Name: Cuantificación de la motilidad del enjambre de la superficie bacteriana en placas de gradiente inductoras (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 57 s
Description: Aprende a cuantificar la motilidad del enjambre bacteriano en placas de gradiente inductoras de agar semisólido. Este método de alto rendimiento permite evaluar respuestas quimiotácticas y facilita el cribado de fármacos de manera rentable.

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El desarrollo de esta técnica fue apoyado por los fondos del plan nacional clave de I + D del Ministerio de Ciencia y Tecnología (2018YF0902604), el Fondo de Investigación para Jóvenes Científicos Internacionales (22050410270) de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China y los Fondos Externos de los Institutos de Tecnología Avanzada de Shenzhen (DWKF20190001). Nos gustaría ofrecer nuestro sincero agradecimiento a la señorita Chen Xinyi por su ayuda en la revisión del documento y la gestión del laboratorio.

1. Preparación de placas de enjambre de gradiente
<ol><li>Preparación del medio de enjambre NOTA: Consulte la sección de discusión para obtener una breve comparación de las diferentes viscosidades medias; En este protocolo se utilizó una concentración de agar del medio de enjambre al 0,7% (p/v).<ol>
<li>Preparar caldo de lisogenia (LB) en polvo con agar en dos matraces cónicos; cada matraz contiene 2 g de triptona, 2 g de cloruro de sodio, 1 g de extracto de levadura y 1,4 g de agar. Agregue agua de doble destilación (ddH2O) y revuelva la suspensión con una barra de agitación magnética. Ajuste el volumen final a 200 ml agregando ddH2O adicional.</li>
		<li>Autoclave la solución a 121 °C durante 20 min. Use una tapa permeable al aire o una película de sellado de botellas con una salida de aire. NOTA: El agar se disolverá cuando se caliente en el autoclave.</li>
		<li>Cuando la temperatura baje a 65 °C, mezcle la solución para garantizar la homogeneidad y transfiera el medio a una incubadora o baño de agua a 65 °C para un uso a corto plazo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparación del medio de enjambre de capa inferior NOTA: El medio de capa inferior es la mezcla de medio de enjambre y soluciones madre inductoras. La formulación de las placas de enjambre de gradiente inductor se muestra en la Tabla 1.<ol>
<li>Prepare una solución madre de resveratrol de 100 mM disolviendo 114,12 mg de polvo de resveratrol liofilizado en 5 ml de dimetilsulfóxido (DMSO) y almacene la solución a -20 °C.</li>
		<li>Preparar una solución madre de arabinosa al 20% (p/v) disolviendo 6 g de polvo de arabinosa en 30 ml de ddH2O; espere 10-15 minutos para permitir que la arabinosa se disuelva; y almacene la solución a temperatura ambiente.</li>
		<li>Saque el medio de la incubadora de 65 °C y colóquelo a temperatura ambiente; deje que el medio de enjambre se enfríe hasta que el matraz Erlenmeyer esté lo suficientemente frío como para sostenerlo (~ 50 ° C). No coloque el medio de enjambre a temperatura ambiente durante largos períodos, ya que esto causará la solidificación del agar.</li>
		<li>Añadir el volumen requerido de la solución madre inductora al medio de enjambre a 50 °C (Tabla 1). Use una pipeta para dispensar la solución inductora en lugar de verterla. Agite suavemente para mezclar el inductor con el medio de enjambre. NOTA: Este paso es para inductores que no se pueden esterilizar en autoclave. Tenga cuidado de no introducir burbujas en el medio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparación de placas de enjambre de gradiente de doble capa NOTA: El medio de capa superior es un medio LB que contiene 0.7% (p/v) de agar.<ol>
<li>Etiquete las placas de Petri cuadradas de 13 x 13 cm con el nombre del inductor y las cepas, y apoye los platos sobre el borde de las tapas (Figura 1B).</li>
		<li>Agregue un medio de capa inferior caliente de 40 ml (50 °C) utilizando una pipeta de 50 ml o un tubo de centrífuga de 50 ml. NOTA: Alternativamente, para placas de Petri cuadradas de 13 x 13 cm, es adecuado un medio de capa inferior y capa superior de 40 ml; para placas de Petri cuadradas de 10 x 10 cm, la capa inferior de 25 ml y el medio de capa superior son adecuados.</li>
		<li>Deje que el medio de la capa inferior se cure sin tapar durante 1 h dentro de una campana de flujo laminar. No moleste las placas de Petri cuadradas mientras el medio se solidifica. NOTA: Durante el curado de la capa inferior, el medio de enjambre que no contenga inductores debe mantenerse en una incubadora o baño de agua a 65 °C.</li>
		<li>Una vez que la capa inferior esté completamente solidificada, retire las tapas y coloque las placas de Petri cuadradas dentro de una campana de flujo laminar.</li>
		<li>Añadir 40 ml de medio de capa superior caliente (50 °C) utilizando una pipeta de 50 ml o un tubo de centrífuga de 50 ml. NOTA: El medio de capa superior no contiene inductores.</li>
		<li>Cure las placas de doble capa en la mesa de trabajo cubierta y sin molestias durante 1 h. Conservar las placas preparadas a 4 °C durante un máximo de 24 h. NOTA: Los tiempos de curado más largos reducirían el contenido de humedad y restringirían la motilidad del enjambre.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Crecimiento de E. coli K12 y P. aeruginosa PAO1
<ol><li>Prepare 500 ml de medio LB agregando 5 g de triptona, 5 g de NaCl y 2.5 g de extracto de levadura en ddH2O, y complete la solución a 500 ml. Autoclave la solución en ciclo líquido durante 20 min a 121 °C y guárdela a 4 °C.</li>
	<li>Prepare 100 ml de medio lb-agar al 1,5% (p/v) agregando 1 g de triptona, 1 g de NaCl, 0,5 g de extracto de levadura y 1,5 g de agar en ddH2O y rellene la solución a 100 ml. Autoclave la solución en ciclo líquido durante 20 min a 121 °C. Transfiera el medio a un baño de agua a 50 °C para evitar que el agar se solidifique.</li>
	<li>Cuando el matraz medio LB-agar sea cómodo de sostener, agregue 20 ml de medio LB-agar en una placa de Petri (10 cm de diámetro) con una pipeta de 25 ml. Deje el plato a temperatura ambiente durante la noche y guarde el plato de agar LB a 4 °C.</li>
	<li>Tome cultivos de inventario almacenados a -80 °C, cepas de E. coli K12, E. coli K12-YdeH, P. aeruginosa PAO1 y P. aeruginosa PAO1-YdeH en placas de Petri de agar LB utilizando bucles de inoculación desechables. Incubar las placas de Petri invertidas durante la noche a 37 °C.</li>
	<li>Elija colonias individuales para diferentes cepas de las placas de Petri, inocule cada colonia en 5 ml de medio LB e incube el cultivo a 37 ° C en un agitador orbital de laboratorio a 220 rpm.</li>
	<li>Cuando la densidad de cultivo alcance OD600nm ~ 1.0, retire el cultivo del agitador y colóquelo a temperatura ambiente. Ajuste la densidad de cultivo a OD600nm = 1.0, como se describe en el paso 3.2.1.</li>
</ol>3. Inoculación e incubación de placas de enjambre de gradiente
<ol><li>Preparación de pocillos de inoculación NOTA: Se pueden utilizar modelos de cubiertas de impresión 3D capaces de generar pozos separados por una distancia estándar en lugar del método que se describe a continuación (Figura suplementaria S1).<ol>
<li>Marque las posiciones de los pozos en el papel A4 que se muestra en la Figura 1C. Establezca tres concentraciones de prueba en una placa de Petri cuadrada con dos o tres réplicas.</li>
		<li>Coloque el papel A4 marcado debajo de una placa de gradiente solidificada. Empuje el lado más ancho de la punta de una pipeta de 100 μL en la superficie media semisólida en la posición marcada. Presione la punta de la pipeta hasta que llegue a la parte inferior del medio de la capa superior.</li>
		<li>Cuando la punta toque la parte inferior, no aplique fuerza vertical a la punta; Gire suavemente la punta para aislar el contenido del pozo cilíndrico.</li>
		<li>Mueva horizontalmente las puntas de la pipeta a lo largo de una distancia muy pequeña para permitir el flujo de aire en el lugar estrecho reservado. Presione la punta con el dedo índice para bloquear el flujo de gas dentro de la punta mientras sostiene la pipeta con el pulgar y el dedo medio.</li>
		<li>Tire de la punta hacia afuera verticalmente, manteniendo el contenido del pozo en la punta mientras lo extrae. NOTA: Si el contenido del pozo se desliza, aplique un poco más de presión con el dedo índice para sellar completamente la punta.</li>
		<li>Repita los pasos 3.1.2 a 3.1.5 en cada posición marcada. Cubra la placa de enjambre antes de la inoculación.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inoculación e incubación de placas de gradiente<ol>
<li>Ajuste la densidad de cultivo de crecimiento durante la noche a OD600nm = 1.0.</li>
		<li>Pipetear 80 μL de la cultura de crecimiento durante la noche en cada pozo. No derrame el cultivo bacteriano fuera de los pozos.</li>
		<li>Envuelva las placas con una película de sellado. Para la observación a largo plazo (3-5 días), envuelva las placas con cinta de goma de laboratorio estéril. NOTA: Es menos probable que la cinta de goma se rompa.</li>
		<li>Coloque un vaso de precipitados lleno de ddH2O en la incubadora para mantener la humedad dentro de la incubadora. Incubar las placas de enjambre de gradiente a 37 °C. NOTA: No incube las placas de enjambre al revés; esto hará que el cultivo bacteriano se escape de los pozos.</li>
		<li>Imagine la placa de enjambre inmediatamente después de la inoculación, registrando esto como el punto de tiempo de 0 h .</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Imágenes del enjambre de la superficie bacteriana
<ol><li>Saque las placas de enjambre, una a la vez, de la incubadora cada 12 h, sosteniendo la placa horizontalmente, y colóquelas en el sistema de imágenes de gel (consulte la Tabla de materiales). NOTA: No deje huellas dactilares en la superficie de las placas; sostenga el costado de la placa de enjambre con guantes limpios.</li>
	<li>Seleccione el modo de imagen de gel ; exponer la placa de enjambre a la luz blanca; y ajustar la distancia focal para dar la vista más clara de los enjambres. NOTA: Utilice la misma distancia focal para todas las placas de un lote determinado.</li>
	<li>Mejore el brillo de los enjambres para una observación clara ajustando el tiempo de exposición a 300 ms. Ajuste el umbral para minimizar la interferencia de la luz de fondo. NOTA: El umbral se ajusta en la interfaz operativa del sistema de imágenes en gel. Aumente los valores a la izquierda para minimizar la interferencia de la luz de fondo; disminuir los valores a la derecha para mejorar el brillo de los enjambres. En este protocolo, la región suele estar entre 6.000 y 50.000.</li>
	<li>Guarde el archivo de imagen para su posterior análisis. Registre el tiempo de imagen, el tipo de inductor, la orientación del gradiente y las deformaciones en un archivo .txt .</li>
</ol>5. Cuantifique el área del enjambre utilizando el software ImageJ
<ol><li>Importe el archivo de imagen adquirido mediante el sistema de imágenes en gel.</li>
	<li>Establezca la barra de escala utilizando el software ImageJ y aplíquela a todas las imágenes.<ol>
<li>Cree un segmento de línea que marque la longitud del tablero haciendo clic en la herramienta de línea.</li>
		<li>Haga clic en Analizar | Establezca Escala para abrir la ventana Establecer escala .</li>
		<li>Escriba la longitud real en Distancia conocida y Unidad de longitud. NOTA: Debido a que se utilizaron placas de Petri cuadradas de 13 x 13 cm en este trabajo, la longitud real es '130', y la unidad de longitud es 'mm'.</li>
		<li>Marque la casilla Global .</li>
		<li>Insertar una barra de escala haciendo clic en Analizar | Herramientas | Barra de escala, escriba Ancho en mm, Alto en píxeles, Tamaño de fuente y seleccione Color, Fondo y Ubicación en el menú desplegable. Alternativamente, elija Texto en negrita, Ocultar texto, Fuente Serif y Superposición marcando las casillas de verificación. NOTA: La elección de esos parámetros está determinada por los usuarios y las propiedades de las imágenes. En este protocolo, el ancho en mm se estableció en 25, el alto en píxeles en 20, el tamaño de fuente en 80 y la barra de escala se colocó en la esquina inferior derecha seleccionando Ubicación | Abajo a la derecha. Otros parámetros pueden ser elegidos por el usuario.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Haga clic en Procesar | Sombras para mejorar la nitidez de la imagen, especialmente los límites (Figura suplementaria S2A). Haga clic en Procesar | Lote para procesar imágenes. NOTA: El propósito de este paso es proporcionar una demarcación de límites más precisa.<ol>
<li>Procese una imagen como referencia haciendo clic en Procesar | Sombras | Sur.</li>
		<li>Haga clic en Procesar | | por lotes Macro para abrir la ventana Proceso por lotes . Busque los siguientes comandos que se muestran en la ventana: run("Sur"); run("Guardar"); cerrar();</li>
		<li>Escriba la dirección de carpeta de las imágenes originales y la dirección del archivo de salida haciendo clic en Procesar en la ventana Proceso por lotes . NOTA: Se recomienda exportar imágenes con sombras a otra carpeta y conservar una copia de las imágenes originales.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Utilice la herramienta Varita (trazado) para seleccionar enjambres individualmente y ajustar la tolerancia ( herramienta Varita (trazado)) hasta que la línea generada se ajuste correctamente al límite de enjambre (Figura suplementaria S2B). NOTA: Primero, haga clic en la herramienta Varita (rastreo) y seleccione un enjambre en una imagen. Si los límites no se han representado correctamente, haga doble clic en la herramienta Varita (trazado) para abrir las ventanas herramienta Varita , donde se puede ajustar la Tolerancia .</li>
	<li>Haga clic en Analizar | Medida para exportar el valor del área.</li>
	<li>Repita los pasos 5.1.1-5.1.5 hasta que se midan todos los enjambres, guarde los resultados en un archivo .csv para su posterior análisis.</li>
</ol>

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<li>Kearns, D. B., Chu, F., Rudner, R., Losick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+governing+swarming+in+Bacillus+subtilis+and+evidence+for+a+phase+variation+mechanism+controlling+surface+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Genes governing swarming in Bacillus subtilis and evidence for a phase variation mechanism controlling surface motility.</a> Molecular Microbiology. 52 (2), 357-369 (2004).</li>
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</ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

La investigación de la motilidad del enjambre bacteriano en placas de gradiente semisólido puede ser una tarea desafiante18,19,20, ya que involucra múltiples factores como la viscosidad del sustrato, la humedad y los componentes medios. Entre estos factores, la concentración de agar juega un papel decisivo en la determinación de la reversión microbiana a la motilidad de natación o enjambre. A medida que la concentración de agar ...

La motilidad del enjambre bacteriano se refiere a la migración colectiva de células bacterianas a través de la superficie de una sustancia. Además de las placas de agar semisólido especialmente preparadas en el laboratorio1, este fenotipo también se observa en algunos sustratos blandos como tejidos animales2, superficies hidratadas3 y raíces de plantas4. Si bien una superficie semisólida se considera una de las condiciones fundamentales para el enjambre bacteriano, algunas especies también requieren un medio rico en energía para soportar su motilidad de enjambre5. La rotación de flagelos potencia tanto para nadar como para enjambre: la natación describe la motilidad unicelular dentro de un ambiente líquido, mientras que el enjambre es el movimiento sincrónico de una población microbiana a través de superficies semisólidas.
La viscosidad del sustrato influye en la motilidad bacteriana; los estudios de microbios patógenos, como Helicobacter pylori, han demostrado que la motilidad del patógeno cambia en función de la viscosidad de la capa de mucina, que está influenciada por la acidificación ambiental en el huésped humano6. Para replicar estos entornos, estudios anteriores que utilizaron una concentración de agar superior al 0,3% (p/v) restringen la motilidad bacteriana de la natación para efectuar un cambio gradual hacia el enjambre superficial. El uso de concentraciones de agar por encima del 1% (p/v) previene la motilidad del enjambre de muchas especies7. Los patrones de colonia formados en la superficie son diversos, incluyendo mat8 sin rasgos, ojo de buey9, dendritas10 y vórtice11.
Aunque la relevancia de tales patrones sigue sin estar clara, esos patrones parecen depender de señales ambientales y químicas12. Las señales ambientales cubren diferentes aspectos, incluida la temperatura, la salinidad, la luz y el pH, mientras que las señales químicas incluyen la presencia de moléculas de detección de quórum microbiano, subproductos bioquímicos y nutrientes. Las moléculas de señalización de detección de quórum autoinductoras como AHL (N-hexanoyl-L homoserine lactone) pueden afectar el enjambre superficial al regular la producción de surfactante13,14. El resveratrol, un compuesto fitoalexina, podría restringir la motilidad del enjambre bacteriano15.
En el presente trabajo, investigamos el efecto de las concentraciones de gradiente de resveratrol en la cepa K12 de Escherichia coli de tipo silvestre e investigamos la motilidad de enjambre inducible por arabinosa de las especies de E. coli K12-YdeH y Pseudomonas aeruginosa PAO1-YdeH. La producción de la enzima YdeH es inducida por la arabinosa a través del promotor araBAD, resultando en perturbación celular c-di-GMP y afectando la motilidad del enjambre bacteriano16,17. Este comportamiento de enjambre inducible se estudia utilizando placas de enjambre de gradiente de arabinosa con cepas de E. coli K12-YdeH y P. aeruginosa PAO1-YdeH.
Las placas de enjambre de gradiente se preparan solidificando sucesivamente el medio de doble capa (Figura 1B). La capa inferior comprende el medio agregado con el inductor, vertido en un lado de una placa de Petri apoyada. Tras la solidificación de la capa inferior, la placa de Petri se devuelve a una superficie plana, donde la capa superior que contiene el medio sin el inductor se agrega desde el otro lado de la placa. Después de que las placas de enjambre están completamente solidificadas, los pozos de retención dispuestos isométricamente se producen perforando agujeros en las placas de enjambre siguiendo un diseño fijo (Figura 1C) o imprimiendo los pozos utilizando un modelo impreso en 3D de la cubierta de la placa que contiene clavijas durante el proceso de curado del medio (Figura suplementaria S1). Se utiliza un sistema de imágenes en gel para capturar las morfologías del enjambre en diferentes puntos temporales (Figura 2). El análisis del enjambre de superficies utilizando el software ImageJ (Figura suplementaria S2) proporciona resultados cuantitativos del proceso de enjambre de superficies (Figura 3).
Por lo tanto, proponemos un método simple para probar la motilidad del enjambre de superficie dentro de un rango de concentración de inductores. Este método se puede utilizar para probar múltiples respuestas de concentración de otros inductores mezclando el inductor en el medio de la capa inferior y se puede aplicar a otras especies móviles (por ejemplo, Bacillus subtilis, Salmonella enterica, Proteus mirabilis, Yersinia enterocolitica). Este enfoque podría proporcionar resultados cualitativos y cuantitativos confiables para la detección de un solo inductor químico, y se pueden emplear placas separadas para evaluar más inductores químicos.

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>V900500 500 g</td></tr><tr><td>Ampicilina</td><td>Solarbio</td><td>A8180</td><td>25 g, &ge; 85% (GC)</td></tr><tr><td>Tubo de centrífuga</td><td>Corning</td><td>430790</td><td>15 mL</td></tr><tr><td>Vial criogénico</td><td>Corning</td><td>430488</td><td>2 mL</td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>Aladdin</td><td>D103272</td><td>AR, > 99% (GC)</td></tr><tr><td>L(+)-Arabinosa</td><td>Aladdin</td><td>A106195</td><td>98% (GC), 500 g</td></tr><tr><td>Placas de Petri</td><td>Bkman</td><td>B-SLPYM90-15 Placas de</td><td>Petri de plástico, circulares, 90 mm x 15 mm</td></tr><tr><td>Resveratrol</td><td>Aladdin</td><td></td><td>R107315 99% (GC), 25 g</td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Macklin</td><td>S805275</td><td>AR, 99,5% (GC), 500 g</td></tr><tr><td>Placas de Petri cuadradas</td><td>Bkman</td><td>B-SLPYM130F Placas de</td><td>Petri de plástico, cuadradas, 13 mm x 13 mm</td></tr><tr><td>Triptona</td><td>Thermo Scientific Oxoid</td><td>LP0042</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Extracto de levadura</td><td>Thermo Scientific Oxoid</td><td>LP0021</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Equipments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biochemical incubadora</td><td>Blue pard</td><td>LRH-70</td><td></td></tr><tr><td>Tanon 5200multi sistema de imagen</td><td>Tanon</td><td>5200CE</td><td></td></tr><tr><td>Agua termostática baño</td><td>Jinghong</td><td>DK-S28</td><td></td></tr></tbody></table>

cuantificación de la motilidad del enjambre de la superficie bacteriana en placas de gradiente inductoras

Quantifying Bacterial Surface Swarming Motility on Inducer Gradient Plates

La motilidad del enjambre bacteriano es un fenotipo microbiológico común que las comunidades bacterianas utilizan para migrar sobre superficies semisólidas. En las investigaciones de la motilidad del enjambre inducido, la concentración específica de un inductor puede no ser capaz de informar eventos que ocurren dentro del rango de concentración óptimo para provocar las respuestas deseadas de una especie. Las placas semisólidas que contienen múltiples concentraciones se usan comúnmente para investigar la respuesta dentro de un rango de concentración del inductor. Sin embargo, las placas semisólidas separadas aumentan las variaciones en la viscosidad media y el contenido de humedad dentro de cada placa debido al tiempo de solidificación no uniforme.
Este artículo describe un método de un solo paso para probar simultáneamente la motilidad del enjambre de superficie en una sola placa de gradiente, donde los pozos de prueba dispuestos isométricamente permiten la adquisición simultánea de respuestas de multiconcentración. En el presente trabajo, se evaluó el enjambre superficial de Escherichia coli K12 y Pseudomonas aeruginosa PAO1 en respuesta a un gradiente de concentración de inductores como el resveratrol y la arabinosa. Periódicamente, las morfologías del enjambre se fotografiaban utilizando un sistema de imágenes para capturar todo el proceso de enjambre de superficie.
La medición cuantitativa de las morfologías del enjambre se adquirió utilizando el software ImageJ, proporcionando información analizable del área del enjambre. Este artículo presenta un método simple de placa de enjambre de gradiente que proporciona información cualitativa y cuantitativa sobre los efectos de los inductores en el enjambre de superficie, que puede ampliarse para estudiar los efectos de otros inductores en una gama más amplia de especies bacterianas móviles.

El flujo de trabajo que consiste en la preparación de placas de enjambre de gradiente, inoculación e incubación se muestra en la Figura 1B. Para generar placas de natación de gradiente, el medio de la capa inferior se vierte en platos apuntalados a ~ 4.3 ° desde el plano horizontal (Figura suplementaria S3), seguido de verter el medio de la capa superior después de que la capa inferior esté completamente solidificada. La composición del medio de doble capa se muestra en <str...

Aquí, describimos el uso de placas de gradiente inductoras para evaluar la motilidad del enjambre bacteriano y, al mismo tiempo, obtener múltiples respuestas de concentración.

Cuantificación de la motilidad del enjambre de la superficie bacteriana en placas de gradiente inductoras

Bacterial swarming motility is a common microbiological phenotype that bacterial communities use to migrate over semisolid surfaces. In investigations of ...

El protocolo rastrea simultáneamente las respuestas de enjambre bacteriano a diferentes concentraciones de inductores en un agar semisólido. Esto se logra de una manera rentable. Esta técnica de cribado de alto rendimiento niega la necesidad de agar con varias concentraciones de inductores para observar las respuestas microquimiotácticas.La técnica está diseñada para el cribado de fármacos y también para observar las respuestas de SD del micropatógeno. Además, se puede utilizar para estudiar microrespuestas a varias señales bioquímicas en el huésped humano. Este método puede proporcionar información sobre la quimiotaxis bacteriana.Las bacterias responderán a varias concentraciones de atrayentes químicos conocidos como quimiotaxis positiva o repelentes químicos conocidos como quimiotaxis negativa. Una configuración cuidadosamente preparada es esencial para evitar variaciones entre el ángulo de gel de la capa inferior para evitar el problema de reproducibilidad. Para comenzar, etiquete placas de Petri cuadradas de 13 por 13 centímetros con manchas y nombres de inductores.Luego apoye los platos sobre el borde de las tapas. Agregue la solución de arabinosa al medio de capa inferior caliente. Agregue 40 mililitros de medio de capa inferior cálida.Deje que el medio de la capa inferior se cure sin tapar durante una hora dentro de una campana de flujo laminar sin ser molestado. Una vez que la capa inferior esté completamente solidificada, retire las tapas y coloque las placas de Petri dentro de una campana de flujo laminar. Agregue 40 mililitros de medio de capa superior caliente utilizando un filtro de pipeta motorizado.Cure las placas de doble capa cubiertas y sin perturbaciones durante una hora, luego guárdelas a cuatro grados centígrados durante 24 horas. Coloque el papel A4 marcado debajo de una placa de gradiente bien solidificada. Empuje el lado más ancho de la punta de una pipeta de 100 microlitros en la superficie media semisólida en la posición marcada y presione la punta de la pipeta hasta que llegue a la parte inferior del medio de la capa superior.Cuando la punta toque la parte inferior, deje de aplicar cualquier fuerza vertical a la punta y gire suavemente la punta para aislar el contenido del pozo cilíndrico. Mueva horizontalmente la punta de la pipeta a lo largo de una pequeña distancia para permitir el flujo de aire en el lugar estrecho reservado. Presione la punta con el dedo índice para bloquear el flujo de gas dentro de la punta.Tire de la punta hacia afuera verticalmente, manteniendo el contenido del pozo en la punta mientras lo extrae. Agregue 80 microlitros de la cultura de crecimiento durante la noche en cada pozo. Saque las placas de enjambre de la incubadora una a la vez cada 12 horas y colóquelas en el sistema de imágenes en gel.Seleccione el modo de imagen en gel, exponga la placa de enjambre a la luz blanca y ajuste la distancia focal para obtener una vista clara de los enjambres. Mejore el brillo de los enjambres para una observación precisa ajustando el tiempo de exposición a 300 milisegundos. Ajuste el umbral para minimizar la interferencia de la luz de fondo.Guarde el archivo de imagen para su posterior análisis. Registre el tiempo de imagen, el tipo de inductor, la orientación del degradado y las deformaciones en un archivo txt. Haga clic en Procesar y, a continuación, en Sombras para mejorar la nitidez de la imagen.Haga clic en Procesar seguido de Lote para procesar la imagen. A continuación, procese una imagen como referencia haciendo clic en Proceso, Sombras y Sur. Haga clic en Proceso, Lote, Macro para abrir la ventana Proceso por lotes.Busque los comandos que se muestran en la ventana. Escriba la dirección de carpeta de las imágenes originales en la dirección del archivo de salida haciendo clic en Procesar en la ventana Proceso por lotes. Utilice la herramienta de trazado de varitas para seleccionar enjambres individualmente y haga doble clic en la herramienta de trazado de varitas para ajustar la tolerancia hasta que la línea generada se ajuste correctamente al límite de enjambre.Haga clic en Analizar, luego en Medir para exportar el valor del área. E.coli K12 YdeH se probó en placas de gradiente de arabinosa utilizadas para demostrar el proceso de enjambre de superficie con superposición entre pozos adyacentes. Una placa con tres pozos de prueba permitió la formación de límites no superpuestos.La motilidad del enjambre de P.aeruginosa PAO1 YdeH se promovió con una mayor concentración de arabinosa a partir de la concentración más baja, pero se restringió gradualmente con concentraciones más altas de arabinosa. Las cepas de tipo salvaje K12 de E.coli probadas en placas de gradiente de resveratrol dentro del rango de concentración de cero a 400 microlitros mostraron una restricción modesta de la motilidad del enjambre con una concentración creciente de resveratrol. Las áreas de enjambre fueron cuantificadas por el software ImageJ.La curva de enjambre mostraba las múltiples respuestas de concentración. La parte más crucial de este procedimiento es la fabricación de una placa de enjambre de doble capa con un rango de concentración específico de inductores. Este método permite a los investigadores investigar el enjambre de superficie inducido dentro de un rango de concentración específico y cuantificar los efectos de otros inductores y componentes en el enjambre.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Este protocolo describe el desarrollo de un dispositivo de microfluidos para la investigación de la quimiotaxis bacteriana en los gradientes de concentración estable de chemoeffectors.

Un dispositivo de microfluidos para la cuantificación de la quimiotaxis bacteriana en gradientes de concentración estable

Fuente: Heering, J., et al. Inducción de diferenciación celular e imágenes unicelulares de células nadadoras y enjambres de Vibrio parahaemolyticus . J. Vis. Exp. (2017)Este video demuestra la inducción de la diferenciación celular de enjambre en Vibrio parahaemolyticus utilizando un medio de agar especialmente preparado. Al manipular señales ambientales como el agotamiento del hierro, la suplementación con calcio y el contacto con la superficie, las bacterias son estimuladas para hacer la...

Inducción de la diferenciación de Vibrio parahaemolyticus en células de enjambre

Fuente: Morales-Soto, N. et. al., Preparación, obtención de imágenes y cuantificación de ensayos de motilidad de la superficie bacteriana. J. Vis. Exp. (2015)Este video demuestra un ensayo de enjambre utilizando bacterias que expresan proteína verde fluorescente para observar la motilidad de la superficie en agar blando. Las imágenes de lapso de tiempo capturan la expansión coordinada y la formación de zarcillos, destacando la motilidad de la superficie bacteriana.

Ensayo de enjambre para visualizar la motilidad de la superficie bacteriana

Fuente: Guo, S., et al. Cuantificación de la motilidad del enjambre de la superficie bacteriana en placas de gradiente inductor. J. Vis. Exp. (2022).Este video demuestra el uso de una placa de enjambre de gradiente de doble capa para estudiar el comportamiento del enjambre bacteriano bajo concentraciones variables de inhibidores. Una placa con un inhibidor formador de gradiente en la capa inferior se inocula con bacterias y se incuba. Las imágenes se capturan a intervalos regulares para...

Evaluación del enjambre bacteriano mediante una placa inhibidora de gradiente

Fuente: Scheidweiler, D., et al. Combinar dispositivos fluídicos con microscopía y citometría de flujo para estudiar el transporte microbiano en medios porosos a escalas espaciales. J. Vis. Exp. (2020).Este vídeo demuestra el uso de un dispositivo microfluídico para cuantificar la motilidad bacteriana a través de una matriz porosa compuesta por pilares dispuestos aleatoriamente. Se introducen bacterias marcadas con fluorescencia en el dispositivo, se fotografían mediante microscopía a medida...

Evaluación de la motilidad bacteriana utilizando un dispositivo microfluídico

La motilidad del enjambre está influenciada por factores físicos y ambientales. Describimos un protocolo de dos fases y pautas para sortear los desafíos comúnmente asociados con la preparación de ensayos de enjambre y la recopilación de datos. Se emplea una técnica de imagen macroscópica para obtener información detallada sobre el comportamiento del enjambre que no proporciona las técnicas de análisis actuales.

Preparación, Imaging, y cuantificación de la superficie bacteriana Motilidad ensayos

El papel de surtido (segregación espacial) en escenarios de evolución puede ser examinada usando sistemas microbianos simples en el laboratorio que permiten el ajuste de la distribución espacial controlada. Mediante la modificación de la densidad celular fundador, varios niveles de surtido pueden ser visualizados utilizando cepas bacterianas marcadas con fluorescencia en las biopelículas de colonias de Bacillus subtilis.

Monitoreo Segregación Espacial en la superficie colonizadores microbianos Poblaciones

Este protocolo permite la microscopía monocelular de los nadadores diferencialmente distintos de Vibrio parahaemolyticus y células swarmer. El método produce una población de células swarmer fácilmente disponibles para el análisis de células individuales y cubre la preparación de cultivos celulares, inducción de diferenciación de swarmer, preparación de muestras y análisis de imágenes.

Inducción de la diferenciación celular y de imágenes monocelulares de<em&gt; Vibrio parahaemolyticus</em&gt; Células Swimmer y Swarmer

Detallamos un método simple para producir películas de lapso de tiempo de alta resolución de enjambres Pseudomonas aeruginosa que responden al bacteriófago (fago) y estrés antibiótico utilizando un escáner de documentos de base plana. Este procedimiento es un método rápido y sencillo para monitorear la dinámica de enjambre y puede adaptarse para estudiar la motilidad y el crecimiento de otras especies bacterianas.

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Aprende a cuantificar la motilidad del enjambre bacteriano en placas de gradiente inductoras de agar semisólido. Este método de alto rendimiento permite evaluar respuestas quimiotácticas y facilita el cribado de fármacos de manera rentable.

Cuantificación de la motilidad del enjambre de la superficie bacteriana en placas de gradiente inductoras

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