Técnica de fraccionamiento cuantitativo de microtúbulos para separar microtúbulos estables, microtúbulos lábiles y tubulina libre en tejidos de ratón
17 de noviembre de 2023
Los microtúbulos, que son polímeros de tubulina, desempeñan un papel crucial como componente del citoesqueleto en las células eucariotas y son conocidos por su inestabilidad dinámica. Este estudio desarrolló un método para fraccionar microtúbulos para separarlos en microtúbulos estables, microtúbulos lábiles y tubulina libre para evaluar la estabilidad de los microtúbulos en varios tejidos de ratón.
Nuestro nuevo protocolo ayuda a distinguir y cuantificar tres estados de los anillos tubulares, como los microtúbulos estables, los microtúbulos lábiles y los túbulos libres en tejidos animales. Esta técnica se compone de pasos simples y puede evaluar la estabilidad estructural de la tubería, que no se puede detectar mediante la cuantificación de la modificación traslacional posterior a la tubería. Este método es esencial para la investigación y el desarrollo de vías terapéuticas para enfermedades en las que la estabilidad de los microtúbulos es crítica, como la enfermedad de Alzheimer y los cánceres.
Comience el procedimiento preparando la ropa de laboratorio para la disección de tejidos. Llene una caja con hielo picado y coloque dos placas de Petri sobre ella. Llene un plato con una solución tampón de fosfato helada o PBS para el lavado y almacenamiento transitorio de los tejidos disecados.
Coloque papel de filtro humedecido con PBS en el segundo plato. A continuación, pesa los microtubos de 1,5 mililitros llenos de PBS para almacenar el tejido diseccionado. Después de extraer los tejidos de un ratón sacrificado, transfiéralos a los tubos y vuelva a pesar cada microtubo.
Mueva los tejidos a un homogeneizador de vidrio con tampón estabilizador de microtúbulos helado o MSB + medio, y homogeneice el tejido inmediatamente con un homogeneizador refrigerado. Ahora transfiera el homogeneizado de tejido a un microtubo de dos mililitros utilizando una pipeta Pasteur y centrifugue a 2.400 G durante tres minutos a dos grados centígrados. Transfiera el sobrenadante a un nuevo microtubo de 1,5 mililitros para eliminar los residuos.
Vértice el sobrenadante o la fracción S1 en un nuevo microtubo de 1,5 mililitros. Pipetear inmediatamente 200 microlitros de la fracción S1 en un microtubo de centrifugación y centrifugar a 100.000 G utilizando un rotor TLA-55 durante 20 minutos a dos grados centígrados. Después de la segunda centrifugación, separe el sobrenadante S2 del precipitado P2.
Transfiera inmediatamente toda la cantidad de la fracción S2 a un microtubo de centrifugación y use un rotor TLA-120.2 para hacerla girar a 500, 000 G durante 60 minutos a dos grados Celsius. Después de la tercera centrifugación, separe el sobrenadante S3 del precipitado P3. Disuelva toda la fracción S3 en 200 microlitros de dodecil sulfato de sodio 2X o tampón de muestra SDS.
Mezcle las fracciones S1 restantes con un volumen igual de tampón de muestra SDS 2X para usarlo como una curva estándar para Western blot. A continuación, agregue 400 microlitros de tampón de muestra SDS a los tubos de fracción P2 y P3. A continuación, sonicar brevemente la solución para disolver el precipitado antes de transferir las muestras a nuevos microtubos de 1,5 mililitros y colocarlas en la nevera.
Hervir todas las muestras a 100 grados centígrados durante tres minutos. Los microtúbulos de la fracción P2 representaron el 34,86% del total de alfa-tubulina en el cerebro de un ratón, mientras que los de las fracciones P3 y S3 representaron el 56,13% y el 9,01% respectivamente. El porcentaje de tubulina beta-3 en las fracciones P2, P3 y S3 no fue significativamente diferente de los de la tubulina alfa.
La fracción S2 mostró un paso limitado de tubulina a través de una columna de espín de ultrafiltración de 300 kilodalton, mientras que la fracción S3 permitió el paso completo de complejos de tubulina. La separación cromatográfica dio como resultado una elución de 100 kilodalton de tubulina S3. Se recuperaron proporciones iguales de alfa y beta-tubulina en cada fracción.
Las fracciones P2 se enriquecieron significativamente con alfa-tubulina acetilada, mientras que la alfa-tubulina tirosinada fue dominante en la fracción P3. La congelación del cerebro antes de la homogeneización dio lugar a una disminución de la concentración de alfa-tubulina en las fracciones P2. Sin embargo, la alfa-tubulina aumentó en la fracción P3.
La congelación también disminuyó los niveles de acetilación y aumentó los niveles de tirosinación de la alfa-tubulina en la fracción P2. El tratamiento con nocodazol disminuyó la alfa-tubulina en la fracción P2. A diferencia de la congelación, el nocodazol no afectó a las modificaciones postraduccionales de la tubulina P2.
El tejido cerebral exhibió una concentración significativamente mayor de tubulinas P2, mientras que las tubulinas P3 se concentraron en el tejido proliferativo. La Western blot mostró que la tubulina P2 que se encuentra específicamente en el sistema nervioso se originó a partir de microtúbulos estables, y la tubulina P3 se originó a partir de microtúbulos lábiles. La estabilidad de los microtúbulos es muy dinámica.
Es importante completar este protocolo rápidamente, sin interrupciones, en el ambiente de temperatura fría. Asegúrese también de que los tejidos y las fracciones no se hayan congelado hasta que se disuelvan en el tampón de muestra SDS. Se espera que la combinación de la presentación inmune utilizando cada fracción con la proteómica identifique los factores involucrados en la dinámica de los microtúbulos.
Usando este método, revelamos cómo existe tau normal en los microtúbulos. También se puede utilizar para estudiar cómo se vuelve anormal en cerebros envejecidos con el fin de identificar nuevas dianas farmacológicas de la demencia.
Vea la transcripción completa y acceda a miles de videos científicos
Descripción general
Este estudio presenta un nuevo protocolo para distinguir y cuantificar microtúbulos estables, microtúbulos lábiles y tubulina libre en tejidos animales. El método evalúa la estabilidad estructural de los microtúbulos, lo cual es fundamental para comprender enfermedades como el Alzheimer y los cánceres.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología celular
- Dinámica de los microtúbulos
Antecedentes
- Los microtúbulos son componentes esenciales del citoesqueleto en células eucariotas.
- Exhiben inestabilidad dinámica, lo que afecta las funciones celulares.
- Comprender la estabilidad de los microtúbulos es fundamental para el desarrollo de terapias.
- Enfermedades como el Alzheimer y ciertos tipos de cáncer están relacionadas con la disfunción de los microtúbulos.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método para fraccionar microtúbulos en tejidos de ratón.
- Evaluar la estabilidad de diferentes estados de microtúbulos.
- Mejorar la comprensión de las enfermedades relacionadas con los microtúbulos.
Métodos Utilizados
- Preparación del equipo de laboratorio para la disección de tejidos.
- Uso de solución tampón de fosfato fría con hielo para el manejo de tejidos.
- Fractionamiento de microtúbulos en tubulina estable, lábil y libre.
- Cuantificación de la estabilidad de microtúbulos mediante el nuevo protocolo.
Resultados principales
- El protocolo distingue eficazmente entre microtúbulos estables e inestables.
- La cuantificación revela información sobre la estabilidad de los microtúbulos en diversos tejidos.
- El método es sencillo y reproducible para su uso en laboratorio.
- Los hallazgos contribuyen a comprender la dinámica de los microtúbulos en contextos de enfermedad.
Conclusiones
- Este nuevo protocolo es una herramienta valiosa para los investigadores que estudian la estabilidad de los microtúbulos.
- Tiene aplicaciones potenciales en la comprensión y el tratamiento de enfermedades relacionadas con la disfunción de los microtúbulos.
- Investigaciones futuras pueden basarse en estos hallazgos para explorar vías terapéuticas.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La evaluación precisa de la estabilidad de los microtúbulos es esencial para analizar los mecanismos terapéuticos en enfermedades neurodegenerativas y cánceres donde la dinámica del citoesqueleto influye en la respuesta a fármacos. Esta técnica de fraccionamiento permite la cuantificación directa de los reservorios estables, lábiles y libres de tubulina en tejidos nativos, proporcionando una lectura bioquímica que complementa los ensayos basados en imágenes y aquellos específicos para modificaciones. Al discernir los estados funcionales de los microtúbulos, el método apoya la validación de dianas y la reducción del riesgo mecanicista en programas tempranos de descubrimiento centrados en agentes que modulan los microtúbulos.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar hipótesis terapéuticas mediante la cuantificación de cambios en las poblaciones de microtúbulos estables frente a lábiles en respuesta al tratamiento con un compuesto.
- Valor operativo: Proporciona un ensayo bioquímico basado en tejidos para validar la interacción con el objetivo de agentes estabilizadores o desestabilizadores de microtúbulos.
- Valor predictivo: Facilita la selección de proyectos al correlacionar la estabilización bioquímica de microtúbulos con resultados funcionales en sistemas relevantes para la enfermedad.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Preparación del ensayo: Genera datos cuantitativos de fraccionamiento de tubulina adecuados para cribado de alto contenido de bibliotecas de compuestos que tienen como diana la dinámica de microtúbulos.
- Reproducibilidad: Utiliza pasos estandarizados de ultracentrifugación para lograr una separación consistente de fracciones de microtúbulos entre experimentos.
- Escalabilidad: Es compatible con inmunotransferencia (western blotting) y análisis proteómicos posteriores para identificar reguladores de la estabilidad de microtúbulos a partir de reservorios fraccionados de tubulina.
Investigación Translacional y Preclínica
- Relevancia para la enfermedad: Detecta variaciones específicas del tejido en la estabilidad de los microtúbulos que se correlacionan con la capacidad proliferativa, permitiendo la estratificación de modelos preclínicos.
- Continuidad traslacional: Relaciona los estados bioquímicos de los microtúbulos con firmas de modificaciones postraduccionales (por ejemplo, acetilación en pools estables, tirosinación en pools lábiles) para alinear biomarcadores.
- Avance ajustado al riesgo: Apoya decisiones de avance o interrupción al proporcionar métricas cuantitativas de estabilidad que predicen el índice terapéutico en programas dirigidos a microtúbulos.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método se encaja dentro del continuo de descubrimiento que va desde la validación del blanco hasta la optimización del fármaco líder, donde la estabilidad de los microtúbulos sirve como biomarcador farmacodinámico para la confirmación del mecanismo de acción.
- Biología de Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis mediante la medición de cambios inducidos por compuestos en los estados de polimerización de microtúbulos en lisados de tejidos nativos.
- Selección: Permite la estandarización de ensayos mediante umbrales definidos de sedimentación (100,000 × g para microtúbulos estables, 500,000 × g para microtúbulos lábiles) para garantizar una fraccionamiento reproducible.
- Análisis: Genera lecturas cuantitativas de tubulina mediante inmunotransferencia de las fracciones P2 (estable), P3 (lábil) y S3 (tubulina libre) para comparar los efectos de los compuestos.
- Investigación Traducional: Relaciona los datos de fraccionamiento de microtúbulos con patrones de expresión y perfiles de modificaciones específicos de cada tejido para la validación preclínica.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma bioquímica reutilizable para evaluar compuestos que actúan sobre microtúbulos en múltiples áreas de enfermedades y tipos de tejidos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Reduce la ambigüedad mecanicista al medir directamente los estados de polimerización de los microtúbulos, en lugar de basarse únicamente en modificaciones postraduccionales.
- Valor operativo: Asegura la reproducibilidad mediante parámetros estandarizados de centrifugación y un procesamiento controlado por temperatura para preservar la integridad de los microtúbulos.
- Valor estratégico: Mejora la confianza en las decisiones de avance o interrupción al proporcionar una validación ortogonal del mecanismo de acción sobre microtúbulos más allá de los ensayos celulares.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de compuestos basada en la eficacia cuantitativa de estabilización en tejidos relevantes para la enfermedad.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en técnicas de homogenización de tejidos y ultracentrifugación para mantener la estabilidad de los microtúbulos durante el procesamiento.
- Depende del acceso a rotores de alta velocidad (TLA-55 y TLA-120.2) capaces de alcanzar 100,000 × g y 500,000 × g para la separación de fracciones.
- Exige la estandarización conjunta entre equipos del tiempo y la temperatura de fraccionamiento para garantizar resultados consistentes entre laboratorios.
- Requiere adaptar la composición del tampón y los parámetros de centrifugación al aplicar el método a tejidos no neuronales con densidades diferentes de microtúbulos.
- Está limitado por la necesidad de procesar inmediatamente las muestras para evitar la despolimerización artifactual de los microtúbulos durante su manipulación.
