Name: Uso de microscopía de 2 fotones para cuantificar los efectos de la obstrucción ureteral unilateral crónica en los procesos glomerulares (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-04T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 47 s
Description: Aprende a utilizar microscopía de 2 fotones para cuantificar los efectos de la obstrucción ureteral unilateral crónica en la función glomerular de ratas Munich Wistar Fromter. Esta técnica permite observar dinámicas celulares en tiempo real.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Diabetes y Enfermedades Digestivas y Renales Subvenciones RO1DK091623 y P30DK079312 (a B.A.M.). Agradecemos al personal de la Instalación Central de Genómica de la Instalación de Apoyo a la Tecnología de Investigación (RTSF) de la Universidad Estatal de Michigan por realizar el análisis de Nanostring.

<ol><li>Dunn, K. W., Molitoris, B. A., Dagher, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Indiana+O%27Brien+center+for+advanced+renal+microscopic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">The Indiana O'Brien center for advanced renal microscopic analysis.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 320 (5), 671-682 (2021).</li>
<li>Dunn, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+studies+of+the+kidney+of+living+animals+using+multicolor+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Functional studies of the kidney of living animals using multicolor two-photon microscopy.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 283 (3), 905-916 (2002).</li>
<li>Eisenbach, G., Liew, J., Boylan, J., Manz, N., Muir, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+angiotensin+on+the+filtration+of+protein+in+the+rat+kidney%3A+a+micropuncture+study%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Effect of angiotensin on the filtration of protein in the rat kidney: a micropuncture study.</a> Kidney International. 8 (2), 80-87 (1975).</li>
<li>Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+multiphoton+microscopy+as+a+tool+for+studying+renal+physiology+and+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Intravital multiphoton microscopy as a tool for studying renal physiology and pathophysiology.</a> Methods. 128, 20-32 (2017).</li>
<li>Sandoval, R. M., Molitoris, B. A., Palygin, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+imaging+and+microscopy+for+dynamic+processes+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Fluorescent imaging and microscopy for dynamic processes in rats.</a> Methods in Molecular Biology. 2018, 151-175 (2019).</li>
<li>Huber, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+of+the+functional+podocin-nephrin+complex%3A+mutations+in+the+NPHS2+gene+disrupt+nephrin+targeting+to+lipid+raft+microdomains%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Molecular basis of the functional podocin-nephrin complex: mutations in the NPHS2 gene disrupt nephrin targeting to lipid raft microdomains.</a> Human Molecular Genetics. 12 (24), 3397-3405 (2003).</li>
<li>Kawachi, H., Koike, H., Kurihara, H., Sakai, T., Shimizu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+of+rat+homologue+of+podocin%3A+expression+in+proteinuric+states+and+in+developing+glomeruli%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology+JASN%22%5BJournal%5D)">Cloning of rat homologue of podocin: expression in proteinuric states and in developing glomeruli.</a> Journal of the American Society of Nephrology JASN. 14 (1), 46-56 (2003).</li>
<li>Roselli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+glomerular+filtration+defect+and+severe+renal+disease+in+podocin-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Early glomerular filtration defect and severe renal disease in podocin-deficient mice.</a> Molecular and Cellular Biology. 24 (2), 550-560 (2004).</li>
<li>Schießl, I., Bardehle, S., Castrop, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superficial+nephrons+in+BALB%2Fc+and+C57BL%2F6+mice+facilitate+in+vivo+multiphoton+microscopy+of+the+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Superficial nephrons in BALB/c and C57BL/6 mice facilitate in vivo multiphoton microscopy of the kidney.</a> PloS One. 8 (1), 52499(2013).</li>
<li>Chevalier, R., Forbes, M., Thornhill, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ureteral+obstruction+as+a+model+of+renal+interstitial+fibrosis+and+obstructive+nephropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Ureteral obstruction as a model of renal interstitial fibrosis and obstructive nephropathy.</a> Kidney International. 75 (11), 1145-1152 (2009).</li>
<li>Forbes, M., Thornhill, B., Chevalier, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proximal+tubular+injury+and+rapid+formation+of+atubular+glomeruli+in+mice+with+unilateral+ureteral+obstruction%3A+a+new+look+at+an+old+model%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Renal+physiology%22%5BJournal%5D)">Proximal tubular injury and rapid formation of atubular glomeruli in mice with unilateral ureteral obstruction: a new look at an old model.</a> American Journal of Physiology. Renal physiology. 301 (1), 110-117 (2011).</li>
<li>Yang, H. -C., Zuo, Y., Fogo, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+of+chronic+kidney+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today.+Disease+Models%22%5BJournal%5D)">Models of chronic kidney disease.</a> Drug Discovery Today. Disease Models. 7 (1-2), 13-19 (2010).</li>
<li>Hackl, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+the+fate+of+glomerular+epithelial+cells+in+vivo+using+serial+multiphoton+imaging+in+new+mouse+models+with+fluorescent+lineage+tags%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Tracking the fate of glomerular epithelial cells in vivo using serial multiphoton imaging in new mouse models with fluorescent lineage tags.</a> Nature Medicine. 19 (12), 1661-1666 (2013).</li>
<li>Kitching, A., Kuligowski, M., Hickey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+leukocyte+recruitment+to+glomeruli+in+mice+using+intravital+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of leukocyte recruitment to glomeruli in mice using intravital microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 466, 109-117 (2009).</li>
<li>Savin, V. J., Terreros, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filtration+in+single+isolated+mammalian+glomeruli%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Filtration in single isolated mammalian glomeruli.</a> Kidney International. 20 (2), 188-197 (1981).</li>
<li>Chomczynski, P., Sacchi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+single-step+method+of+RNA+isolation+by+acid+guanidinium+thiocyanate-phenol-chloroform+extraction%3A+twenty-something+years+on%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twenty-something years on.</a> Nature Protocols. 1 (2), 581-585 (2006).</li>
<li>El Karoui, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoplasmic+reticulum+stress+drives+proteinuria-induced+kidney+lesions+via+Lipocalin+2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Endoplasmic reticulum stress drives proteinuria-induced kidney lesions via Lipocalin 2.</a> Nature Communications. 7, 10330(2016).</li>
<li>VA, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+measurements+of+gene+signatures+in+different+analytes+using+the+Nanostring+nCounter+Assay+System%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Research+Notes%22%5BJournal%5D)">Multiplexed measurements of gene signatures in different analytes using the Nanostring nCounter Assay System.</a> BMC Research Notes. 2, 80(2009).</li>
<li>Springer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+combined+transcriptome+and+bioinformatics+approach+to+unilateral+ureteral+obstructive+uropathy+in+the+fetal+sheep+model%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Urology%22%5BJournal%5D)">A combined transcriptome and bioinformatics approach to unilateral ureteral obstructive uropathy in the fetal sheep model.</a> The Journal of Urology. 187 (2), 751-756 (2012).</li>
<li>Braun, F., Becker, J., Brinkkoetter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+or+let+die%3A+Is+there+any+cell+death+in+podocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Live or let die: Is there any cell death in podocytes.</a> Seminars in Nephrology. 36 (3), 208-219 (2016).</li>
<li>Kim, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+angiopoietin-1+in+kidney+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Electrolyte+%26+Blood+Pressure+E+%26+BP%22%5BJournal%5D)">The role of angiopoietin-1 in kidney disease.</a> Electrolyte & Blood Pressure E & BP. 6 (1), 22-26 (2008).</li>
<li>Liu, F., Zhuang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+receptor+tyrosine+kinase+signaling+in+renal+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Role of receptor tyrosine kinase signaling in renal fibrosis.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (5), 972(2016).</li>
<li>Martini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+biology+identifies+shared+transcriptional+networks+in+CKD%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%3A+JASN%22%5BJournal%5D)">Integrative biology identifies shared transcriptional networks in CKD.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 25 (11), 2559-2572 (2014).</li>
<li>Mühlberger, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+bioinformatics+analysis+of+proteins+associated+with+the+cardiorenal+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Integrative bioinformatics analysis of proteins associated with the cardiorenal syndrome.</a> International Journal of Nephrology. 2011, 809378(2010).</li>
<li>Satirapoj, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Periostin%3A+novel+tissue+and+urinary+biomarker+of+progressive+renal+injury+induces+a+coordinated+mesenchymal+phenotype+in+tubular+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nephrology%2C+Dialysis%2C+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Periostin: novel tissue and urinary biomarker of progressive renal injury induces a coordinated mesenchymal phenotype in tubular cells.</a> Nephrology, Dialysis, Transplantation. 27 (7), 2702-2711 (2012).</li>
<li>Fengxin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Numb+contributes+to+renal+fibrosis+by+promoting+tubular+epithelial+cell+cycle+arrest+at+G2%2FM%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Numb contributes to renal fibrosis by promoting tubular epithelial cell cycle arrest at G2/M.</a> Oncotarget. 7 (18), 25604-25619 (2016).</li>
<li>Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+glomerular+permeability+of+fluorescent+macromolecules+using+2-photon+microscopy+in+Munich+Wistar+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Quantifying glomerular permeability of fluorescent macromolecules using 2-photon microscopy in Munich Wistar rats.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (74), e50052(2013).</li>
<li>Russo, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+tubular+uptake+explains+albuminuria+in+early+diabetic+nephropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%3A+JASN%22%5BJournal%5D)">Impaired tubular uptake explains albuminuria in early diabetic nephropathy.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 20 (3), 489-494 (2009).</li>
<li>Russo, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+normal+kidney+filters+nephrotic+levels+of+albumin+retrieved+by+proximal+tubule+cells%3A+retrieval+is+disrupted+in+nephrotic+states%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">The normal kidney filters nephrotic levels of albumin retrieved by proximal tubule cells: retrieval is disrupted in nephrotic states.</a> Kidney International. 71 (6), 504-513 (2007).</li>
<li>Sandoval, R. M., Wang, E., Molitoris, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Finding+the+bottom+and+using+it%3A+Offsets+and+sensitivity+in+the+detection+of+low+intensity+values+in+vivo+with+2-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Intravital%22%5BJournal%5D)">Finding the bottom and using it: Offsets and sensitivity in the detection of low intensity values in vivo with 2-photon microscopy.</a> Intravital. 2 (1), 23674(2014).</li>
<li>Kuligowski, M. P., Kitching, A. R., Hickey, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+recruitment+to+the+inflamed+glomerulus%3A+a+critical+role+for+platelet-derived+P-selectin+in+the+absence+of+rolling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Leukocyte recruitment to the inflamed glomerulus: a critical role for platelet-derived P-selectin in the absence of rolling.</a> Journal of Immunology. 176 (11), 6991-6999 (2006).</li>
<li>Devi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiphoton+imaging+reveals+a+new+leukocyte+recruitment+paradigm+in+the+glomerulus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Multiphoton imaging reveals a new leukocyte recruitment paradigm in the glomerulus.</a> Nature Medicine. 19 (1), 107-112 (2013).</li>
<li>Finsterbusch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patrolling+monocytes+promote+intravascular+neutrophil+activation+and+glomerular+injury+in+the+acutely+inflamed+glomerulus%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Patrolling monocytes promote intravascular neutrophil activation and glomerular injury in the acutely inflamed glomerulus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (35), 5172-5181 (2016).</li>
<li>Shroff, U. N., Gyarmati, G., Izuhara, A., Deepak, S., Peti-Peterdi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+view+of+macula+densa+cell+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">A new view of macula densa cell protein synthesis.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 321 (6), 689-704 (2021).</li>
</ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses.

El estudio de la fisiología glomerular ha visto muchos enfoques diferentes, especialmente el uso de micropunción, perfusión de glomérulos aislados y microscopía. La disponibilidad de glomérulos superficiales en ratas Wistar de Múnich, cepas Fromter y Simonsen, ha permitido estudios dinámicos in vivo . Una nota importante para los investigadores que adoptan esta tecnología es la necesidad de establecer parámetros de adquisición para mantener imágenes consistentes entre los estudios, de modo que la autofluorescencia en el tejido permanezca constante. Utilizar un cubo de epifluorescencia de fluoresceína/rodamina de doble paso y ajustar la configuración de ganancia a los canales de emisión verde y rojo para imitar en la pantalla de la computadora lo que se ve a través de los oculares asegurará una firma de color consistente en la autofluorescencia incluso entre diferentes sistemas de microscopio.
La cepa de Fromter ha sido ampliamente utilizada ya que tiene un número reducido de glomérulos totales, ~75% normal, y los varones desarrollan espontáneamente hipertensión alrededor de las 12 semanas de edad, con proteinuria progresiva y posterior esclerosis glomerular focal, muriendo finalmente de insuficiencia renal12. El uso de estas ratas y la adición de microscopía de 2 fotones con su fototoxicidad reducida, profundidad de penetración mejorada y la capacidad de ver múltiples sondas fluorescentes simultáneamente allanaron el camino para nuevos descubrimientos 1,4,5. Con el desarrollo de hardware y software informático, los datos cuantitativos son ahora el estándar para todos los laboratorios de 2 fotones. Se han desarrollado múltiples técnicas cuantitativas y aplicadas a procesos glomerulares, tubulales proximales, vasculares e intersticiales en condiciones fisiológicas y de enfermedad 1,4,5,27,28,29,30.
Las instalaciones generadoras de ratones transgénicos agregaron una nueva dimensión al estudio de la fisiología y patología renal, y era solo cuestión de tiempo hasta que esto se combinara con microscopía de 2 fotones para delinear aún más la importancia de productos genéticos específicos en la estructura y función renal. Sin embargo, los glomérulos de ratón, excepto en ratones muy jóvenes, se encuentran a más de 100 μm de la superficie del riñón9. La microscopía de dos fotones se realiza mejor a una profundidad de entre 20 y 50 μm como resolución, y la intensidad de fluorescencia disminuye rápidamente a partir de entonces debido a la dispersión de la luz emitida y la absorción de la interacción con la hemoglobina. Por lo tanto, fue necesario inducir glomérulos superficiales. El enfoque comúnmente utilizado es un modelo de obstrucción unilateral prolongada durante 12 semanas. Como estos modelos no permiten determinaciones de línea de base, no es posible separar los efectos de la UUO del proceso que se está estudiando.
Usando ratas MWF, se puede comparar la función glomerular basal con la siguiente UUO. Se sabe que este modelo UUO induce inflamación y una tasa rápida de fibrosis y se ha utilizado para estudiar la ERC y la fibrosis10,11,12. Como se esperaba, hubo un aumento en los glomérulos superficiales tanto en las ratas MWF como en SD. Además, los resultados cuantitativos obtenidos después de UUO para las ratas MWF y SD fueron muy comparables. La reducción en el flujo sanguíneo registrada aquí había sido reportada previamente comparando datos microscópicos después de UUO con datos de micropunción3. También era bien sabido que la histología tubular e intersticial está marcadamente alterada, y los TP son en su mayoría no funcionales, como se informa aquí, con una falta de endocitosis de albúmina. Los estudios en la Figura 2 y la Figura 3 muestran una reducción dramática en la tasa de flujo de glóbulos rojos en capilares glomerulares y peritubulares y una mayor adhesión de leucocitos. Las reducciones en el flujo probablemente se deban al bloqueo capilar de la adhesión de leucocitos y las formaciones de rouleaux.
Para evaluar aún más la inflamación, cuantificamos la permeabilidad a la albúmina y mostramos que aumenta diez veces. Además, los glomérulos aislados mostraron que la expresión del ARNm aumentó para muchos genes previamente conocidos por aumentar la inflamación renal en una variedad de estados de enfermedad renal 17,19,20,21,22,23,24,25,26 . Los aumentos en la densidad superficial glomerular y la permeabilidad a la albúmina fueron progresivos, como lo muestran los datos de UUO de 12 semanas. Los datos actuales son los primeros en mostrar directamente que los glomérulos sufren daños estructurales significativos, inflamación y cambios moleculares en el modelo UUO. Los resultados son consistentes con un estudio anterior de tejido renal completo que analizó biopsias de riñón de ovejas después de UUO, encontrando múltiples marcadores de inflamación elevados19. Los resultados actuales indican que existe una marcada inflamación dentro de los glomérulos, previamente conocida solo para el tejido cortical.
Los datos actuales difieren de estudios anteriores en ratones donde no se encontraron cambios en la expresión de la molécula de adhesión, la deposición del complemento y la infiltración de neutrófilos entre los glomérulos posthidronefróticos y normales de 12 semanas31. Además, el laboratorio de Hickey utilizó el modelo UUO de 12 semanas para estudiar las reacciones inmunes en glomérulos de ratones. No encontraron diferencias en la infiltración de neutrófilos entre los glomérulos de ratón de cuatro semanas de edad y los glomérulos postobstructivos32,33. Estos estudios posteriores se realizaron después de que la pelvis del riñón obstruido se drenó de orina. No hicimos esto porque queríamos determinar el efecto de UUO sobre la función glomerular como sería in vivo, sin eliminar artificialmente el líquido que causa la obstrucción. Finalmente, el uso de UUO en ratones está siendo reemplazado por glomérulos de imágenes a más de 100 μm debajo de la superficie. Si bien es posible, hay una compensación de resolución e intensidad, ambas se reducen significativamente a medida que uno va más allá de 50 μm34.
Los resultados presentados no son sorprendentes si se juntan los datos de la literatura existente sobre cambios histológicos, formación de glomérulos atubulares, inflamación, fibrosis, hemodinámica10,11,12. Los datos presentados, incluida la adhesión de leucocitos, las formaciones de rouleaux, los marcadores de inflamación molecular glomerular y el aumento de la permeabilidad a la albúmina, indican además la extensa inflamación que está en curso en este modelo UUO incluso a las cinco semanas y también presente a las doce semanas. Claramente, la UUO crónica no es un estado fisiológico, y el uso de UUO para inducir glomérulos superficiales representa un modelo de lesión. Las ratas MWF, que tienen glomérulos superficiales en condiciones fisiológicas, pueden estudiarse longitudinalmente a medida que se produce una lesión. Es posible generar ratas transgénicas, y numerosos investigadores las están creando con biosensores para hacer preguntas específicas. En particular, el Colegio Médico de Wisconsin ahora tiene una colonia de ratas MWF y ha hecho ratas transgénicas con el propósito de estudiar procesos glomerulares en condiciones fisiológicas y patológicas. Estas ratas MWF ofrecen una gran oportunidad para estudiar procesos glomerulares en ratas normales, enfermas y genéticamente alteradas.

Comprender los procesos glomerulares, especialmente la biología de los podocitos, ha sido un objetivo durante más de 50 años. Las ratas Wistar de Munich con glomérulos superficiales han desempeñado un papel central en estos estudios, incluidos los estudios de micropunción, para comprender numerosos aspectos de los procesos fisiológicos y patológicos 1,2,3. La utilización de microscopía para estudiar los componentes glomerulares por vía intravital fue limitada debido a los efectos de la fototoxicidad hasta el advenimiento de la microscopía de 2 fotones que minimizó esta exposición tóxica y aumentó la profundidad de penetración 1,2. Junto con los rápidos avances en hardware y software de computadora, esto ha permitido estudios tridimensionales (3D) y cuatridimensionales (tiempo) durante horas en un solo entorno 1,4,5.
La cuantificación del flujo sanguíneo capilar glomerular, la vasoconstricción y la dilatación en respuesta a los fármacos, la permeabilidad y los efectos de la carga sobre la permeabilidad y la inflamación son solo algunos de los procesos glomerulares que se han estudiado. Además, el segmento S1 del túbulo proximal es identificable, y las diferencias en el comportamiento del epitelio tubular S1 y S2 pueden cuantificarse 1,4. Los estudios en ratones, especialmente con la disponibilidad universal de instalaciones transgénicas de ratón, han llevado a rápidos avances en la comprensión de la biología molecular de los procesos de enfermedad glomerular. Las proteínas individuales son responsables de la disfunción glomerular en estudios knockout, especialmente con respecto a la proteinuria 6,7,8. Sin embargo, la utilización de modelos de ratón para estudios de imagen glomerular ha sido limitada ya que los glomérulos están a más de 100 μm por debajo de la superficie en las numerosas cepas estudiadas9.
Esto ha llevado a los investigadores a desarrollar y utilizar modelos de ratón que resultan en glomérulos superficiales que pueden ser estudiados. El modelo más común es el uso de UUO completo10,11,12. Al final del período prolongado de UUO, hay numerosos glomérulos superficiales en riñones de ratones que pueden ser y han sido estudiados13,14. No ha habido ningún estudio basal o de control en estos estudios con ratones para determinar los efectos de la UUO prolongada en la biología glomerular. Como este es un modelo severo y prolongado de lesión que resulta en fibrosis rápida y destrucción cortical10,11,12, planteamos la hipótesis de que habría efectos sobre los procesos glomerulares y la función. Para responder a esta pregunta, se utilizaron ratas Munich Wistar Fromter (MWF) con glomérulos de superficie para estudiar los parámetros de control / basales, y el hallazgo basal se comparó con estudios glomerulares en ratas MWF después de cinco semanas de UUO. También estudiamos ratas Sprague Dawley (SD) que no tienen glomérulos superficiales después de UUO. Los hallazgos indican que 5 semanas de UUO en ratas MWF y SD aumentan el número de glomérulos superficiales. Sin embargo, estos fueron glomérulos anormales con cambios marcados en el flujo sanguíneo glomerular, inflamación y permeabilidad y tamaño de las macromoléculas.

<table><tbody><tr><td>70 y micro; m filtro de células estériles</td><td>Corning</td><td>#421751</td><td></td></tr><tr><td>100 &micro; m filtro de células estériles</td><td>Corning</td><td>#421752</td><td></td></tr><tr><td>CA Micro tijeras Modelo 1C300</td><td>Ciencias de la Microscopía Electrónica</td><td>Cat# 72930</td><td></td></tr><tr><td>Almohadilla térmica eléctrica</td><td>Pinzas</td> de manipulación <td>Sunbeam Kroger</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Ciencias de la Microscopía Electrónica</td><td>Cat# 72962</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas Hemostáticas Kelly (rectas)</td><td>Ciencias de la Microscopía Electrónica</td><td>Cat#72930</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio invertido multifotónico Leica Dive SP-8</td><td>Nota</td><td>: Versión 7.1r1</td><td></td></tr><tr><td>MaiTai DeepSee láser de titanio-zafiro</td><td>Spectra-Physics</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Mayo Tijeras de disección Ciencias de</td> la <td>microscopía electrónica</td><td>Cat# 78180-1C3</td><td></td></tr><tr><td>Metamorph Software de procesamiento de imágenes</td><td>Molecular Dynamics</td><td>Cat# 78266-04</td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft Corportation</td> versión <td></td><td>2007</td></tr><tr><td>Quant-iT Kit de ensayo de ARN</td><td>Invitrogen/ThermoFisher</td><td>Q33140</td><td></td></tr><tr><td>Reptitherm Calentador</td> debajo del tanque <td>Zoomed</td><td>Amazon</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy MinElute Cleanup Kit (columnas de centrifugado)</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td></td></tr><tr><td>Tampón RPE</td><td>Qiagen</td><td>1018013</td><td></td></tr><tr><td>Cinta de autoclave Strate-Line</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat# 11-889-1</td><td></td></tr><tr><td>TRI Reactivo</td><td>Sigma</td><td>T9424</td><td></td></tr><tr><td>Willco-dish Coverslip Platos de fondo (50 mm/40 mm coverslip)</td><td>Ciencias de la Microscopía Electrónica</td><td>Cat# 70665-07</td><td></td></tr></tbody></table>

uso de microscopía de 2 fotones para cuantificar los efectos de la obstrucción ureteral unilateral crónica en los procesos glomerulares

Using 2-Photon Microscopy to Quantify the Effects of Chronic Unilateral Ureteral Obstruction on Glomerular Processes

La aplicación de nuevos métodos de microscopía a modelos adecuados de enfermedades animales para explorar la fisiología dinámica del riñón sigue siendo un desafío. Las ratas con glomérulos superficiales brindan una oportunidad única para investigar procesos fisiológicos y fisiopatológicos utilizando microscopía intravital de 2 fotones. La cuantificación del flujo sanguíneo capilar glomerular y la vasoconstricción y dilatación en respuesta a fármacos, permeabilidad e inflamación son solo algunos de los procesos que se pueden estudiar. Además, las ratas transgénicas, es decir, los podocitos marcados con colorantes fluorescentes y otros enfoques de biomarcadores moleculares, proporcionan una mayor resolución para monitorear y cuantificar directamente las interacciones proteína-proteína y los efectos de alteraciones moleculares específicas.
En ratones, que carecen de glomérulos superficiales después de las cuatro semanas de edad, se ha utilizado la obstrucción ureteral unilateral (UUO) durante varias semanas para inducir glomérulos superficiales. Como este modelo de inducción no permite estudios basales, cuantificamos los efectos de la UUO en los procesos glomerulares en el modelo UUO en ratas Wistar Frömter (MWF) de Múnich, que tienen glomérulos superficiales en condiciones fisiológicas. El modelo UUO durante cinco semanas o más indujo alteraciones significativas en la morfología renal macroscópica, la microvasculatura peritubular y glomerular, así como la estructura y función de los epitelios tubulares. El flujo glomerular y peritubular de glóbulos rojos (RBC) disminuyó significativamente (p < 0,01), probablemente debido al aumento significativo en la adhesión de glóbulos blancos (WBC) dentro de los capilares glomerulares y peritubulares. El coeficiente de tamizado glomerular de la albúmina aumentó de 0,015 ± 0,002 en MWF no tratados a 0,045 ± 0,05 en ratas UUO MWF de 5 semanas de edad. Doce semanas de UUO dieron lugar a aumentos adicionales en la densidad glomerular de superficie y el coeficiente de tamizado glomerular (GSC) para la albúmina. La albúmina fluorescente filtrada a través de los glomérulos no fue reabsorbida por los túbulos proximales. Estos datos sugieren que el uso de UUO para inducir glomérulos superficiales limita la capacidad de estudiar e interpretar los procesos glomerulares normales y las alteraciones de la enfermedad.

Aquí, presentamos un protocolo utilizando microscopía de 2 fotones en ratas Munich Wistar Fromter con glomérulos de superficie para cuantificar los efectos de la obstrucción ureteral prolongada en la dinámica y función glomerular.

Uso de microscopía de 2 fotones para cuantificar los efectos de la obstrucción ureteral unilateral crónica en los procesos glomerulares

Applying novel microscopy methods to suitable animal disease models to explore the dynamic physiology of the kidney remains a challenge. Rats with surface ...

En los datos presentados en este estudio muestran los efectos dramáticos de la obstrucción ureteral unilateral sobre la función renal, la inflamación y la fibrosis. Nos ayuda a comprender los mecanismos fisiopatológicos de la obstrucción ureteral unilateral. La principal ventaja de esta técnica es la capacidad de estudiar las interacciones célula-célula, los eventos subcelulares y asociar la estructura y la función de una manera dinámica dentro de un riñón funcional.Silvia Campos-Bilderback, quien es cirujana en nuestro laboratorio. Para comenzar, anestesia a la rata, luego haga una incisión a lo largo de la línea media y localice el riñón izquierdo para separarlo de los órganos peritoneales circundantes. Después de localizar el pedículo renal, que comprende la arteria renal, la vena renal y el uréter, separe el uréter sin dañar la delicada estructura.Use fórceps para enrollar y atar una sutura 3-0 alrededor del uréter, luego ate un nudo unos pocos milímetros a cada lado del primer nudo para asegurar una obstrucción completa. Una vez que el uréter esté atado, cierre con cuidado las capas musculares sucesivas, luego cierre el abdomen por completo. Cierre la piel externa con grapas quirúrgicas.Para la preparación quirúrgica, coloque la rata anestesiada con una línea de acceso venoso permanente en el lado con el flanco izquierdo afeitado hacia arriba plano y recto sobre la mesa. Asegúrese de que las patas delanteras de la rata se toquen entre sí como deberían hacerlo las patas traseras. Una vez que la rata esté posicionada, palpe el flanco izquierdo justo debajo de las costillas para sentir el riñón y determinar la posición natural en el abdomen, luego dibuje una línea usando un marcador permanente a lo largo del área afeitada, dividiendo el centro del riñón en una orientación de nariz a cola.Use un par de pinzas dentadas para agarrar y levantar la piel hacia arriba y pellizque la línea marcador permanente con un par de hemostáticos para aplastar la vasculatura subyacente y prevenir el sangrado. Repita el procedimiento para la capa delgada del músculo externo para minimizar el sangrado. Para hacer la incisión final de la capa delgada del músculo abdominal interno, palpar el riñón para estimar el tamaño y la posición y levantar la capa muscular interna con un par de fórceps, luego aplastar una línea que divide la piel por encima del riñón con los hemostáticos que es aproximadamente 1/3 del tamaño estimado del riñón.Mientras mantiene el agarre de la capa muscular con los fórceps, haga la incisión final. Luego, use fórceps en cada mano para agarrar y sostener la grasa renal en el polo inferior del riñón con una técnica de mano sobre mano que trabaja hacia abajo. Teniendo un agarre firme sobre la grasa con una mano, tire de la grasa y apriete muy suavemente el riñón a través de la incisión.Si el riñón no pasa a través, ensanche fácilmente la incisión. Para identificar los glóbulos blancos o glóbulos blancos alojados en los asas capilares, administre la tinción nuclear Hoechst 33342 a 8 microgramos por kilogramo de peso de rata a través de una línea de acceso venoso permanente. En el microscopio, coloque el riñón expuesto contra el borde del plato con una ligera rotación para que el lado abdominal del riñón entre en contacto con el cubreobjetos y el lado dorsal quede mirando hacia el borde.Para minimizar aún más el movimiento, empaque dos almohadillas de gasa estériles de 2 por 2 humedecidas con solución salina contra el lado dorsal del riñón reforzando el contacto del lado abdominal del riñón con el borde. Cuando la muestra esté colocada, mire a través del ocular del microscopio bajo iluminación de epifluorescencia usando un cubo FITC de rodamina de doble paso. Si se detecta un movimiento en la posición de la muestra, haga ajustes menores ajustando la gasa asegurándose de que no empuje debajo del riñón.Haga rodar la rata ligeramente para que el tórax esté más lejos del plato. Escanee la superficie del riñón usando iluminación de epifluorescencia y marque las posiciones de los glomérulos usando el software asociado con el controlador de etapa motorizado. Para cada canal de color bajo iluminación de 2 fotones, tome un volumen 3D superficial de la parte superior de cada glomérulo marcado para que sirva como imagen de fondo.En la opción de visualización del software de imágenes, utilice una pseudopaleta de colores para visualizar las débiles intensidades de la fluorescencia de fondo de los bucles capilares glomerulares. Usando un vaso sanguíneo superficial como punto focal, infunda lentamente la albúmina sérica fluorescente Texas Red RAP o TRRSA mientras observa el aumento y la disminución de la fluorescencia debido a la distribución sistémica hasta que una intensidad en la vasculatura peritubular y los asas capilares está justo por debajo de la saturación. Después de 10 minutos, adquiera volúmenes 3D para todos los glomérulos marcados y fotografiados a intervalos de 1 micrómetro.Encuentre un recipiente apropiado, ya sea un bucle capilar o un vaso peritubular, luego gire la imagen utilizando la función Rotar, ya que la función Line Scan en el software de adquisición de imágenes requiere que el recipiente sea perpendicular. Una vez que el recipiente esté girado y acostado, seleccione la función XT en el menú Adquisición y configúrela para escanear 4, 000 líneas. Coloque la línea a través del recipiente a examinar con el plano focal en el diámetro máximo del segmento.A continuación, haga clic izquierdo en la imagen compuesta en color y seleccione la pestaña Tomar instantánea para generar una imagen de referencia del área donde se realizó el escaneo de línea. Haga clic inmediatamente en el botón Inicio para capturar el escaneo de línea del buque. Más tarde, importe los escaneos de línea en el software de procesamiento de imágenes para determinar el caudal RBC.En el menú desplegable Medir, abra el cuadro de diálogo Mostrar estadísticas de región y seleccione la herramienta Dibujo de una sola línea para dibujar una línea que coincida con la pendiente de las sombras RBC. Después de anotar el ancho y la altura de la línea, use una ecuación para calcular la velocidad, luego obtenga un promedio de cinco cálculos para informar la velocidad para cada escaneo de línea. Centrar un glomérulo en el campo de imágenes y tomar un conjunto de datos 3D comenzando en la superficie glomerular y terminando en 30 a 35 micrómetros.Utilice un tamaño de paso de 1 micrómetro en la dirección Z. Identifique los glóbulos blancos comparando el canal azul de Hoechst con el canal de albúmina rojo de Texas buscando la exclusión del tinte rojo en el asa capilar y una tinción nuclear correspondiente. Si los glóbulos blancos aparecen estáticos en tres secciones ópticas, defina las celdas como adheredas, luego informe los valores como ocurrencia por 10 secciones ópticas desde la parte superior del glomérulo tomadas a intervalos de 1 micrómetro.El número de glomerulares por campo en ratas Munich Wistar Fromter o MWF aumentó en el grupo UUO de 5 semanas que en ratas no tratadas. Las ratas Sprague-Dawley, o ratas SD, pasaron de no tener glomérulos superficiales a 2,02 por campo después de cinco semanas de obstrucción ureteral unilateral. Se observaron imágenes tridimensionales reconstruidas para ver la superficie renal.La obstrucción uretal unilateral de 5 semanas en las ratas SD no dio lugar a áreas parecidas al epitelio tubular normal como se ve en el MWF, sin tratamiento, y parcialmente en ratas UUO MWF de 5 semanas. En el estudio de la dinámica vascular renal, el flujo sanguíneo renal se redujo significativamente en los grupos UUO MWF de 5 semanas y SD en comparación con las ratas no tratadas. La velocidad de RBC dentro de los bucles capilares glomerulares disminuyó significativamente en las ratas UUO MWF y SD de 5 semanas en comparación con las ratas MWF no tratadas.Además, las ratas MWF no tratadas tenían menos glóbulos blancos por cada 10 secciones ópticas desde la parte superior, mientras que el número aumentó en las ratas UUO MWF de 5 semanas y UUO SD de 5 semanas. Con la obstrucción uretal unilateral, se observó un aumento en la permeabilidad a la albúmina. Una acumulación de albúmina dentro del espacio de Bowman fue intensa después de la obstrucción uretal unilateral.La endocitosis del segmento S1 de grandes cantidades de albúmina como se observa con condiciones fisiológicas en ratas MWF no tratadas. La misma captación no se pudo ver en las ratas MWF o SD después de 5 semanas de obstrucción uretal unilateral. Muchos métodos diferentes, como la repetición de imágenes para estudiar un proceso a lo largo del tiempo, la fijación de un área específica para obtener imágenes y la posterior utilización del tejido fijo para llevar a cabo una microscopía de mayor resolución se pueden realizar junto con esta técnica.La técnica se considera tecnología disruptiva. Se permite a los investigadores responder a muchas preguntas nuevas. Al hacerlo, se han proporcionado nuevos conocimientos y se han obtenido datos de cambio de paradigma.

using-2-photon-microscopy-to-quantify-effects-chronic-unilateral

Research

Investigación

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Este video muestra el procedimiento para generar un modelo de ratón de obstrucción ureteral unilateral. El procedimiento consiste en cortar uno de los uréteres del ratón para obstruir el flujo de orina.

Modelo Murino de Obstrucción Ureteral Unilateral: Un Procedimiento Quirúrgico para Obstruir el Flujo Urinario de un Riñón en Modelos de Ratón

Una técnica de la utilización de alta resolución intavital 2 fotones microscopía de visualizar directamente y cuantificar la filtración gloemrular en los glomérulos superficie. Este método permite la determinación directa de las características de permeabilidad de macromoléculas tanto en estados normales y enfermos.

Cuantificación de la permeabilidad glomerular de macromoléculas fluorescentes mediante microscopía 2-Photon en Munich Ratas Wistar

El modelo murino de obstrucción ureteral unilateral irreversible (UUO) se presenta junto con el modelo de UUO reversible en el que la obstrucción ureteral se alivia mediante la anastomosis del uréter cortado en la vejiga. Estos modelos permiten el estudio de la inflamación y la cicatrización renal, así como la remodelación de los tejidos.

Un modelo murino de irreversible y reversible obstrucción ureteral unilateral

Este protocolo describe un work-up de riñón completo que debe ser llevado a cabo en modelos de ratón de la enfermedad glomerular. Los métodos permiten análisis funcional, estructural y mecánico de la función glomerular, que puede ser aplicado a todos los modelos de ratón de la enfermedad glomerular.

Evaluación de la función renal en modelos de ratón de la enfermedad Glomerular

Presentamos uso de microscopia de 2 fotones a una micropipeta dentro del espacio urinario de Bowman en los ratones, la combinación de 2 técnicas fundamentales de la fisiología renal. Uso de la microscopia de 2 fotones supera críticas limitaciones de la microscopia convencional para estudios de micropunción fisiología renal.

Micropunción del espacio de Bowman en ratones por 2 fotones microscopía

La combinación de etiquetado de anticuerpos, limpieza óptica y microscopía de luz avanzada permite el análisis tridimensional de estructuras u órganos completos. Aquí se describe un método sencillo para combinar la inmunoetiquetado de rodajas renales gruesas, la limpieza óptica con la canela etílico y la imagen confocal que permite la visualización y cuantificación de estructuras renales tridimensionales.

Limpieza óptica e imágenes del tejido renal inmunoetiquetado

Describimos un método para evaluar la expresión del microRNA en los riñones de ratones con obstrucción ureteral unilateral (UUO) mediante la reacción cuantitativa en cadena de la polimerasa de transcripción inversa. Este protocolo es adecuado para el estudio de perfiles de expresión de microARN renal en ratones con UUO y en el contexto de otras condiciones patológicas.

Evaluación cuantitativa de PCR en tiempo real de expresiones de microARN en riñón de ratón con obstrucción ureteral unilateral

El presente protocolo describe un modelo reproducible paso a paso de la obstrucción ureteral unilateral.

Un modelo murino inmaduro de obstrucción ureteral unilateral reversible

Este protocolo describe un método para inducir la obstrucción ureteral unilateral (UUO) en ratones para estudiar la progresión de la fibrosis tisular en la nefropatía obstructiva. Incluye procedimientos quirúrgicos, cuidados postoperatorios y métodos para la evaluación de la fibrosis.

Modelo de obstrucción ureteral unilateral para la investigación de la fibrosis intersticial renal

Este artículo proporciona instrucciones detalladas para permitir a los investigadores realizar la obstrucción ureteral unilateral reversible en ratones utilizando un modelo estandarizado que permite el análisis de los resultados estructurales y funcionales a largo plazo después de la reversión de la obstrucción ureteral prolongada.

Un modelo de ratón para evaluar los resultados estructurales y funcionales a largo plazo después de la reversión de la obstrucción ureteral unilateral prolongada

Aprende a utilizar microscopía de 2 fotones para cuantificar los efectos de la obstrucción ureteral unilateral crónica en la función glomerular de ratas Munich Wistar Fromter. Esta técnica permite observar dinámicas celulares en tiempo real.

Uso de microscopía de 2 fotones para cuantificar los efectos de la obstrucción ureteral unilateral crónica en los procesos glomerulares (Video) | JoVE Journal

Uso de microscopía de 2 fotones para cuantificar los efectos de la obstrucción ureteral unilateral crónica en los procesos glomerulares

Explorar más videos