Uso de microscopía de 2 fotones para cuantificar los efectos de la obstrucción ureteral unilateral crónica en los procesos glomerulares

En los datos presentados en este estudio muestran los efectos dramáticos de la obstrucción ureteral unilateral sobre la función renal, la inflamación y la fibrosis. Nos ayuda a comprender los mecanismos fisiopatológicos de la obstrucción ureteral unilateral. La principal ventaja de esta técnica es la capacidad de estudiar las interacciones célula-célula, los eventos subcelulares y asociar la estructura y la función de una manera dinámica dentro de un riñón funcional.

Silvia Campos-Bilderback, quien es cirujana en nuestro laboratorio. Para comenzar, anestesia a la rata, luego haga una incisión a lo largo de la línea media y localice el riñón izquierdo para separarlo de los órganos peritoneales circundantes. Después de localizar el pedículo renal, que comprende la arteria renal, la vena renal y el uréter, separe el uréter sin dañar la delicada estructura.

Use fórceps para enrollar y atar una sutura 3-0 alrededor del uréter, luego ate un nudo unos pocos milímetros a cada lado del primer nudo para asegurar una obstrucción completa. Una vez que el uréter esté atado, cierre con cuidado las capas musculares sucesivas, luego cierre el abdomen por completo. Cierre la piel externa con grapas quirúrgicas.

Para la preparación quirúrgica, coloque la rata anestesiada con una línea de acceso venoso permanente en el lado con el flanco izquierdo afeitado hacia arriba plano y recto sobre la mesa. Asegúrese de que las patas delanteras de la rata se toquen entre sí como deberían hacerlo las patas traseras. Una vez que la rata esté posicionada, palpe el flanco izquierdo justo debajo de las costillas para sentir el riñón y determinar la posición natural en el abdomen, luego dibuje una línea usando un marcador permanente a lo largo del área afeitada, dividiendo el centro del riñón en una orientación de nariz a cola.

Use un par de pinzas dentadas para agarrar y levantar la piel hacia arriba y pellizque la línea marcador permanente con un par de hemostáticos para aplastar la vasculatura subyacente y prevenir el sangrado. Repita el procedimiento para la capa delgada del músculo externo para minimizar el sangrado. Para hacer la incisión final de la capa delgada del músculo abdominal interno, palpar el riñón para estimar el tamaño y la posición y levantar la capa muscular interna con un par de fórceps, luego aplastar una línea que divide la piel por encima del riñón con los hemostáticos que es aproximadamente 1/3 del tamaño estimado del riñón.

Mientras mantiene el agarre de la capa muscular con los fórceps, haga la incisión final. Luego, use fórceps en cada mano para agarrar y sostener la grasa renal en el polo inferior del riñón con una técnica de mano sobre mano que trabaja hacia abajo. Teniendo un agarre firme sobre la grasa con una mano, tire de la grasa y apriete muy suavemente el riñón a través de la incisión.

Si el riñón no pasa a través, ensanche fácilmente la incisión. Para identificar los glóbulos blancos o glóbulos blancos alojados en los asas capilares, administre la tinción nuclear Hoechst 33342 a 8 microgramos por kilogramo de peso de rata a través de una línea de acceso venoso permanente. En el microscopio, coloque el riñón expuesto contra el borde del plato con una ligera rotación para que el lado abdominal del riñón entre en contacto con el cubreobjetos y el lado dorsal quede mirando hacia el borde.

Para minimizar aún más el movimiento, empaque dos almohadillas de gasa estériles de 2 por 2 humedecidas con solución salina contra el lado dorsal del riñón reforzando el contacto del lado abdominal del riñón con el borde. Cuando la muestra esté colocada, mire a través del ocular del microscopio bajo iluminación de epifluorescencia usando un cubo FITC de rodamina de doble paso. Si se detecta un movimiento en la posición de la muestra, haga ajustes menores ajustando la gasa asegurándose de que no empuje debajo del riñón.

Haga rodar la rata ligeramente para que el tórax esté más lejos del plato. Escanee la superficie del riñón usando iluminación de epifluorescencia y marque las posiciones de los glomérulos usando el software asociado con el controlador de etapa motorizado. Para cada canal de color bajo iluminación de 2 fotones, tome un volumen 3D superficial de la parte superior de cada glomérulo marcado para que sirva como imagen de fondo.

En la opción de visualización del software de imágenes, utilice una pseudopaleta de colores para visualizar las débiles intensidades de la fluorescencia de fondo de los bucles capilares glomerulares. Usando un vaso sanguíneo superficial como punto focal, infunda lentamente la albúmina sérica fluorescente Texas Red RAP o TRRSA mientras observa el aumento y la disminución de la fluorescencia debido a la distribución sistémica hasta que una intensidad en la vasculatura peritubular y los asas capilares está justo por debajo de la saturación. Después de 10 minutos, adquiera volúmenes 3D para todos los glomérulos marcados y fotografiados a intervalos de 1 micrómetro.

Encuentre un recipiente apropiado, ya sea un bucle capilar o un vaso peritubular, luego gire la imagen utilizando la función Rotar, ya que la función Line Scan en el software de adquisición de imágenes requiere que el recipiente sea perpendicular. Una vez que el recipiente esté girado y acostado, seleccione la función XT en el menú Adquisición y configúrela para escanear 4, 000 líneas. Coloque la línea a través del recipiente a examinar con el plano focal en el diámetro máximo del segmento.

A continuación, haga clic izquierdo en la imagen compuesta en color y seleccione la pestaña Tomar instantánea para generar una imagen de referencia del área donde se realizó el escaneo de línea. Haga clic inmediatamente en el botón Inicio para capturar el escaneo de línea del buque. Más tarde, importe los escaneos de línea en el software de procesamiento de imágenes para determinar el caudal RBC.

En el menú desplegable Medir, abra el cuadro de diálogo Mostrar estadísticas de región y seleccione la herramienta Dibujo de una sola línea para dibujar una línea que coincida con la pendiente de las sombras RBC. Después de anotar el ancho y la altura de la línea, use una ecuación para calcular la velocidad, luego obtenga un promedio de cinco cálculos para informar la velocidad para cada escaneo de línea. Centrar un glomérulo en el campo de imágenes y tomar un conjunto de datos 3D comenzando en la superficie glomerular y terminando en 30 a 35 micrómetros.

Utilice un tamaño de paso de 1 micrómetro en la dirección Z. Identifique los glóbulos blancos comparando el canal azul de Hoechst con el canal de albúmina rojo de Texas buscando la exclusión del tinte rojo en el asa capilar y una tinción nuclear correspondiente. Si los glóbulos blancos aparecen estáticos en tres secciones ópticas, defina las celdas como adheredas, luego informe los valores como ocurrencia por 10 secciones ópticas desde la parte superior del glomérulo tomadas a intervalos de 1 micrómetro.

El número de glomerulares por campo en ratas Munich Wistar Fromter o MWF aumentó en el grupo UUO de 5 semanas que en ratas no tratadas. Las ratas Sprague-Dawley, o ratas SD, pasaron de no tener glomérulos superficiales a 2,02 por campo después de cinco semanas de obstrucción ureteral unilateral. Se observaron imágenes tridimensionales reconstruidas para ver la superficie renal.

La obstrucción uretal unilateral de 5 semanas en las ratas SD no dio lugar a áreas parecidas al epitelio tubular normal como se ve en el MWF, sin tratamiento, y parcialmente en ratas UUO MWF de 5 semanas. En el estudio de la dinámica vascular renal, el flujo sanguíneo renal se redujo significativamente en los grupos UUO MWF de 5 semanas y SD en comparación con las ratas no tratadas. La velocidad de RBC dentro de los bucles capilares glomerulares disminuyó significativamente en las ratas UUO MWF y SD de 5 semanas en comparación con las ratas MWF no tratadas.

Además, las ratas MWF no tratadas tenían menos glóbulos blancos por cada 10 secciones ópticas desde la parte superior, mientras que el número aumentó en las ratas UUO MWF de 5 semanas y UUO SD de 5 semanas. Con la obstrucción uretal unilateral, se observó un aumento en la permeabilidad a la albúmina. Una acumulación de albúmina dentro del espacio de Bowman fue intensa después de la obstrucción uretal unilateral.

La endocitosis del segmento S1 de grandes cantidades de albúmina como se observa con condiciones fisiológicas en ratas MWF no tratadas. La misma captación no se pudo ver en las ratas MWF o SD después de 5 semanas de obstrucción uretal unilateral. Muchos métodos diferentes, como la repetición de imágenes para estudiar un proceso a lo largo del tiempo, la fijación de un área específica para obtener imágenes y la posterior utilización del tejido fijo para llevar a cabo una microscopía de mayor resolución se pueden realizar junto con esta técnica.

La técnica se considera tecnología disruptiva. Se permite a los investigadores responder a muchas preguntas nuevas. Al hacerlo, se han proporcionado nuevos conocimientos y se han obtenido datos de cambio de paradigma.