Modelado de hemorragia intraventricular neonatal a través de la inyección intraventricular de hemoglobina

Este protocolo es significativo porque desarrollamos un modelo clínicamente relevante de lesión cerebral inducida por hemorragia intraventricular e hidrocefalia, utilizando la inyección de hemoglobina en los ventrículos, lo que permite la posterior cuantificación de los volúmenes de ventrículos en la aplicación, para probar nuevas estrategias terapéuticas. La principal ventaja de esta técnica es que permite el estudio de la patología de la hemorragia intraventricular que está específicamente mediada por la hemoglobina y los productos de degradación sanguínea de la vía del hierro. Esta técnica también es fácil de usar y versátil.

Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el desarrollo de terapias para la hidrocefalia posthemorrágica, ya que permite una mayor comprensión de la fisiopatología de la hemorragia intraventricular y la valoración de estrategias de tratamiento clínicamente relevantes para la prevención de secuelas neurológicas después de la hemorragia intraventricular. Demostrando el procedimiento estará Sruthi Ramagiri, un post-doc asociado del Laboratorio de Australia. Para comenzar, coloque la rata anestesiada propensa en el aparato estereotáctico con la nariz colocada en el adaptador de anestesia.

Luego asegure la cabeza apretando las barras auditivas sin ruptura en el meato auditivo externo. Para limpiar la cabeza, primero toque un aplicador estéril con punta de algodón empapado en Betadine en el centro de la cabeza y muévase hacia afuera para extender el Betadine en círculos. Luego repita el proceso con un aplicador empapado en etanol al 70%.

A continuación, usando un bisturí, haga una incisión de 0,3 centímetros verticalmente por el centro de la cabeza para exponer el bregma del cráneo. Luego seque el área con un aplicador con punta de algodón. Para configurar el inyector estereotáctico, extraiga la solución de hemoglobina previamente preparada en una jeringa de 0,3 o 0,5 mililitros, y coloque la jeringa en el sistema de inyección estereotáctica.

A continuación, encienda la interfaz del inyector estereotáctico y haga clic en el botón de configuración para ingresar el volumen de inyección y la configuración de la velocidad. Haga clic en volumen y establezca el volumen en 20, 000 nanolitros. Luego haga clic en la velocidad de infusión y establezca la velocidad en 8, 000 nanolitros por minuto.

Haga clic en el botón de restablecimiento de posición para salir de la configuración. Enjuague la punta de la aguja haciendo clic en el botón de infusión hasta que aparezca una pequeña gota de hemoglobina en la punta de la aguja, luego use un aplicador con punta de algodón para quitar suavemente la cuenta. Para comenzar la inyección en el animal, establezca el bregma como cero en el sistema de inyección estereotáctica ajustando las posiciones mediolateral y anteroposterior de la jeringa.

Luego baje la aguja de la jeringa para tocar suavemente el cráneo en el bregma. Después de identificar las coordenadas de elección, levante la aguja de la jeringa un centímetro por encima del cráneo para despejar el cuero cabelludo. Establezca las coordenadas mediolateral y anteroposterior.

Luego baje la jeringa para que la aguja toque suavemente el cráneo y establezca la coordenada dorsoventral durante 30 segundos. Una vez que se hayan establecido las coordenadas, comience la inyección haciendo clic en el botón de ejecución en la interfaz del inyector estereotáctico. Una vez finalizada la inyección, deje la aguja en su lugar durante dos minutos para minimizar el reflujo de la solución.

A continuación, retire lentamente la jeringa a lo largo de la coordenada dorsoventral durante dos minutos, hasta que la punta de la aguja esté dos centímetros por encima del cuero cabelludo. Luego gire el brazo inyector estereotáctico lejos del campo operatorio y cierre el cuero cabelludo con una sutura de monofilamento 6-O. Para la resonancia magnética, realice imágenes ponderadas en T2 seleccionando una secuencia de eco de giro rápido ponderada en T2.

Después de configurar los parámetros de resonancia magnética como se describe en el texto, haga clic en el botón continuar para iniciar la secuencia. Para el procesamiento de imágenes y el análisis del volumen cerebral, abra los datos ponderados T2 nativos en el software de segmentación. Para delinear manualmente los ventrículos laterales, haga clic en el modo de pincel y seleccione el estilo de pincel cuadrado, luego ajuste el tamaño del pincel a uno.

A continuación, haga clic en el inspector de diseño, seleccione la vista axial y haga clic en zoom para ajustar. Luego coloque el cursor sobre la imagen y trace y llene el espacio del ventrículo lateral. Finalmente, haga clic en segmentación en la barra de herramientas, seguido de volumen y estadísticas para ver los volúmenes segmentados.

Los animales que se sometieron a inyección de hemoglobina desarrollaron ventriculomegalia moderada cuando se evaluaron mediante resonancia magnética. Con ventrículos laterales significativamente más grandes a las 24 horas y 72 horas después de la inyección de hemoglobina, en comparación con los animales inyectados con ACSF. Aunque la diferencia en el volumen ventricular lateral entre los dos grupos de ratas no fue significativa después de 38 días, las imágenes por resonancia magnética demostraron que el 44% de las ratas que recibieron hemoglobina todavía tenían ventriculomegalia no resuelta.

Además, en comparación con ACSF, la inyección de hemoglobina resultó en una disminución significativa en el volumen de sustancia blanca después de 38 días. La hemoglobina también promovió una respuesta inflamatoria in vivo, como lo demuestra el nivel significativamente más alto del factor de necrosis tumoral alfa de citoquinas proinflamatorias después de inyectar hemoglobina, pero no solución salina o sangre entera. Además, la tinción inmunohistoquímica de la proteína ácida fibrilar glial reveló una activación significativamente mayor de los astrocitos después de la inyección de hemoglobina que después de la inyección de ACSF.

Lo más importante que debe recordar al intentar este procedimiento es establecer las coordenadas de inyección correctas para garantizar el suministro de hemoglobina en los ventrículos laterales. Después de este procedimiento, los trazadores del LCR se pueden administrar en el espacio del LCR para evaluar los cambios en la circulación del LCR y los patrones de eflujo después de la Hiv. Este método adicional aborda cómo se altera el flujo de LCR en la HPH IVH.