Técnica modificada para el uso de corazones murinos neonatales en la preparación de Langendorff

Este enfoque establece de manera confiable la perfusión retrógrada del corazón de ratón neonatal ex vivo en menos de tres minutos. Reduciendo así la edad más joven posible de estudio de varias semanas a 10 días postnatales. Este modelo perfundido retrógrado aislado permite el estudio del corazón neonatal durante un período crítico de desarrollo cardíaco en una especie genéticamente modificable y de bajo costo.

Mientras que este modelo se presta al estudio de las respuestas fisiológicas y farmacológicas a la isquemia-reperfusión en el corazón neonatal. También podría ser utilizado para el aislamiento de cardiomiocitos. Para fabricar la cánula aórtica de ratón recién nacido, use tijeras afiladas para cortar la punta y embotar el extremo de una aguja de acero inoxidable de calibre 26, teniendo cuidado de no engarzar o restringir el diámetro de la luz de la aguja.

Luego alise el borde cortado para eliminar cualquier rebaba raspando suavemente el extremo embotado en la mesa de trabajo del laboratorio con un movimiento de ida y vuelta. A continuación, conecte la cánula fabricada al aparato de Langendorff y evalúe el flujo y la resistencia. Mida los caudales a través de la cánula recogiendo y midiendo la cantidad de tampón durante un intervalo de un minuto.

Para cuantificar el diferencial de presión a través de la cánula mientras fluye el amortiguador Krebs-Heneseleit, mida la presión en el sistema con y sin la cánula conectada. A continuación, calcule la resistencia de la cánula utilizando la siguiente fórmula. A continuación, retire la cánula de calibre 26 del aparato de Langendorff y conecte un tubo de alta presión al sitio de canulación del aparato.

A continuación, fije la cánula aórtica en el extremo distal del tubo y airee el tubo y la cánula con tampón oxigenado, asegurándose de que se eliminen todas las burbujas. Para prevenir la formación de microtrombis coronarios, administre una inyección intraperitoneal de heparina a un cachorro de ratón de 10 días de edad utilizando una aguja de calibre 26 en una jeringa de un mililitro. Deje que la heparina circule varios minutos antes de proceder con la inyección de cualquier anestésico.

A continuación, coloque el ratón anestesiado en posición supina y asegure las extremidades inmediatamente después de la pérdida del conocimiento. Comience la cosecha tan pronto como el animal no responda al pellizco del dedo del pie, ya que el animal respira espontáneamente durante la disección inicial. Usando tijeras de disección rectas hacer una incisión subxifoidea transversal a través del ancho de los animales exponiendo la cavidad abdominal.

Pídale a un asistente que agarre el proceso xifoideo con fórceps, luego corte la caja torácica bilateralmente a lo largo de la línea axilar media en dirección cefálica y refleje el esternón y las costillas cranealmente para exponer los órganos torácicos. Después de identificar el diafragma superiormente, incise la porción anterior por completo. Identificar la vena cava inferior infradiafragmática por encima del hígado y transectarla con una tijera curvada de Iris manteniendo un ligero interior en tensión cefálica en el segmento proximal con pinzas iris.

Luego, corte posteriormente a lo largo de la superficie interior de la columna vertebral con tijeras curvas de Iris mientras tira de la vena cava inferior hacia arriba y fuera de la cavidad torácica. A medida que el corazón se moviliza, incline las tijeras hacia arriba y corte los grandes vasos de manera superior para eliminar completamente el corazón y los pulmones. Sumerja inmediatamente el espécimen en un tampón o solución salina Krebs-Henseleit helada.

El corazón debe dejar de latir en cuestión de segundos. Coloque un trozo de toalla de papel en el fondo de una placa de Petri poco profunda para proporcionar fricción para estabilizar el corazón durante la canulación. Humedezca la toalla de papel con un tampón Krebs-Henseleit helado para evitar que el corazón se adhiera a ella.

Coloque la placa de Petri preparada bajo el microscopio de disección y ajuste el foco. Ahora, coloque la cánula aórtica unida al tubo de extensión de alta presión bajo el microscopio de disección, junto con una sutura de seda 5-0 atada libremente alrededor de su cubo. Después de colocar los órganos torácicos extirpados en la placa de Petri, identifique el timo por su brillo blanco y dos lóbulos y oriente el espécimen de tal manera que el timo sea anterior y superior.

A continuación, el uso de fórceps separa sin rodeos los lóbulos del timo exponiendo los grandes vasos. Luego identifique la aorta localizando las características ramificadas distintivas del arco aórtico y transecte solo proximal al despegue de la arteria subclavia utilizando tijeras finas y afiladas. Ahora agarre suavemente la aorta transectada con fórceps curvas finas estilo joyero y cannulate cuidadosamente la aorta con una aguja roma de calibre 26, teniendo cuidado de no dañar la válvula aórtica.

Usando fórceps curvas finas, agarre la aorta alrededor de la cánula e inicie la perfusión retrógrada para limitar el tiempo isquémico. Pídale al asistente que agarre los extremos de la sutura poco atada y que enganche cuidadosamente la aorta alrededor de la cánula. Cinte la sutura por encima o por debajo de las finas pinzas curvas y luego apriete la sutura y confirme la adecuación del flujo coronario.

Desconecte el tubo de alta presión del aparato de Langendorff, agarre el cubo de la cánula y desconecte la aguja roma del tubo de extensión de alta presión. Luego conecte rápidamente el centro de la cánula al aparato. Una vez que el corazón se cuelga en el aparato de Langendorff en la posición habitual, se confirma una perfusión adecuada.

Recorte cuidadosamente el pulmón, el timo y el exceso de tejido. Luego incite la aurícula derecha para permitir que el efluente del seno coronario gotee libremente. Haga un pequeño nudo al final de una sutura de seda 5-0, luego perfore un pequeño trozo de película de parafina con la aguja y deslice la parafina hasta el extremo anudado.

Pase cuidadosamente la aguja a través del ápice del ventrículo y tire de la sutura a través del corazón hasta que la película de parafina se ajuste contra la pared lateral del ventrículo. Pase la aguja a través de la abertura de la chaqueta de calentamiento llena de agua del aparato de Langendorff para que el corazón pueda encerrarse y calentarse. Luego conecte la aguja al transductor de fuerza evitando el goteo del seno coronario.

Ajuste la sutura para aplicar de uno a dos gramos de tensión basal según lo indicado por la tensión diastólica o el rastreo de intención nadir. Luego coloque electrodos de superficie en los polos superior e inferior del corazón para registrar el electrocardiograma. Finalmente, muestree el efluente del seno coronario para su análisis utilizando un catéter intravenoso de calibre 24.

Se utilizaron electrodos de superficie para registrar un electrocardiograma continuo, lo que permitió determinar la velocidad y el ritmo intrínsecos. Todos los corazones adecuadamente perfundidos laten espontáneamente en ritmo sinusal. Esta estrategia de perfusión satisfizo las necesidades metabólicas del corazón de ratón recién nacido, dada la insignificante producción de lactato y el bajo porcentaje de extracción de oxígeno y consumo de glucosa.

También se registraron y calcularon las medias variables fisiológicas, como la frecuencia cardíaca intrínseca denervada media denervada y las presiones medias de perfusión aórtica observadas. Se deben considerar algunos criterios excluyentes, como el tiempo necesario para iniciar la reperfusión, la duración de la arritmia y la presión de perfusión aórtica, para garantizar la consistencia de la preparación neonatal. Después del establecimiento de la perfusión, pueden ocurrir intervenciones como la administración de fármacos, la inducción de la lesión por isquemia-reperfusión, las alteraciones de los metabolitos o la administración de agentes enzimáticos para el aislamiento de cardiomiocitos.