcanzó alrededor del 80 al 85% de su peso original seis semanas después de la transferencia celular. Los ratones receptores mostraron una longitud corta del colon seis semanas después de la transferencia celular.Los ratones receptores demostraron más infiltración celular en la lámina propia intestinal cuatro semanas después de la transferencia celular. Mostraron pérdida de células caliciformes e hiperplasia de células epiteliales intestinales cinco semanas después de la transferencia celular, así como erosión de la mucosa e infiltración de células inflamatorias en la submucosa del colon seis semanas después de la transferencia celular. Las puntuaciones histopatológicas aumentaron sustancialmente de cuatro a seis semanas.Simultáneamente, no hubo inflamación en ratones Knockout Rag que recibieron PBS solo. Usando este procedimiento, los niveles de citoquinas colónicas podrían determinarse mediante ELISA y qPCR.

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Investigación

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Medicine

Medicina

Generación de linfocitos T de madre pluripotentes inducidas (iPS) a las células da un enfoque alternativo de la utilización de células madre embrionarias para células T basada en la inmunoterapia. El método muestra que mediante la utilización de...

Diferenciación dirigida de células madre pluripotentes inducidas hacia los linfocitos T

Aquí, le detallamos una metodología para el aislamiento rápido de las células dendríticas de ratones intestinales (DCS) y los macrófagos. Caracterización fenotípica de los países en desarrollo y los macrófagos intestinales se realiza utilizando varios colores, mientras que el flujo de análisis de citometría de enriquecimiento de bolas magnéticas seguido por la selección de células se utiliza para producir poblaciones de alta pureza para los estudios funcionales.

Aislamiento y caracterización de las células dendríticas y los macrófagos del intestino delgado de ratón

Proporcionamos un método reproducible para inducir la diabetes tipo 1 (DM1) en ratones dentro de dos semanas por la transferencia adoptiva de células del islote T específicas de antígeno, células CD4 + primarias.

Tipo 1 Diabetes inducción acelerada en ratones por transferencia adoptiva de células CD4 + células T diabetogénico

Una N-butil-N-(4-hidroxibutil) nitrosamina inducida modelo de cáncer de vejiga fue desarrollado en mucina humana 1 (MUC1) ratones transgénicos para el propósito de las pruebas de MUC1-inmunoterapia dirigida. Después de la administración de una vacuna de péptido MUC1-específica, una respuesta de linfocitos T citotóxicos para MUC1 se confirmó mediante la medición de los niveles séricos de citocinas y la actividad de células T específicas.

La inducción de la transición de vejiga invasivo Carcinoma en inmune intacto humanos MUC1 Ratones Transgénicos: Un Modelo para el Desarrollo Inmunoterapia

Aquí, presentamos un protocolo para inducir inflamación colónica en ratones mediante la transferencia adoptiva de células Taltas CD4 + CD45RB singénicas a receptores deficientes de células T y B. Las características clínicas e histopatológicas imitan las enfermedades inflamatorias intestinales humanas. Este método permite estudiar el inicio de la inflamación colónica y la progresión de la enfermedad.

La inducción de la inflamación intestinal murino por transferencia adoptiva de Efector CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Alta</sup&gt; T células en ratones inmunodeficientes

En este modelo de colitis impulsada por antígenos, las células T CD4+ OT-II que expresan una proteína fluorescente roja se transfirieron adoptivamente a ratones RAG-/- que expresan una proteína fluorescente verde en fagocitos mononucleares (MP). Los huéspedes fueron desafiados con Escherichia coli (E. coli) que expresa la proteína ovoalbúmina (OVA) fusionada con una proteína cian fluorescente (CFP).

Desarrollo de un modelo de colitis impulsado por el antígeno para el Estudio de la presentación de antígenos por células presentadoras de antígenos a las células T

Aquí, presentamos un protocolo que describe el trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas y permite evaluaciones repetitivas mini-endoscópica del colon distal in situ para la presencia, características y severidad de inflamación colónica en vivo ratones de intestinal injerto - versus - host disease.

Inducción de Intestinal injerto - versus - host Disease y su evaluación Mini-endoscópica en ratones vivos

Describimos un modelo de inmunización in vivo, traslacional de hepatitis en ratones BALB / c que se puede utilizar para estudiar la patogénesis de la hepatitis autoinmune inducida por medicamentos, incluidas las diferencias de sexo observadas en esta enfermedad. Describiremos cómo este modelo demuestra análisis reproducibles utilizando técnicas experimentales in vivo e in vitro.

Inducción de hepatitis autoinmune inducida por fármacos en ratones BALB/c para el estudio de sus mecanismos patógenos

Aquí presentamos un protocolo para el aumento in vivo de la inducción de células T reguladoras intestinales. En este protocolo, las células dendríticas están diseñadas para producir localmente altas concentraciones de la vitamina D activa (1,25-dihidroxivitamina D o 1,25[OH]2D) y la vitamina A activa (ácido retinoico o RA) de novo.

En Vivo Aumento de la Inducción de Células T Regulatorias Gut-Homing

La interacción de la susceptibilidad genética, la inmunidad de la mucosa y el entorno microecológico intestinal está involucrada en la patogénesis de la enfermedad inflamatoria intestinal (EII). En este estudio, aplicamos el trasplante de microbiota fecal a ratones deficientes en IL-10 e investigamos su impacto en la inflamación del colon y la función cardíaca.

Evaluación terapéutica del trasplante de microbiota fecal en un modelo de ratón deficiente en interleucina 10

Aprende a inducir colitis mediante transferencia adoptiva de células T CD4+ transgénicas CBir1 TCR a ratones Rag1-/-. Este modelo permite estudiar los mecanismos de la enfermedad inflamatoria intestinal y evaluar terapias potenciales.

Inducción de la inflamación intestinal por transferencia adoptiva de células T CD4+ transgénicas CBir1 TCR a ratones inmunodeficientes (Video) | JoVE Journal

Inducción de la inflamación intestinal por transferencia adoptiva de células T CD4⁺ transgénicas CBir1 TCR a ratones inmunodeficientes

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