Inducción de la inflamación intestinal por transferencia adoptiva de células T CD4⁺ transgénicas CBir1 TCR a ratones inmunodeficientes

La enfermedad inflamatoria intestinal, o EII, impone una carga financiera y de salud considerable a los individuos y a la sociedad. Este modelo de colitis es útil para estudiar los mecanismos de la EII y evaluar los tratamientos para la EII. Este modelo de colitis de transferencia adoptiva específico de células T de Cbir flagelina inmunodominante proporciona información sobre cómo el antígeno de las bacterias intestinales induce respuestas de células T para inducir colitis.

Después de la eutanasia del ratón, haga una incisión abdominal izquierda de aproximadamente un centímetro y retire la piel del tejido muscular abdominal. Luego, haga una incisión de aproximadamente tres centímetros en el tejido muscular abdominal. A continuación, retire el bazo con tijeras y fórceps estériles.

Coloque el bazo en un plato de cultivo que contenga cinco mililitros de tampón de lavado preenfriado. Moler el bazo con la superficie rugosa de dos portaobjetos de vidrio estériles. Transfiera la suspensión celular a un tubo centrífugo de 50 mililitros pasándola a través de un colador celular de 100 micrómetros.

Enjuague los portaobjetos de vidrio y el plato de cultivo con cinco mililitros de tampón de lavado preenfriado y transfiera el tampón de lavado al tubo. Centrifugue la suspensión celular, deseche el sobrenadante y resuspenda las células con cinco mililitros de tampón de lisis de cloruro de amonio Tris precalentado por bazo. Incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente.

Agregue 10 mililitros de tampón de lavado preenfriado al tubo. Luego, centrifugue la suspensión celular, deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células con 10 mililitros de tampón de aislamiento preenfriado. Para contar las células, mezcle 10 microlitros cada uno de suspensión celular y azul Trypan a fondo, y cargue 10 microlitros en un portaobjetos.

Luego, inserte la diapositiva en el contador de celdas automatizado para obtener el número de celda viable. Centrifugar la suspensión celular restante y desechar todo sobrenadante. Vórtice las partículas magnéticas CD4 anti-ratón, agregue directamente 50 microlitros de las partículas por cada 10 millones de células y mezcle con gránulos celulares a fondo.

Incubar la mezcla durante 30 minutos a cuatro grados centígrados. Transfiera la suspensión de partículas celulares a un tubo de recolección estéril. Agregue 3.5 mililitros de tampón de aislamiento preenfriado en el tubo.

Coloque el tubo en el imán de separación celular durante ocho minutos a temperatura ambiente. Luego, aspire cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta de transferencia de tres mililitros. Retire el tubo del imán de separación celular.

Luego, vuelva a suspender las celdas con 3,5 mililitros de tampón de aislamiento preenfriado y coloque el tubo en el imán durante cuatro minutos a temperatura ambiente. Aspire cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta de tres mililitros. Finalmente, resuspenda las células en un mililitro de tampón FACS preenfriado.

Para transferir las células a los ratones receptores, resuspenda las células T CD4 positivas transgénicas sin génicos Cbir1 TCR a 5 millones de células por mililitro en 1x PBS. Caliente a los ratones bajo una lámpara de calor y sujete a los ratones usando un retenedor de ratón. Inyecte por vía intravenosa 200 microlitros de la suspensión celular en la vena de la cola de los ratones.

Después de la eutanasia del ratón, haga una incisión en la línea media ventral de aproximadamente un centímetro en la piel. Retire la piel del tejido muscular abdominal. Luego, haga una incisión de tres centímetros en el tejido muscular abdominal.

A continuación, identifique el coecum y retire todo el colon con tijeras y fórceps estériles. Humedezca el colon con PBS preenfriado en un plato de cultivo. Incite el colon a lo largo y enjuáguelo con PBS preenfriado.

Corte 1/3 del colon longitudinalmente. Coloque la tira de colon en una toalla de papel con el lado lumenal hacia arriba. Realice el laminado suizo con un palillo de dientes.

Coloque el colon suizo en un cassette y coloque el cassette en formalina tamponada al 10% durante 24 horas. Deshidratar e incrustar parafina el colon con un procesador automatizado. Luego, corte secciones de tejido de cinco micrómetros en un microtomo.

Monte el tejido en portaobjetos y realice tinción de hematoxilina y eosina. Los ratones Knockout Rag comenzaron a perder peso alrededor de tres semanas después de la transferencia celular, y su peso alcanzó alrededor del 80 al 85% de su peso original seis semanas después de la transferencia celular. Los ratones receptores mostraron una longitud corta del colon seis semanas después de la transferencia celular.

Los ratones receptores demostraron más infiltración celular en la lámina propia intestinal cuatro semanas después de la transferencia celular. Mostraron pérdida de células caliciformes e hiperplasia de células epiteliales intestinales cinco semanas después de la transferencia celular, así como erosión de la mucosa e infiltración de células inflamatorias en la submucosa del colon seis semanas después de la transferencia celular. Las puntuaciones histopatológicas aumentaron sustancialmente de cuatro a seis semanas.

Simultáneamente, no hubo inflamación en ratones Knockout Rag que recibieron PBS solo. Usando este procedimiento, los niveles de citoquinas colónicas podrían determinarse mediante ELISA y qPCR.