Name: Modelado de hemorragia intraventricular neonatal a través de la inyección intraventricular de hemoglobina (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-25T12:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 57 s
Description: Aprende a modelar hemorragia intraventricular neonatal mediante inyección intraventricular de hemoglobina en ratas neonatales. Este método permite estudiar la hidrocefalia posthemorrágica y evaluar nuevas estrategias terapéuticas.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

JMS recibió fondos de NIH/NINDS R01 NS110793 y K12 (Programa de Desarrollo de Carrera de Investigación de Neurocirujanos). BAM recibió fondos de NIH / NINDS K08 NS112580-01A1, Premio al Área Prioritaria de Investigación de Neurociencia de la Universidad de Kentucky y un Premio al Innovador de la Asociación de Hidrocefalia .

NOTA: Todos los protocolos con animales fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de las instituciones. Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles sobre todos los materiales, reactivos, equipos y software utilizados en este protocolo.
1. Preparación de soluciones de hemoglobina y LCR
<ol><li>Prepare una solución artificial estéril de LCR (aCSF) agregando 500 μL de la solución de aCSF a un microtubo de 1,5 ml y guárdela en hielo.</li>
	<li>Prepare una solución estéril de hemoglobina de 150 mg/ml agregando 75 mg de hemoglobina a 500 μL de aCSF en un microtubo de 1,5 ml y guárdela en hielo.</li>
</ol>2. Preparación del animal para inyección
<ol><li>Gire la almohadilla térmica a la configuración media para mantener la temperatura corporal de la rata.</li>
	<li>Anestesiar ratas postnatales del día 4 (P4) en una cámara de inducción llena de isoflurano al 3%. NOTA: Confirme la anestesia suficiente usando la respuesta de pellizco del dedo del pie / cola cada 15 minutos. Monitoree la anestesia con observación visual del color del tejido, la temperatura corporal y la frecuencia respiratoria.</li>
	<li>Administrar alivio del dolor con una inyección subcutánea de carprofeno de 5 mg/kg a la rata anestesiada.</li>
	<li>Coloque la rata anestesiada propensa en el aparato estereotáctico con la nariz colocada en el adaptador de anestesia con un flujo constante de isoflurano al 1,5%.</li>
	<li>Apriete las barras auditivas sin ruptura en el meato auditivo externo para asegurar la cabeza. NOTA: Aplique ungüento veterinario para mantener los ojos hidratados si los ojos están abiertos a la edad de la inyección.</li>
	<li>Limpie el cabezal, alternando con aplicadores estériles con punta de algodón empapados en betadina y etanol al 70%.<ol><li>Toque el aplicador empapado en betadina en el centro del cuero cabelludo y extienda la betadina en círculos, moviéndose hacia afuera.</li>
		<li>Repita el paso 2.6.1.1 con el aplicador empapado en etanol.</li>
		<li>Repita los pasos 2.6.1.1 y 2.6.1.2 3x.</li>
	</ol></li>
	<li>Aplique una cortina quirúrgica estéril para proteger el campo quirúrgico.</li>
	<li>Usando un bisturí estéril, haga una incisión de 0,3 cm verticalmente por el centro de la cabeza para exponer el bregma del cráneo. NOTA: Si inyecta desde la lambda, exponga la lambda del cráneo en lugar de la bregma.</li>
	<li>Use un aplicador estéril con punta de algodón para secar el área.</li>
</ol>3. Configuración del inyector estereotáctico
<ol><li>Extraiga la solución de hemoglobina preparada en el paso 1.2 en una jeringa estéril de 0,3 ml con una aguja de 30 G y coloque la jeringa en el sistema de inyección estereotáctica. NOTA: Si genera condiciones de control, extraiga una solución de LCR preparada en el paso 1.1 en una jeringa estéril de 0,3 ml y proceda con el protocolo.</li>
	<li>Encienda la interfaz del inyector estereotáctico y haga clic en el botón Configuración para ingresar los ajustes de volumen y velocidad de inyección.<ol><li>Haga clic en Volumen y establezca el volumen en 20.000 nL (20 μL).</li>
		<li>Haga clic en Velocidad de infusión y establezca la velocidad en 8.000 nL /min (8 μL/min).</li>
	</ol></li>
	<li>Salga de Configuración haciendo clic en el botón Restablecer punto de venta.</li>
	<li>Enjuague la punta de la aguja haciendo clic en el botón Infundir hasta que surja una pequeña gota de solución de hemoglobina en la punta de la aguja.</li>
	<li>Absorba suavemente la solución de hemoglobina de la punta de la aguja con un aplicador estéril con punta de algodón.</li>
</ol>4. Inyección animal
<ol><li>Coloque el bregma como cero en el sistema de inyección estereotáctica ajustando las posiciones mediolateral y anteroposterior de la jeringa antes de bajar la punta de la aguja de la jeringa enrojecida para tocar suavemente el cráneo en el bregma. NOTA: Si inyecta desde lambda, establezca lambda como cero.</li>
	<li>Identifique las coordenadas de su elección.<ol><li>Si inyecta desde el bregma, en ratas P4 descritas aquí, use 1.5 mm lateral, 0.4 mm anterior y 2.0 mm de profundidad de bregma.</li>
		<li>Si inyecta desde la lambda, use las siguientes coordenadas para ratas P4: 1.1 mm lateral, 4.6 mm anterior y 3.3 mm de profundidad desde lambda.</li>
	</ol></li>
	<li>Levante la aguja de la jeringa 1 cm por encima del cráneo para despejar el cuero cabelludo. Cuando se levante la jeringa, proceda a establecer las coordenadas mediolateral y anteroposterior.</li>
	<li>Baje la aguja de la jeringa para tocar suavemente el cráneo. Compruebe que la aguja está tocando el cráneo.</li>
	<li>Establezca la coordenada dorsoventral durante un período de 30 s. NOTA: Al ajustar la coordenada dorsoventral, la aguja perforará el cráneo. Se debe tener cuidado para asegurar que la jeringa pase a través del cráneo sin deformar el cráneo. La deformación del cráneo se evita retirando lentamente la aguja a lo largo de la coordenada dorsoventral si se produce deformación, y luego colocando la aguja de nuevo a lo largo de la misma trayectoria. Esto permite que la aguja pase a través del orificio en el cráneo con menos fuerza y sin deformación.</li>
	<li>En la interfaz del inyector estereotáctico, haga clic en el botón Ejecutar para comenzar la inyección.</li>
	<li>Una vez finalizada la inyección, deje la aguja de la jeringa en su lugar durante 2 minutos para minimizar el reflujo de la solución.</li>
	<li>Extraiga la jeringa lentamente a lo largo de la coordenada dorsoventral durante 2 minutos hasta que la punta de la aguja esté 2 cm por encima del cuero cabelludo.</li>
	<li>Gire el brazo del inyector estereotáctico lejos del campo operatorio.</li>
</ol>5. Cuidados postoperatorios
<ol><li>Cierre el cuero cabelludo con una sutura de monofilamento 6-0. Haga una sutura interrumpida simple en el centro de la incisión de 0,3 cm.</li>
	<li>Retire al cachorro de la anestesia y colóquelo en un área segura en la almohadilla térmica.</li>
	<li>Devuelva el roedor a la jaula de la casa para recuperarse de la anestesia bajo el cuidado de su madre. NOTA: El retorno oportuno al cuidado de la presa reduce la mortalidad postoperatoria temprana.</li>
	<li>Monitoree a los animales para la anestesia mediante la pérdida del reflejo de enderezamiento cada hora después de la cirugía durante 3 h.</li>
	<li>Controle a los animales diariamente durante 7 días para la actividad normal, la ingesta de alimentos y el aumento de peso. Controle el sitio de la incisión para la cicatrización de heridas, el cierre y la reaparición del pelaje en el sitio de la cirugía. NOTA: En el raro caso de que se observen cambios neurológicos como convulsiones, depresión central o disminución del apetito durante el monitoreo, eutanasia al animal usando perfusión intravascular o dislocación cervical bajo anestesia.</li>
	<li>Para prevenir la infección una vez que la sutura está cerrada y la herida está sanando, aplique triple antibiótico tópico en el sitio de la incisión.</li>
</ol>6. Adquisición y cuantificación de MRI
<ol><li>Realice una resonancia magnética en un escáner de animales pequeños de 4.7T o 9.4T.</li>
	<li>Gire la almohadilla térmica a la configuración media para mantener la temperatura corporal de la rata.</li>
	<li>Inducir la anestesia en una cámara utilizando isoflurano al 3%. NOTA: Confirme la anestesia suficiente usando la respuesta de pellizco del dedo del pie / cola cada 15 minutos. Monitoree la anestesia con observación visual del color del tejido, la temperatura corporal y la frecuencia respiratoria.</li>
	<li>Coloque la rata anestesiada propensa en la resonancia magnética con la nariz colocada en el adaptador de anestesia con un flujo constante de isoflurano al 1,5%.</li>
	<li>Realice imágenes ponderadas en T2 seleccionando una secuencia de eco de giro rápido ponderada en T2.<ol><li>Si utiliza un escáner de resonancia magnética de 4,7 T, introduzca los siguientes parámetros en el software de resonancia magnética: tiempo de repetición = 3.000 ms, tiempo de eco = 27,50 ms, número de promedios = 3, campo de visión = 18,0 mm x 18,0 mm, matriz = 128 x 128, número de cortes axiales = 24, espesor = 0,50 mm.</li>
		<li>Si utiliza un escáner de resonancia magnética de 9,4T, introduzca los siguientes parámetros en el software de resonancia magnética: tiempo de repetición = 5.000 ms, tiempo de eco = 66,00 ms, espaciado de eco = 16,50 ms, número de promedios = 2, repeticiones = 1, factor raro = 8, campo de visión = 16,0 mm x 16,0 mm, matriz = 256 x 256, número de cortes axiales = 32, grosor = 0,50 mm.</li>
	</ol></li>
	<li>Haga clic en el botón Continuar para iniciar la secuencia.</li>
</ol>7. Procesamiento y análisis de imágenes
<ol><li>Utilice datos nativos ponderados en T2 para analizar el volumen cerebral. Utilice software de segmentación para delinear manualmente los ventrículos laterales6. Haga clic en Modo Pincel y seleccione el estilo de pincel cuadrado . Ajuste el tamaño del pincel a 1. Haga clic en Inspector de diseño y seleccione vista axial. Haga clic en zoom para ajustar. Coloque el cursor sobre la imagen; Trazar y llenar el espacio del ventrículo lateral.</li>
	<li>Haga clic en Segmentación en la barra de herramientas | Volumen y estadísticas para ver los volúmenes segmentados.</li>
</ol>

<ol><li>Robinson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+posthemorrhagic+hydrocephalus+from+prematurity%3A+Pathophysiology+and+current+treatment+concepts%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurosurgery%3A+Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Neonatal posthemorrhagic hydrocephalus from prematurity: Pathophysiology and current treatment concepts: A review.</a> Journal of Neurosurgery: Pediatrics. 9 (3), (2012).</li>
<li>Hasselager, A. B., Børch, K., Pryds, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+in+perinatal+care+for+extremely+premature+infants+in+Denmark+from%5BTitle%5D)+AND+%22Danish+Medical+Journal%22%5BJournal%5D)">Improvement in perinatal care for extremely premature infants in Denmark from.</a> Danish Medical Journal. 63 (1), to (1994).</li>
<li>Johnston, P. G., Gillam-Krakauer, M., Fuller, M. P., Reese, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence-Based+Use+of+Indomethacin+and+Ibuprofen+in+the+Neonatal+Intensive+Care+Unit%5BTitle%5D)+AND+%22Clinics+in+Perinatology%22%5BJournal%5D)">Evidence-Based Use of Indomethacin and Ibuprofen in the Neonatal Intensive Care Unit.</a> Clinics in Perinatology. 39 (1), (2012).</li>
<li>Mahaney, K. B., Buddhala, C., Paturu, M., Morales, D., Limbrick, D. D., Strahle, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraventricular+Hemorrhage+Clearance+in+Human+Neonatal+Cerebrospinal+Fluid%3A+Associations+with+Hydrocephalus%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Intraventricular Hemorrhage Clearance in Human Neonatal Cerebrospinal Fluid: Associations with Hydrocephalus.</a> Stroke. , (2020).</li>
<li>Strahle, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+CSF+Iron+Pathway+Proteins+in+Posthemorrhagic+Hydrocephalus%3A+Associations+with+Ventricle+Size+and+Neurodevelopmental+Outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Longitudinal CSF Iron Pathway Proteins in Posthemorrhagic Hydrocephalus: Associations with Ventricle Size and Neurodevelopmental Outcomes.</a> Annals of Neurology. 90 (2), (2021).</li>
<li>Strahle, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Hemoglobin+and+Iron+in+hydrocephalus+after+neonatal+intraventricular+hemorrhage%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">Role of Hemoglobin and Iron in hydrocephalus after neonatal intraventricular hemorrhage.</a> Neurosurgery. 75 (6), (2014).</li>
<li>Garton, T. P., He, Y., Garton, H. J. L., Keep, R. F., Xi, G., Strahle, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemoglobin-induced+neuronal+degeneration+in+the+hippocampus+after+neonatal+intraventricular+hemorrhage%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Hemoglobin-induced neuronal degeneration in the hippocampus after neonatal intraventricular hemorrhage.</a> Brain Research. 1635, (2016).</li>
<li>SNAP Tutorial and User’s Manual. , Medtext, Inc.. Hinsdale (IL). Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.itksnap.org/docs/fullmanual.php">http://www.itksnap.org/docs/fullmanual.php</a> (2022).</li>
<li>Goulding, D. S., Caleb Vogel,, Gensel, R., Morganti, J. C., Stromberg, J. M., Miller, A. J., A, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+brain+inflammation%2C+white+matter+oxidative+stress%2C+and+myelin+deficiency+in+a+model+of+neonatal+intraventricular+hemorrhage%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurosurgery%3A+Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Acute brain inflammation, white matter oxidative stress, and myelin deficiency in a model of neonatal intraventricular hemorrhage.</a> Journal of Neurosurgery: Pediatrics. 26 (6), (2020).</li>
<li>Strahle, J., Garton, H. J. L., Maher, C. O., Muraszko, K. M., Keep, R. F., Xi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+Hydrocephalus+After+Neonatal+and+Adult+Intraventricular+Hemorrhage%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Stroke+Research%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of Hydrocephalus After Neonatal and Adult Intraventricular Hemorrhage.</a> Translational Stroke Research. 3, (2012).</li>
<li>Jinnai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Model+of+Germinal+Matrix+Hemorrhage+in+Preterm+Rat+Pups%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A Model of Germinal Matrix Hemorrhage in Preterm Rat Pups.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, (2020).</li>
<li>Georgiadis, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+acute+brain+injuries+and+neurobehavioral+profiles+in+a+rabbit+model+of+germinal+matrix+hemorrhage%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Characterization of acute brain injuries and neurobehavioral profiles in a rabbit model of germinal matrix hemorrhage.</a> Stroke. 39 (12), (2008).</li>
<li>Cherian, S. S., Love, S., Silver, I. A., Porter, H. J., Whitelaw, A. G. L., Thoresen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Posthemorrhagic+ventricular+dilation+in+the+neonate%3A+Development+and+characterization+of+a+rat+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuropathology+and+Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Posthemorrhagic ventricular dilation in the neonate: Development and characterization of a rat model.</a> Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 62 (3), (2003).</li>
<li>Balasubramaniam, J., Xue, M., Buist, R. J., Ivanco, T. L., Natuik, S., del Bigio,, R, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistent+motor+deficit+following+infusion+of+autologous+blood+into+the+periventricular+region+of+neonatal+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Persistent motor deficit following infusion of autologous blood into the periventricular region of neonatal rats.</a> Experimental Neurology. (1), (2006).</li>
<li>Volpe, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+injury+in+premature+infants%3A+a+complex+amalgam+of+destructive+and+developmental+disturbances%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet+Neurology%22%5BJournal%5D)">Brain injury in premature infants: a complex amalgam of destructive and developmental disturbances.</a> The Lancet Neurology. 8 (1), (2009).</li>
<li>Dobbing, J., Sands, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+aspects+of+the+brain+growth+spurt%5BTitle%5D)+AND+%22Early+Human+Development%22%5BJournal%5D)">Comparative aspects of the brain growth spurt.</a> Early Human Development. 3 (1), (1979).</li>
<li>Craig, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+perinatal+rodent+oligodendrocyte+lineage+progression+and+its+correlation+with+human%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of perinatal rodent oligodendrocyte lineage progression and its correlation with human.</a> Experimental Neurology. 181 (2), (2003).</li>
<li>Lodygensky, G. A., Vasung, L., Sv Sizonenko,, Hüppi, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroimaging+of+cortical+development+and+brain+connectivity+in+human+newborns+and+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">Neuroimaging of cortical development and brain connectivity in human newborns and animal models.</a> Journal of Anatomy. 217 (4), (2010).</li>
<li>Dean, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strain-specific+differences+in+perinatal+rodent+oligodendrocyte+lineage+progression+and+its+correlation+with+human%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Strain-specific differences in perinatal rodent oligodendrocyte lineage progression and its correlation with human.</a> Developmental Neuroscience. 33 (34), (2011).</li>
<li>Engelhardt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Development of the blood-brain barrier.</a> Cell and Tissue Research. 314 (1), (2003).</li>
<li>Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A. A., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericytes+are+required+for+blood%C4%9D%E2%82%AC%26%2334%3Bbrain+barrier+integrity+during+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pericytes are required for bloodĝ€&#34;brain barrier integrity during embryogenesis.</a> Nature. 468 (7323), (2010).</li>
<li>Alles, Y. C. J., Greggio, S., Alles, R. M., Azevedo, P. N., Xavier, L. L., DaCosta, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+preclinical+rodent+model+of+collagenase-induced+germinal+matrix%2Fintraventricular+hemorrhage%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">A novel preclinical rodent model of collagenase-induced germinal matrix/intraventricular hemorrhage.</a> Brain Research. 1356, (2010).</li>
<li>Christian, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trends+in+hospitalization+of+preterm+infants+with+intraventricular+hemorrhage+and+hydrocephalus+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurosurgery%3A+Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Trends in hospitalization of preterm infants with intraventricular hemorrhage and hydrocephalus in the United States.</a> Journal of Neurosurgery: Pediatrics. 17 (3), 2000-2010 (2016).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen conflictos de intereses.

Este modelo de Hiv que utiliza inyección de hemoglobina permite el estudio de la patología de la Hiv específicamente mediada por la hemoglobina. Para estudios complementarios, la hemoglobina también se puede administrar fácilmente in vitro y no confunde los ensayos bioquímicos para proteínas producidas por microglia / macrófagos que están presentes en la sangre total.
Las principales teorías de IVH-PHH incluyen la obstrucción mecánica de la circulación del LCR, la interrupción de los ...

La hemorragia intraventricular neonatal se origina en la matriz germinal, un sitio de división celular rápida que se encuentra adyacente a los ventrículos laterales del cerebro en desarrollo. Esta estructura altamente vascular es vulnerable a la inestabilidad hemodinámica relacionada con el nacimiento prematuro. La sangre se libera en los ventrículos laterales en la hemorragia de la matriz germinal (GMH)-FIV cuando los vasos sanguíneos frágiles dentro de la matriz germinal se rompen. En el caso de la Hiv de grado IV, el infarto hemorrágico periventricular también puede contribuir a la liberación de productos sanguíneos dentro del cerebro. 1 La combinación de GMH-IVH puede causar PHH, particularmente después de hemorragia de alto grado (grados III y IV)1. La PHH se puede tratar con la colocación de una derivación ventriculoperitoneal, pero la colocación de la derivación no revierte la lesión cerebral que puede ocurrir por la IVH. Aunque los cuidados intensivos neonatales modernos han reducido las tasas de Hiv2, 3, no existen tratamientos específicos para la lesión cerebral o hidrocefalia causada por la Hiv una vez que ha ocurrido. Una limitación significativa en el desarrollo de tratamientos preventivos para la lesión cerebral inducida por IVH y PHH es la comprensión incompleta de la fisiopatología de la IVH.
Recientemente, se ha demostrado que los niveles tempranos de LCR del producto clave de degradación sanguínea hemoglobina están asociados con el desarrollo posterior de PHH en neonatos con HVI4 de alto grado. Además, los niveles de LCR de proteínas de la vía de manipulación del hierro (hemoglobina, ferritina y bilirrubina) se asocian con el tamaño del ventrículo en la Hiv neonatal. Esto también se demostró en una cohorte multicéntrica de lactantes con PHH prematura, donde los niveles más altos de ferritina en el LCR ventricular se asociaron con un tamaño de ventrículo5 más grande.
En este estudio, desarrollamos un modelo clínicamente relevante de lesión cerebral inducida por IVH e hidrocefalia utilizando inyección de hemoglobina en los ventrículos cerebrales, lo que permite la cuantificación de la lesión cerebral y la PHH y la prueba de nuevas estrategias terapéuticas (Figura 1)6, 7. Este modelo de IVH utiliza cachorros de rata neonatal, que se colocan bajo anestesia general durante la duración del procedimiento. Se realiza una incisión en la línea media en el cuero cabelludo y se utilizan coordenadas derivadas de los puntos de referencia del cráneo, el bregma o lambda, para apuntar a los ventrículos laterales para la inyección. La inyección lenta con una bomba de infusión libera hemoglobina en el ventrículo. Este protocolo es fácil de usar, versátil y puede modelar diferentes componentes de IVH que resultan en PHH.

<table><tbody><tr><td>Jeringa de insulina de 0,3 mL BD</td><td>Microfine + Jeringa de insulina</td><td>230-4533</td> Las <td>jeringas de 0,3-0,5 mL funcionarán</td></tr><tr><td>Microtubo de 1,5 mL</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5500</td><td>Nº de lote K194642H -3 511</td></tr><tr><td>4.7T Resonancia magnética</td><td>Agilent/Varian</td><td>4.7T/33 cm</td><td>Agilent/Varian Sistema de resonancia magnética DirectDrive 4.7-T (200-MHz)</td></tr><tr><td>6-0 sutura monofilamento</td><td>ETHICON</td><td>667G</td><td></td></tr><tr><td>9.4T Resonancia magnética</td><td>Bruker</td><td>BioSpec 94/20</td><td>Utilizado en este protocolo sin la criosonda</td></tr><tr><td>Balanza analítica</td><td>CCURIS Instruments</td><td>W3200-320</td><td></td></tr><tr><td>CSF artificial (aCSF)</td><td>Tocris Bioscience</td><td>3525</td><td>Nº de lote: 72A</td></tr><tr><td>Betadine</td><td>Purdue Products L.P.</td><td>301005-00</td><td>NDC 67618-150-09</td></tr><tr><td>Carprofeno (inyectable)</td><td>Zoetis Inc.&nbsp;</td><td>PI 4019448</td><td>Rimadyl</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Decon Laboratories</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>Almohadilla térmica</td><td>Sunbeam</td><td>E12107-819</td><td>UL 612A, Z-1228-001</td></tr><tr><td>Hemoglobina</td><td>MP Biomedicals</td><td>100714</td><td>LOTE NO. SR02321</td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Piramal Cuidados críticos</td><td>NDC 66794-017-25</td><td></td></tr><tr><td>Vaporizador de isoflurano</td><td>VETEQUIP</td><td>911103</td><td></td></tr><tr><td>Luz para el aislamiento estereotáxico</td><td>Dolan-Jenner</td><td>industries Fiber-Lite MI-150</td><td></td></tr><tr><td>Bomba de jeringa de microinyección</td><td>World Precision Instruments</td><td>MICRO21</td><td>Serial 184034 T08K</td></tr><tr><td>software de resonancia magnética</td><td>Bruker BioSpin</td><td>Paravision 360 3.2</td><td></td></tr><tr><td>Oxígeno</td><td>Airgas Healthcare</td><td>UN1072</td><td>NÚMERO DE LOTE S1432080XA02</td></tr><tr><td>Ratas</td> <td>Sprague DawleyCharles River Laboratories</td><td>Código de cepa: 001</td><td></td></tr><tr><td>Instrumento estereotáctico</td><td>Instrumentos KOPF Modelo</td><td>900LS Lazy Susan</td><td></td></tr><tr><td>Aplicador estéril con punta de algodón</td><td>Fischerbrand</td><td>23-400-118</td><td></td></tr><tr><td>Cuchilla quirúrgica</td><td>covetrus</td><td>#10</td><td></td></tr><tr><td>Triple antibiótico tópico</td><td>Pomada antibiótica triple NDC</td><td>51672-2120-1</td><td></td></tr><tr><td>software de cuantificación del volumen ventricular</td><td>ITK-SNAP</td><td>ITK-SNAP 4.0.0 beta</td><td></td></tr></tbody></table>

modelado de hemorragia intraventricular neonatal a través de la inyección intraventricular de hemoglobina

Modeling Neonatal Intraventricular Hemorrhage Through Intraventricular Injection of Hemoglobin

La hemorragia intraventricular neonatal (Hiv) es una consecuencia común del nacimiento prematuro y conduce a lesión cerebral, hidrocefalia poshemorrágica (HPH) y déficits neurológicos de por vida. Si bien la PHH se puede tratar mediante procedimientos de derivación temporal y permanente del líquido cefalorraquídeo (LCR) (reservorio ventricular y derivación ventriculoperitoneal, respectivamente), no existen estrategias farmacológicas para prevenir o tratar la lesión cerebral inducida por la hemorragia intraventricular y la hidrocefalia. Se necesitan modelos animales para comprender mejor la fisiopatología de la hemorragia intraventricular y probar tratamientos farmacológicos. Si bien existen modelos de Hiv neonatal, aquellos que resultan confiablemente en hidrocefalia a menudo están limitados por la necesidad de inyecciones de gran volumen, lo que puede complicar el modelado de la patología o introducir variabilidad en el fenotipo clínico observado.
Estudios clínicos recientes han implicado a la hemoglobina y la ferritina en causar agrandamiento ventricular después de la hemorragia intraventricular. Aquí, desarrollamos un modelo animal sencillo que imita el fenotipo clínico de PHH utilizando inyecciones intraventriculares de pequeño volumen del producto de degradación sanguínea hemoglobina. Además de inducir de manera confiable el agrandamiento ventricular y la hidrocefalia, este modelo produce lesiones en la sustancia blanca, inflamación e infiltración de células inmunes en regiones periventriculares y de la sustancia blanca. Este artículo describe este método simple y clínicamente relevante para modelar la HPH-IVH en ratas neonatas mediante inyección intraventricular y presenta métodos para cuantificar el tamaño del ventrículo después de la inyección.

El éxito de la inyección se confirmó por medios radiológicos e inmunohistoquímicos. Los animales que se sometieron a inyección de hemoglobina desarrollaron ventriculomegalia aguda moderada cuando se evaluaron mediante resonancia magnética (Figura 2A), con ventrículos laterales significativamente más grandes a las 24 h y 72 h después de la inyección de hemoglobina en comparación con los animales inyectados en LCR (Figura 2B, C). Si bien no hubo d...

Presentamos un modelo de hemorragia intraventricular neonatal utilizando crías de rata que imita la patología observada en humanos.

Modelado de hemorragia intraventricular neonatal a través de la inyección intraventricular de hemoglobina

Neonatal intraventricular hemorrhage (IVH) is a common consequence of premature birth and leads to brain injury, posthemorrhagic hydrocephalus (PHH), and ...

Este protocolo es significativo porque desarrollamos un modelo clínicamente relevante de lesión cerebral inducida por hemorragia intraventricular e hidrocefalia, utilizando la inyección de hemoglobina en los ventrículos, lo que permite la posterior cuantificación de los volúmenes de ventrículos en la aplicación, para probar nuevas estrategias terapéuticas. La principal ventaja de esta técnica es que permite el estudio de la patología de la hemorragia intraventricular que está específicamente mediada por la hemoglobina y los productos de degradación sanguínea de la vía del hierro. Esta técnica también es fácil de usar y versátil.Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el desarrollo de terapias para la hidrocefalia posthemorrágica, ya que permite una mayor comprensión de la fisiopatología de la hemorragia intraventricular y la valoración de estrategias de tratamiento clínicamente relevantes para la prevención de secuelas neurológicas después de la hemorragia intraventricular. Demostrando el procedimiento estará Sruthi Ramagiri, un post-doc asociado del Laboratorio de Australia. Para comenzar, coloque la rata anestesiada propensa en el aparato estereotáctico con la nariz colocada en el adaptador de anestesia.Luego asegure la cabeza apretando las barras auditivas sin ruptura en el meato auditivo externo. Para limpiar la cabeza, primero toque un aplicador estéril con punta de algodón empapado en Betadine en el centro de la cabeza y muévase hacia afuera para extender el Betadine en círculos. Luego repita el proceso con un aplicador empapado en etanol al 70%.A continuación, usando un bisturí, haga una incisión de 0,3 centímetros verticalmente por el centro de la cabeza para exponer el bregma del cráneo. Luego seque el área con un aplicador con punta de algodón. Para configurar el inyector estereotáctico, extraiga la solución de hemoglobina previamente preparada en una jeringa de 0,3 o 0,5 mililitros, y coloque la jeringa en el sistema de inyección estereotáctica.A continuación, encienda la interfaz del inyector estereotáctico y haga clic en el botón de configuración para ingresar el volumen de inyección y la configuración de la velocidad. Haga clic en volumen y establezca el volumen en 20, 000 nanolitros. Luego haga clic en la velocidad de infusión y establezca la velocidad en 8, 000 nanolitros por minuto.Haga clic en el botón de restablecimiento de posición para salir de la configuración. Enjuague la punta de la aguja haciendo clic en el botón de infusión hasta que aparezca una pequeña gota de hemoglobina en la punta de la aguja, luego use un aplicador con punta de algodón para quitar suavemente la cuenta. Para comenzar la inyección en el animal, establezca el bregma como cero en el sistema de inyección estereotáctica ajustando las posiciones mediolateral y anteroposterior de la jeringa.Luego baje la aguja de la jeringa para tocar suavemente el cráneo en el bregma. Después de identificar las coordenadas de elección, levante la aguja de la jeringa un centímetro por encima del cráneo para despejar el cuero cabelludo. Establezca las coordenadas mediolateral y anteroposterior.Luego baje la jeringa para que la aguja toque suavemente el cráneo y establezca la coordenada dorsoventral durante 30 segundos. Una vez que se hayan establecido las coordenadas, comience la inyección haciendo clic en el botón de ejecución en la interfaz del inyector estereotáctico. Una vez finalizada la inyección, deje la aguja en su lugar durante dos minutos para minimizar el reflujo de la solución.A continuación, retire lentamente la jeringa a lo largo de la coordenada dorsoventral durante dos minutos, hasta que la punta de la aguja esté dos centímetros por encima del cuero cabelludo. Luego gire el brazo inyector estereotáctico lejos del campo operatorio y cierre el cuero cabelludo con una sutura de monofilamento 6-O. Para la resonancia magnética, realice imágenes ponderadas en T2 seleccionando una secuencia de eco de giro rápido ponderada en T2.Después de configurar los parámetros de resonancia magnética como se describe en el texto, haga clic en el botón continuar para iniciar la secuencia. Para el procesamiento de imágenes y el análisis del volumen cerebral, abra los datos ponderados T2 nativos en el software de segmentación. Para delinear manualmente los ventrículos laterales, haga clic en el modo de pincel y seleccione el estilo de pincel cuadrado, luego ajuste el tamaño del pincel a uno.A continuación, haga clic en el inspector de diseño, seleccione la vista axial y haga clic en zoom para ajustar. Luego coloque el cursor sobre la imagen y trace y llene el espacio del ventrículo lateral. Finalmente, haga clic en segmentación en la barra de herramientas, seguido de volumen y estadísticas para ver los volúmenes segmentados.Los animales que se sometieron a inyección de hemoglobina desarrollaron ventriculomegalia moderada cuando se evaluaron mediante resonancia magnética. Con ventrículos laterales significativamente más grandes a las 24 horas y 72 horas después de la inyección de hemoglobina, en comparación con los animales inyectados con ACSF. Aunque la diferencia en el volumen ventricular lateral entre los dos grupos de ratas no fue significativa después de 38 días, las imágenes por resonancia magnética demostraron que el 44% de las ratas que recibieron hemoglobina todavía tenían ventriculomegalia no resuelta.Además, en comparación con ACSF, la inyección de hemoglobina resultó en una disminución significativa en el volumen de sustancia blanca después de 38 días. La hemoglobina también promovió una respuesta inflamatoria in vivo, como lo demuestra el nivel significativamente más alto del factor de necrosis tumoral alfa de citoquinas proinflamatorias después de inyectar hemoglobina, pero no solución salina o sangre entera. Además, la tinción inmunohistoquímica de la proteína ácida fibrilar glial reveló una activación significativamente mayor de los astrocitos después de la inyección de hemoglobina que después de la inyección de ACSF.Lo más importante que debe recordar al intentar este procedimiento es establecer las coordenadas de inyección correctas para garantizar el suministro de hemoglobina en los ventrículos laterales. Después de este procedimiento, los trazadores del LCR se pueden administrar en el espacio del LCR para evaluar los cambios en la circulación del LCR y los patrones de eflujo después de la Hiv. Este método adicional aborda cómo se altera el flujo de LCR en la HPH IVH.

modeling-neonatal-intraventricular-hemorrhage-through

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

El modelo de inyección de sangre autóloga de la hemorragia intracerebral en ratones descritos en este protocolo se utiliza la técnica de doble inyección para minimizar el riesgo de reflujo de sangre hasta el trayecto de la aguja, no los anticoagulantes en el sistema de bombeo, y elimina todo el espacio muerto y el tubo extensible en el sistema.

Inyección de sangre autóloga al modelo hemorragia intracerebral espontánea en ratones

Modelos animales clínicamente relevante de hemorragia intracerebral (HIC) son necesarios para profundizar en el conocimiento de accidente cerebrovascular hemorrágico y examinar nuevas estrategias terapéuticas. En este estudio, se describe y evaluar dos modelos que implementan ICH inyecciones unilaterales de sangre autóloga o bien total o colagenasa bacteriana en los ganglios basales (corpus striatum) de ratones.

Modelado Hemorragia intracerebral en ratones: La inyección de sangre autóloga o colagenasa bacteriana

Este video muestra un método para generar un modelo de hemorragia intraventricular neonatal en ratas. En este procedimiento, se inyecta hemoglobina a una cría de rata anestesiada en el ventrículo lateral del cerebro. La hemoglobina provoca estrés oxidativo y libera hemo, simulando una hemorragia intraventricular. El daño resultante a los tejidos cerebrales, impulsado por especies reactivas de oxígeno y citocinas inflamatorias, conduce al agrandamiento ventricular, una consecuencia común de la...

Modelado de la hemorragia intraventricular neonatal mediante inyección intraventricular de hemoglobina

Se utilizan modelos preclínicos de hemorragia intracerebral para imitar ciertos aspectos de la enfermedad clínica. Por lo tanto, se pueden explorar los mecanismos de lesión y las posibles estrategias terapéuticas. En este protocolo se describen dos modelos de hemorragia intracerebral, inyecciones intraestriadas (ganglios basales) de sangre autóloga o colagenasa.

Inyección intraestriatal de sangre autóloga o clostridial colagenasa como modelos murinos de la hemorragia intracerebral

Los modelos animales de enfermedad pediátrica pueden experimentar aparición temprana y progresión de la enfermedad agresiva. Clínicamente entrega terapia pertinente a jóvenes modelos de ratón puede ser técnicamente difícil. Este protocolo describe un método de inyección intravenosa no invasivo para ratones recién nacidos dentro de los dos primeros días después del parto de la vida.

Las inyecciones intravenosas en ratones recién nacidos

Aquí, describimos un método simple de inyección intracerebroventricular e intravascular de partículas virales o microperlas fluorescentes en el cerebro de ratón neonatal. El patrón de localización del virus y las nanopartículas podría detectarse mediante evaluación microscópica o mediante hibridación in situ.

Intracerebroventricular y por inyección intravascular de partículas víricas y fluorescentes microperlas en el cerebro neonatal

Presentamos un protocolo para establecer un modelo masivo de la hemorragia del pontine en una rata vía la inyección dual de la sangre autóloga.

Hemorragia pontina masiva por inyección dual de sangre autóloga

La monitorización de la presión intracraneal en modelos roedores de hemorragia intraventricular no traumática no es común en la literatura actual. En este documento, demostramos una técnica para medir la presión intracraneal, la presión arterial media y la presión de perfusión cerebral durante la hemorragia intraventricular en un modelo animal de rata.

Monitorización de la presión intracraneal en un modelo de roedor con hemorragia intraventricular no traumática

Este artículo tiene como objetivo proporcionar a los investigadores una guía detallada y accesible para establecer un modelo porcino infantil de shock hemorrágico.

Descripción de un modelo de lactante porcino de shock hemorrágico controlado por volumen

Este protocolo tiene como objetivo demostrar una vía de administración venosa reproducible que pueda ser utilizada en ratas y ratones durante todo el período neonatal. Este procedimiento es importante para los estudios preclínicos en roedores que desean reflejar la administración de fármacos en las unidades de cuidados neonatales, principalmente mediante la administración intravenosa.

Un modelo neonatal de inyección venosa retroorbitaria en roedores

La hidrocefalia poshemorrágica del prematuro (PHHP, por sus siglas en inglés) se puede modelar en ratas neonatas mediante la combinación de corioamnionitis y hemorragia intraventricular. La combinación de estos eventos prenatales y postnatales recapitula con precisión las características clínicas distintivas de la PHHP, incluida la macrocefalia, la ventriculomegalia y la presión intracraneal elevada, a lo largo de la vida.

Modelización de la hidrocefalia poshemorrágica de la prematuridad en ratas

Aprende a modelar hemorragia intraventricular neonatal mediante inyección intraventricular de hemoglobina en ratas neonatales. Este método permite estudiar la hidrocefalia posthemorrágica y evaluar nuevas estrategias terapéuticas.

Modelado de hemorragia intraventricular neonatal a través de la inyección intraventricular de hemoglobina

Explorar más videos