Cuantificación de la distribución de glucógeno subcelular en fibras musculares esqueléticas mediante microscopía electrónica de transmisión
7 de febrero de 2022
Un procedimiento modificado posterior a la fijación aumenta el contraste de las partículas de glucógeno en el tejido. Este documento proporciona un protocolo paso a paso que describe cómo manejar el tejido, realizar las imágenes y utilizar métodos estereológicos para obtener datos imparciales y cuantitativos sobre la distribución de glucógeno subcelular específico del tipo de fibra en el músculo esquelético.
La medida del contenido de glucógeno en células individuales y organizaciones subcelulares es importante porque en la mayoría de los tipos de células, las células individuales se adaptan de manera diferente a las condiciones fisiológicas y enfermedades cambiantes. Por lo tanto, la principal ventaja de esta técnica es la muy alta resolución en el microscopio electrónico de transmisión. Esto mejora la posibilidad de tener estructuras subcelulares localizadas y también en este contenido en esta técnica aquí, es importante que la tinción de glucógeno esté libre de anticuerpos.
Por lo tanto, no tenemos ninguna especificidad de la que preocuparnos. Para obtener un mejor contraste en el glucógeno, simplemente use ferrocianuro de potasio 1.5% en lugar de ferrocianuro de potasio. Prepare 1,6 mililitros de la solución fijadora primaria añadiendo glutaraldehído al 2,5% en tampón de cacodilato de sodio 0,1 molar en un tubo de microcentrificación de dos mililitros.
Guárdelo a cinco grados centígrados durante un máximo de 14 días. Aislar una muestra pequeña de la biopsia muscular o de todo el músculo que tiene un diámetro máximo de un milímetro en cualquier dirección y es más largo longitudinalmente que la sección transversal. Coloque la muestra en el tubo que contiene la solución de fijación primaria fría.
Guárdelo a cinco grados centígrados durante 24 horas. Luego lave la muestra cuatro veces en tampón de cacodilato de sodio molar 0.1. Usando pipetas de transferencia, retire el tampón usado del tubo dejando la muestra intacta y agregue el tampón fresco.
Después de fijar la muestra con tetróxido de osmio al 1% y ferrocianuro de potasio al 1,5% en tampón de cacodilato de sodio molar 0,1 durante 120 minutos a cuatro grados centígrados. Enjuague la muestra dos veces en agua destilada doble a temperatura ambiente. Deshidrata sumergiéndote en una serie graduada de etanol a temperatura ambiente.
Infiltrar la muestra con óxido de propileno y mezclas graduadas de resina eposídica a temperatura ambiente utilizando las proporciones de volumen mencionadas. Al día siguiente, incrusta especímenes en resina eposídica 100% fresca en moldes y polimeriza a 60 grados centígrados durante 48 horas. Monte el bloque de un espécimen en el soporte del ultramicrotomo.
Recorte el bloque en la superficie con una cuchilla de afeitar para alcanzar el nivel del tejido. Monte un cuchillo de diamante delante de la muestra y alinee la superficie de la muestra paralela al cuchillo. Produzca una sección semifina de un grosor de un micrómetro con el cuchillo de diamante para verificar la orientación de la muestra.
Manche la sección semifina con azul toluidina para observación con microscopía de luz. Luego recorte el bloque aún más para reducir el área de interés para obtener secciones ultradelgadas adecuadas. Corte secciones ultrafinas de 60 a 70 nanómetros de espesor con un segundo cuchillo de diamante.
Recoge una o dos secciones en una rejilla de cobre entera usando un bucle perfecto. Para contrastar las secciones, sumerja las rejillas en solución de acetato de uranilo durante 20 minutos y lave las rejillas en agua destilada doble y luego sumerja las rejillas en citrato de plomo durante 15 minutos y vuelva a lavar las rejillas en agua destilada doble. Encienda la computadora de microscopio electrónico de transmisión y el software de grabación de imágenes, grabe imágenes digitales con una cámara CCD de escaneo lento digital y el software de imágenes asociado.
Después de insertar la rejilla con múltiples secciones en la etapa del microscopio, examine la rejilla inicialmente a bajo aumento para elegir las secciones de mejor calidad y determinar la dirección de las fibras musculares. A continuación, enfoque, la imagen a un aumento superior a 30, 000 con el haz centrado en una fibra periférica en la sección y grabe imágenes con un segundo de tiempo de exposición en el aumento deseado. Asegúrese de que las imágenes se distribuyan a lo largo y ancho de la fibra en un orden sistemático de bot aleatorio para obtener resultados imparciales y repetir la imagen hasta que se tomen imágenes de seis a 10 fibras.
Importe imágenes a la imagen J haciendo clic en el archivo seguido de abrir. Establezca la escala global para que coincida con el tamaño original de la imagen haciendo clic en analizar y luego establecer la escala. Para ampliar al 100%, haga clic en la imagen, vaya a zoom y haga clic en entrar.
Mida el grosor de un disco Z por imagen del espacio miofibrilar utilizando la herramienta de línea recta del menú de herramientas y calcule el grosor promedio del disco Z de cada una de las seis a 10 fibras. Utilice la herramienta de línea segmentada para medir la longitud de la miofibrilla más externa visible justo debajo de la región subesarcolema. Para insertar una cuadrícula, haga clic en analizar, seleccione herramientas y luego seleccione cuadrícula.
Ahora establezca el área por punto en 32, 400 nanómetros cuadrados. Cuente el número de aciertos dentro de la longitud disponible en las 12 imágenes subsarcolemmales donde una cruz golpea el glucógeno subsarcolemmal. Inserte una cuadrícula haciendo clic en analizar, luego seleccione herramientas, seguido de cuadrícula y establezca el área por punto en 160, 000 nanómetros cuadrados.
Cuente el número de aciertos en las 12ª imágenes miofibrilares donde una cruz golpea el espacio intramiofibrilar. Por otra parte, para insertar una cuadrícula, haga clic en analizar, seleccione herramientas y luego seleccione cuadrícula. Ahora establezca el área por punto en 3, 600 nanómetros cuadrados.
Cuente el número de aciertos en las 12ª imágenes miofibrilares donde una cruz golpea el glucógeno intramiofibrilar. Inserte una cuadrícula haciendo clic en analizar, luego seleccione herramientas, seguido de cuadrícula y establezca el área por punto en 32, 400 nanómetros cuadrados. Cuente el número de golpes en las 12ª imágenes miofibrilares donde una cruz golpea el glucógeno intermiofibrilar.
Usando la cuadrícula de 32, 400 nanómetros cuadrados para elegir aleatoriamente las partículas de glucógeno, comience con el cuadrado superior izquierdo y muévase a la izquierda si es necesario. Usando la herramienta de línea recta, mida el diámetro de cinco partículas de glucógeno elegidas al azar de cada grupo para cada una de las 12 imágenes para obtener un promedio de 60 partículas por grupo por fibra. Esta figura muestra los valores normales de las tres piscinas de glucógeno.
Se puede observar que los valores de glucógeno intermiofibrilar se distribuyen cerca de lo normal, mientras que tanto el glucógeno intramiofibrilar como el subsarcolemado muestran una distribución sesgada donde las fibras a veces tienen una cantidad excesiva de glucógeno. Entre todos los pasos es muy importante usar ferrocianuro de potasio. El análisis de glucógeno se puede combinar con el análisis de mitocondrias y gotas lipídicas que pueden mejorar nuestra comprensión de cómo otros componentes metabólicos clave se correlacionan con el glucógeno y la salud muscular.
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Visión general
Este estudio presenta un procedimiento modificado de post-fijación que mejora el contraste de las partículas de glucógeno en el tejido. El protocolo detalla el manejo del tejido, las técnicas de imagen y los métodos estereológios para cuantificar la distribución de glucógeno en el músculo esquelético.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología celular
- Histología
Fundamentos
- La medición del contenido de glucógeno es crucial para comprender las respuestas celulares a los cambios fisiológicos.
- Las células individuales exhiben adaptaciones variadas a condiciones y enfermedades.
- Las imágenes de alta resolución son esenciales para observar estructuras subcelulares.
- La técnica evita problemas de especificidad al usar tinción de glucógeno libre de anticuerpos.
Propósito del estudio
- Mejorar el contraste de las partículas de glucógeno en muestras de tejido.
- Proporcionar un protocolo detallado para la obtención de imágenes y análisis.
- Obtener datos imparciales sobre la distribución de glucógeno en el músculo esquelético.
Métodos utilizados
- Procedimiento modificado de post-fijación con ferrocianuro de potasio.
- Preparación de solución fijadora usando glutaraldehído y tampón de cacodilato de sodio.
- Microscopía electrónica de transmisión para imágenes de alta resolución.
- Métodos estereológios para análisis cuantitativo.
Resultados principales
- Se logró un contraste mejorado de las partículas de glucógeno.
- El protocolo permite una obtención de imágenes precisa de estructuras subcelulares.
- Se demostró una cuantificación imparcial de la distribución de glucógeno.
- La técnica es aplicable a varios tipos de tejido.
Conclusiones
- El procedimiento modificado mejora significativamente la visualización del glucógeno.
- Proporciona un método confiable para estudiar el glucógeno en el músculo esquelético.
- Facilita una mejor comprensión de las adaptaciones celulares.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
This TEM-based glycogen quantification method enables high-resolution subcellular analysis critical for de-risking metabolic target hypotheses in skeletal muscle. By resolving glycogen distribution across distinct subcellular compartments, it provides mechanistic insights that improve predictive confidence in preclinical models of metabolic disease. The approach supports early discovery workflows requiring subcellular phenotyping and biomarker alignment.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of glycogen storage patterns to clarify metabolic pathway involvement in disease models.
- Operational Value: Provides subcellular resolution to distinguish artifactual from biologically relevant glycogen accumulation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative ultrastructural data (volume fraction, particle diameter) for assay standardization across subcellular glycogen pools.
- Operational Value: Supports development of reproducible, antibody-free staining protocols compatible with high-throughput EM imaging.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links subcellular glycogen distribution to mitochondrial and lipid droplet morphology for integrated metabolic phenotyping.
- Operational Value: Enables cross-comparison of glycogen dynamics in disease-relevant skeletal muscle models prior to preclinical advancement.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery to preclinical workflows where subcellular metabolic phenotyping informs target validation and lead identification decisions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by revealing non-uniform glycogen storage that challenges homogeneous assumptions in metabolic modeling.
- Screening: Delivers quantitative glycogen readouts (volume fraction, particle size) enabling comparison across genetic or pharmacological conditions.
- Analytics: Employs stereological grid-based counting to generate unbiased, statistically robust estimates of glycogen distribution.
- Translational Research: Connects glycogen ultrastructure to organelle morphology, supporting biomarker alignment in metabolic disease models.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized TEM workflow for subcellular glycogen quantification applicable across multiple skeletal muscle studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by resolving glycogen heterogeneity at the subcellular level.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized fixation, staining, and stereological analysis protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing subcellular metabolic context that complements bulk biochemical assays.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on subcellular glycogen phenotypes in disease models.
Implementation Considerations
- Expertise in TEM sample preparation, ultramicrotomy, and stereological analysis is required.
- Access to transmission electron microscopy with digital imaging capabilities and image analysis software (e.g., ImageJ) is essential.
- Standardization across teams requires adherence to fixed staining concentrations (e.g., potassium ferrocyanide 1.5%) and grid-based counting parameters.
- Adaptation to other muscle fiber types or tissue systems may require optimization of sectioning and staining protocols.
- Methodological limitations include sampling bias if fiber orientation or section distribution is not randomized, as noted in the protocol.
