Cuantificación de la distribución de glucógeno subcelular en fibras musculares esqueléticas mediante microscopía electrónica de transmisión

La medida del contenido de glucógeno en células individuales y organizaciones subcelulares es importante porque en la mayoría de los tipos de células, las células individuales se adaptan de manera diferente a las condiciones fisiológicas y enfermedades cambiantes. Por lo tanto, la principal ventaja de esta técnica es la muy alta resolución en el microscopio electrónico de transmisión. Esto mejora la posibilidad de tener estructuras subcelulares localizadas y también en este contenido en esta técnica aquí, es importante que la tinción de glucógeno esté libre de anticuerpos.

Por lo tanto, no tenemos ninguna especificidad de la que preocuparnos. Para obtener un mejor contraste en el glucógeno, simplemente use ferrocianuro de potasio 1.5% en lugar de ferrocianuro de potasio. Prepare 1,6 mililitros de la solución fijadora primaria añadiendo glutaraldehído al 2,5% en tampón de cacodilato de sodio 0,1 molar en un tubo de microcentrificación de dos mililitros.

Guárdelo a cinco grados centígrados durante un máximo de 14 días. Aislar una muestra pequeña de la biopsia muscular o de todo el músculo que tiene un diámetro máximo de un milímetro en cualquier dirección y es más largo longitudinalmente que la sección transversal. Coloque la muestra en el tubo que contiene la solución de fijación primaria fría.

Guárdelo a cinco grados centígrados durante 24 horas. Luego lave la muestra cuatro veces en tampón de cacodilato de sodio molar 0.1. Usando pipetas de transferencia, retire el tampón usado del tubo dejando la muestra intacta y agregue el tampón fresco.

Después de fijar la muestra con tetróxido de osmio al 1% y ferrocianuro de potasio al 1,5% en tampón de cacodilato de sodio molar 0,1 durante 120 minutos a cuatro grados centígrados. Enjuague la muestra dos veces en agua destilada doble a temperatura ambiente. Deshidrata sumergiéndote en una serie graduada de etanol a temperatura ambiente.

Infiltrar la muestra con óxido de propileno y mezclas graduadas de resina eposídica a temperatura ambiente utilizando las proporciones de volumen mencionadas. Al día siguiente, incrusta especímenes en resina eposídica 100% fresca en moldes y polimeriza a 60 grados centígrados durante 48 horas. Monte el bloque de un espécimen en el soporte del ultramicrotomo.

Recorte el bloque en la superficie con una cuchilla de afeitar para alcanzar el nivel del tejido. Monte un cuchillo de diamante delante de la muestra y alinee la superficie de la muestra paralela al cuchillo. Produzca una sección semifina de un grosor de un micrómetro con el cuchillo de diamante para verificar la orientación de la muestra.

Manche la sección semifina con azul toluidina para observación con microscopía de luz. Luego recorte el bloque aún más para reducir el área de interés para obtener secciones ultradelgadas adecuadas. Corte secciones ultrafinas de 60 a 70 nanómetros de espesor con un segundo cuchillo de diamante.

Recoge una o dos secciones en una rejilla de cobre entera usando un bucle perfecto. Para contrastar las secciones, sumerja las rejillas en solución de acetato de uranilo durante 20 minutos y lave las rejillas en agua destilada doble y luego sumerja las rejillas en citrato de plomo durante 15 minutos y vuelva a lavar las rejillas en agua destilada doble. Encienda la computadora de microscopio electrónico de transmisión y el software de grabación de imágenes, grabe imágenes digitales con una cámara CCD de escaneo lento digital y el software de imágenes asociado.

Después de insertar la rejilla con múltiples secciones en la etapa del microscopio, examine la rejilla inicialmente a bajo aumento para elegir las secciones de mejor calidad y determinar la dirección de las fibras musculares. A continuación, enfoque, la imagen a un aumento superior a 30, 000 con el haz centrado en una fibra periférica en la sección y grabe imágenes con un segundo de tiempo de exposición en el aumento deseado. Asegúrese de que las imágenes se distribuyan a lo largo y ancho de la fibra en un orden sistemático de bot aleatorio para obtener resultados imparciales y repetir la imagen hasta que se tomen imágenes de seis a 10 fibras.

Importe imágenes a la imagen J haciendo clic en el archivo seguido de abrir. Establezca la escala global para que coincida con el tamaño original de la imagen haciendo clic en analizar y luego establecer la escala. Para ampliar al 100%, haga clic en la imagen, vaya a zoom y haga clic en entrar.

Mida el grosor de un disco Z por imagen del espacio miofibrilar utilizando la herramienta de línea recta del menú de herramientas y calcule el grosor promedio del disco Z de cada una de las seis a 10 fibras. Utilice la herramienta de línea segmentada para medir la longitud de la miofibrilla más externa visible justo debajo de la región subesarcolema. Para insertar una cuadrícula, haga clic en analizar, seleccione herramientas y luego seleccione cuadrícula.

Ahora establezca el área por punto en 32, 400 nanómetros cuadrados. Cuente el número de aciertos dentro de la longitud disponible en las 12 imágenes subsarcolemmales donde una cruz golpea el glucógeno subsarcolemmal. Inserte una cuadrícula haciendo clic en analizar, luego seleccione herramientas, seguido de cuadrícula y establezca el área por punto en 160, 000 nanómetros cuadrados.

Cuente el número de aciertos en las 12ª imágenes miofibrilares donde una cruz golpea el espacio intramiofibrilar. Por otra parte, para insertar una cuadrícula, haga clic en analizar, seleccione herramientas y luego seleccione cuadrícula. Ahora establezca el área por punto en 3, 600 nanómetros cuadrados.

Cuente el número de aciertos en las 12ª imágenes miofibrilares donde una cruz golpea el glucógeno intramiofibrilar. Inserte una cuadrícula haciendo clic en analizar, luego seleccione herramientas, seguido de cuadrícula y establezca el área por punto en 32, 400 nanómetros cuadrados. Cuente el número de golpes en las 12ª imágenes miofibrilares donde una cruz golpea el glucógeno intermiofibrilar.

Usando la cuadrícula de 32, 400 nanómetros cuadrados para elegir aleatoriamente las partículas de glucógeno, comience con el cuadrado superior izquierdo y muévase a la izquierda si es necesario. Usando la herramienta de línea recta, mida el diámetro de cinco partículas de glucógeno elegidas al azar de cada grupo para cada una de las 12 imágenes para obtener un promedio de 60 partículas por grupo por fibra. Esta figura muestra los valores normales de las tres piscinas de glucógeno.

Se puede observar que los valores de glucógeno intermiofibrilar se distribuyen cerca de lo normal, mientras que tanto el glucógeno intramiofibrilar como el subsarcolemado muestran una distribución sesgada donde las fibras a veces tienen una cantidad excesiva de glucógeno. Entre todos los pasos es muy importante usar ferrocianuro de potasio. El análisis de glucógeno se puede combinar con el análisis de mitocondrias y gotas lipídicas que pueden mejorar nuestra comprensión de cómo otros componentes metabólicos clave se correlacionan con el glucógeno y la salud muscular.