Acustoforesis microfluídica para la separación fluvial de bacterias gramnegativas utilizando perlas de afinidad aptámero
17 de octubre de 2022
Este documento describe la fabricación y operación de chips acústoforeticos microfluídicos utilizando la técnica de acustoforesis microfluídica y microperlas modificadas con aptámero que se pueden usar para el aislamiento rápido y eficiente de bacterias Gram-negativas de un medio.
Este protocolo describe nuestra tecnología de acustoforesis microfluídica que se puede utilizar para la separación rápida y eficiente de bacterias Gram-negativas de un medio utilizando microperlas modificadas con aptámero. Los sistemas de acustoforesis microfluídica permiten la separación de bacterias gramnegativas con un rendimiento razonable y aislamiento celular sin contacto. La acustoforesis microfluídica se puede optimizar para aislar bacterias de muestras médicas y ambientales.
Para comenzar, diseñe un chip de acustoforesis microfluídica que recolecte perlas de PS en la salida objetivo y descarte el resto después de inyectar una mezcla de muestra de PS en la entrada de muestra. Prepare un chip con las capas por encima y por debajo de la capa de silicio unidas al vidrio de borosilicato. Y una tercera capa de vidrio de borosilicato, usando anodización, agrega 1000 voltios y 400 grados centígrados.
Fije un PZT a la capa de vidrio de borosilicato a lo largo del canal microfluídico utilizando menos de 10 microlitros de adhesivo de cianoacrilato. Inocular las bacterias GN y GP en medio Luria-Bertani e incubarlo a 37 grados centígrados y 220 revoluciones por minuto durante 16 horas. Centrifugar las bacterias cultivadas a 9, 056 RCF durante un minuto a temperatura ambiente.
Luego lavar dos veces con 1X PBS buffer. Prepare las bacterias GN y GP seleccionadas para el análisis resuspendiéndolas en el tampón de unión. Vuelva a suspender la mezcla de microperlas recubierta de estreptavidina de 10 micrómetros antes de usarla.
Vortex la mezcla durante 20 segundos. Prepare el aptámero desnaturalizándolo a 95 grados centígrados durante tres minutos, y luego volviéndolo a doblar a cero grados centígrados durante dos minutos. Transfiera 250 microlitros de la mezcla de microperlas recubierta de estreptavidina resuspendida a un tubo de 1.5 mililitros y agregue 100 microlitros de aptámero de ADN biotinilado al tubo.
Incubar la mezcla a temperatura ambiente durante 30 minutos mientras gira a 25 revoluciones por minuto. Centrifugar la mezcla de reacción a 9, 056 RCF durante 40 segundos a temperatura ambiente. Luego lave el tubo dos veces con 200 microlitros de tampón Tris-HCl.
Agregue 10 microlitros de 100 miligramos por mililitro BSA al tubo de muestra lavado e incube durante 30 minutos a temperatura ambiente mientras gira a 25 revoluciones por minuto. Finalmente, lave las microperlas modificadas con aptámero dos veces en tampón Tris-HCl por centrifugación a 9, 056 RCF durante 40 segundos a temperatura ambiente. Conecte los tubos de PEEK a las dos entradas para inyectar dos muestras y tampón, y las dos salidas para recoger y descargar los residuos.
Con una jeringa de 10 mililitros, llene el canal de acustoforesis microfluídica con agua desmineralizada sin burbujas. Prepare un controlador de presión de precisión con dos o más canales de salida para controlar el flujo de fluido. Después de preparar el dispositivo, inyecte la muestra y el tampón aplicando una presión de dos kilopascales a la entrada de la muestra y cuatro kilopascales a la entrada del tampón utilizando el dispositivo de control de presión de precisión.
Usando un microscopio, enfóquese en una cuenta y muévala al centro del canal microfluídico usando el PZT. Genere una frecuencia de resonancia de 3,66 megahercios utilizando un generador de funciones de un solo canal y amplifique una señal típica en 16 decibelios utilizando un amplificador de potencia. Observe los procesos de separación y enriquecimiento en el chip acustofluídico con un microscopio de fluorescencia y una cámara de alta velocidad que funciona a 1.200 fotogramas por segundo.
El chip acústoforético introducido en este estudio confirmó que, a medida que aumentaba el voltaje del PZT, aumentaba la concentración central de las perlas de 10 micrómetros. A cinco voltios del voltaje PZT, la mayoría de las perlas de 10 micrómetros se concentraron en el centro. La relación entre el número de perlas recogidas en la salida y el número total de perlas inyectadas de 10 micrómetros se denominó tasa de recuperación.
La relación entre el número de cuentas de 10 micrómetros y el número total de cuentas recolectadas se denominó pureza. Los resultados indicaron que el dispositivo tenía una alta eficiencia de separación para perlas con un tamaño de 10 micrómetros. El número de bacterias GN y GP unidas a cada microperla modificada con aptámero se midió utilizando un microscopio con una cámara de alta velocidad.
Las cinco bacterias GN se unieron a las perlas, mientras que significativamente menos bacterias GP se unieron a las sustancias probadas. La intensidad de la señal difirió significativamente entre las bacterias GN y GP. El adhesivo utilizado para fijar el PZT debe usarse lo menos posible para la precisión de la corrugación y el PZT y el microcanal deben ser paralelos.
Este dispositivo se puede utilizar para detectar bacterias vivas o biomarcadores derivados de bacterias en el período de diagnóstico temprano de enfermedades infecciosas bacterianas.
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Resumen
Este estudio presenta una tecnología de acouforesis microfluídica para la separación rápida y eficiente de bacterias Gram-negativas a partir de diversos medios. El método utiliza microesferas modificadas con aptámeros para mejorar el proceso de aislamiento, permitiendo la separación de células sin contacto y con un rendimiento razonable.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Microfluídica
- Acustoforesis
- Microbiología
Antecedentes
- Los sistemas microfluídicos permiten la manipulación precisa de fluidos a escala microscópica.
- La acustoforesis es una técnica que utiliza ondas acústicas para la manipulación de partículas.
- Las bacterias gramnegativas representan desafíos significativos en su aislamiento debido a sus propiedades estructurales.
- Los aptámeros son oligonucleótidos cortos y de cadena sencilla que pueden unirse selectivamente a objetivos específicos.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un chip microfluídico de acustoforesis para la separación eficiente de bacterias.
- Optimizar el proceso de aislamiento tanto para muestras médicas como ambientales.
- Mostrar la eficacia de las microesferas modificadas con aptámeros para mejorar la eficiencia de separación.
Métodos Utilizados
- Diseñar un chip microfluídico de acustoforesis.
- Unir capas de silicio y vidrio borosilicatado para la fabricación del chip.
- Inyectar una mezcla de muestra de PS en el chip para su separación.
- Aplicar anodización con condiciones específicas de voltaje y temperatura.
Resultados Principales
- El sistema de acustoforesis microfluídica aisló con éxito bacterias Gram-negativas.
- Se logró una separación de alto rendimiento y sin contacto.
- Las microesferas modificadas con aptámeros mejoraron significativamente la eficiencia de aislamiento.
- El método es aplicable tanto a muestras médicas como ambientales.
Conclusiones
- La acouforesis microfluídica es una técnica prometedora para el aislamiento de bacterias.
- Las modificaciones de aptámeros mejoran la selectividad y eficiencia del proceso.
- Esta tecnología podría ser beneficiosa para diversas aplicaciones en microbiología.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este método de acoufóresis microfluídica permite el aislamiento rápido y de alta pureza de bacterias Gram-negativas a partir de matrices complejas, abordando un cuello de botella crítico en el diagnóstico temprano de enfermedades infecciosas y en el monitoreo ambiental. Al combinar la separación acústica sin marcadores con especificidad basada en aptámeros, la tecnología apoya la reducción de riesgos en dianas durante los flujos de trabajo de descubrimiento de antimicrobianos y validación de biomarcadores. La recuperación demostrada de >98% y pureza de 97,8% con una concentración de 10x proporciona una alternativa escalable y sin contacto a la centrifugación o filtración para la preparación de muestras en etapas preclínicas.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la validación funcional de dianas bacterianas Gram-negativas mediante el aislamiento de patógenos viables a partir de muestras biológicas o ambientales heterogéneas.
- Valor operativo: Reduce el tiempo de procesamiento de muestras y minimiza el daño biomolecular en comparación con técnicas tradicionales de separación.
- Valor predictivo: Facilita la reducción del riesgo mecanicista al proporcionar fracciones bacterianas purificadas para estudios de interacción con la diana y del mecanismo de acción.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Genera inóculos bacterianos purificados para ensayos de cribado fenotípico, reduciendo los falsos positivos derivados de especies Gram-positivas contaminantes.
- Valor operativo: Estandariza la preparación de muestras mediante enfoque acustoforético reproducible y captura mediada por aptámeros.
- Escalabilidad: El diseño de canal bifurcado permite el procesamiento, purificación y concentración simultáneos, logrando un mayor rendimiento en cascadas de cribado.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Continuidad Translacional: Conecta las etapas de descubrimiento y preclínica al permitir el aislamiento consistente de bacterias Gram-negativas a partir de matrices similares a las clínicas, como sangre o orina.
- Alineación de Biomarcadores: Facilita la detección de bacterias viables o biomarcadores derivados en aplicaciones de diagnóstico temprano, apoyando el desarrollo traslacional de biomarcadores.
- Avance con Ajuste de Riesgo: Métricas elevadas de recuperación y pureza aumentan la confianza en los ensayos posteriores utilizados para la evaluación de compuestos líderes.
Integración de la Línea de Producción y Flujo de Trabajo
El método se enmarca dentro del continuo desde el descubrimiento temprano hasta la etapa preclínica, apoyando específicamente la preparación de muestras para la validación de dianas, la preparación de ensayos y estudios mecanicistas en los que la pureza bacteriana de Gram negativo es crítica.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis mediante el aislamiento de cepas específicas de bacterias Gram-negativas a partir de cultivos mixtos o muestras ambientales para reducir riesgos en objetivos específicos.
- Tamizaje: Permite obtener poblaciones bacterianas listas para ensayos con mínima retención de componentes interferentes, mejorando la fidelidad del tamizaje.
- Análisis: Proporciona resultados cuantitativos mediante microscopía de fluorescencia e imágenes de alta velocidad, lo que permite comparar las proporciones de unión entre perlas y bacterias, así como la intensidad de la señal.
- Investigación Traducional: Se integra a flujos de trabajo preclínicos al permitir el aislamiento a partir de muestras médicamente relevantes, apoyando la continuidad en el desarrollo de modelos de enfermedades infecciosas.
- Reutilización Empresarial: El diseño basado en chips y la fluidica controlada por presión permiten la estandarización entre laboratorios y la adaptación a diversos tipos de muestras sin necesidad de rediseño.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza en la validación del objetivo al reducir la ambigüedad mecanicista derivada de las impurezas de la muestra.
- Valor operativo: Garantiza la reproducibilidad mediante el control preciso de las fuerzas acústicas y la preparación estandarizada de los aptámeros con perlas.
- Valor estratégico: Mejora la fiabilidad de las decisiones de avance o interrupción en programas antimicrobianos al proporcionar entradas biológicas de alta fidelidad.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de candidatos basada en datos mecanicistas más limpios obtenidos de fracciones bacterianas purificadas.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en diseño de microfluidos, optimización de parámetros acustoforéticos y protocolos de conjugación de aptámeros con perlas.
- Depende de transductores piezoeléctricos, generadores de función, amplificadores de potencia y microscopía de fluorescencia con capacidad de imagen de alta velocidad.
- Necesita la estandarización de condiciones de tampón, tasas de flujo (2 kPa muestra, 4 kPa tampón) y calibración de voltaje del PZT entre diferentes usuarios.
- La adaptación a diferentes especies bacterianas o matrices de muestra puede requerir una reoptimización de la selección de aptámeros y de la frecuencia de resonancia acústica.
- Las limitaciones prácticas incluyen la corrugación del canal inducida por adhesivos si se usa exceso de cianoacrilato, lo que afecta la uniformidad del campo acústico.
Preguntas frecuentes sobre biofarmacia
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:45
Microuidic Acoustophoresis Chip Design and Fabrication
1:23
Bacterial Strains and Culture
1:56
Microbeads and Immobilization of Aptamer onto Microbeads
3:10
Acoustophoresis Setup and Operation
4:19
Results: Using Microfluidics to Capture GN Bacteria from Culture Samples at High Speed
5:26
Conclusion
