Bioensayo de aplicación tópica para cuantificar la toxicidad de insecticidas para mosquitos y moscas de la fruta

Al aplicar directamente insecticida en el insecto en lugar de a través del contacto superficial, hay una variación mínima en la exposición al insecticida, y esto nos permite medir el perfil de susceptibilidad de las poblaciones de mosquitos con mayor precisión. La principal ventaja de esta técnica es que nos permite calcular dosis letales relativizadas en masa de un insecticida en lugar de concentraciones letales, lo que mejora en gran medida las comparaciones de la relación de resistencia. Tenga cuidado de almacenar los insecticidas correctamente, evite contaminar sus herramientas y asegúrese de que las partes de la jeringa estén en buen estado.

Esto le ayudará a obtener resultados consistentes. Para comenzar, retire las soluciones insecticidas necesarias del congelador. Vórtice inmediatamente la solución o invierta cinco veces, y colóquela en un recipiente resistente a la luz a temperatura ambiente para dejar que los insecticidas se calienten a temperatura ambiente antes de usarlos.

Coloque cinco tubos de microcentrífuga con 0,5 mililitros de acetona cada uno. Llene el barril de la jeringa completamente con acetona del primer tubo. Luego expulse la acetona a un contenedor de desechos empujando rápidamente hacia abajo el émbolo y repita cuatro veces más para completar un total de cinco lavados de acetona de la misma alícuota de acetona.

Luego, llene el barril de la jeringa completamente con aire y expulse el aire y los posibles restos de acetona en el contenedor de desechos. Repetir dos veces más para completar tres lavados con aire. Cree una bolsa de aire dentro del barril entre el émbolo de la jeringa y la parte superior de la aguja tirando del émbolo aproximadamente cinco milímetros hacia el barril.

Etiquete los vasos de plástico con la identificación aleatoria para la evaluación de la mortalidad por ciegos. Usando un aspirador alimentado por succión de la inhalación, aspire el número deseado de mosquitos adultos de tres a cinco días de edad. Coloque la punta del aspirador en el tubo con algodón envuelto alrededor de la punta.

Exhale suavemente y golpee el aspirador para transferir los mosquitos a un tubo cónico. Use el algodón para tapar el tubo cuando se retire la punta del aspirador y luego cúbralo con la tapa. Derribe brevemente los mosquitos en los tubos colocándolos durante un mínimo de 10 minutos a cuatro grados centígrados o enterrándolos bajo el hielo en una bandeja de hielo.

Transfiera los mosquitos derribados a la tienda de manipulación de insectos. Coloque cuidadosamente los mosquitos en una bandeja de plástico colocada sobre el hielo y vierta alrededor de 50 mosquitos a la vez para asegurarse de que cada uno toque la bandeja fría debajo de ella y permanezca derribada. Clasifique los mosquitos por sexo recogiéndolos suavemente por las patas o las alas con fórceps, seguido de colocar cada sexo en una taza de sujeción separada y deténgase cuando se alcance el número deseado.

Durante la clasificación, elimine los mosquitos que estén heridos o que sean extra grandes o pequeños. Para registrar el peso de la taza de mosquitos, coloque una taza vacía con una placa de Petri como tapa en la báscula y tara la báscula. Vierta los mosquitos en el recipiente y coloque la tapa encima.

Coloque el recipiente en la báscula y registre el peso final, junto con el número de mosquitos. Inmediatamente coloque la taza de especímenes de nuevo sobre el hielo para mantenerlos inmovilizados hasta que se pesen todas las tazas del espécimen. Divida los mosquitos preparados en cinco a 10 tazas separadas colocadas sobre hielo, etiquetadas con identificaciones aleatorias.

Use pinzas y un mostrador de mano para lograr de 20 a 25 mosquitos por taza. Para clasificar las moscas de la fruta, anestesia las moscas usando dióxido de carbono durante siete segundos. Vierta las moscas en una bolsa de hielo envuelta en papel de banco.

Usando un pincel de punta fina, separe y cuente los machos y las hembras. Use el pincel para recoger suavemente las moscas elegidas y colóquelas en una botella de caldo limpia y vacía. Después de elegir el mismo número de moscas de la fruta macho y hembra, etiquete las botellas de stock con el nombre de la cepa y el total de moscas de la fruta.

Anestesiar la botella de moscas de la fruta usando dióxido de carbono durante siete segundos. Vierta las moscas de la fruta sobre papel de pesaje y use el papel como un embudo para introducir las moscas en un vial empañado etiquetado con una identificación aleatoria.Después de colocar la tapa de la placa de Petri encima del vial de moscas de la fruta, colóquela en la báscula. Registre el peso combinado y el número de especímenes en la hoja de puntuación.

Coloque inmediatamente el frasco de moscas de la fruta en una bandeja de hielo con la tapa todavía en la parte superior para evitar que las moscas se escapen. Cargue la jeringa con la concentración adecuada de insecticida, comenzando con la dosis menos concentrada y trabaje hacia la dosis más concentrada con cada grupo de organismos. Vierta las muestras sobre el papel de pesaje colocado sobre una bandeja sobre el hielo.

Separe las muestras que están muy juntas usando un pincel limpio sin insecticida o un hisopo de algodón para permitir un fácil acceso a cada muestra para la dosificación. Con la jeringa, aplique una gota de solución insecticida en el área ventral del tórax y el abdomen para los mosquitos y el dorso para las moscas de la fruta. Vierta inmediatamente las muestras de nuevo en el vaso de plástico etiquetado.

Cubra la taza con una red y una banda elástica. Tenga en cuenta un recuento de especímenes actualizado en la copa si algún espécimen fue asesinado, dañado o escapado en este proceso. Coloque la taza completa en una bandeja de sujeción.

Para la primera taza, registre el tiempo en que se completa la dosificación. Repita la dosificación de cada taza hasta que todos los especímenes hayan sido dosificados con las concentraciones adecuadas de insecticida, y registre la hora de finalización cuando todos los especímenes han sido dosificados. Proporcione una solución de sacarosa al 10% a cada taza a través de una bola de algodón húmeda y almacene los mosquitos y las moscas de la fruta a la temperatura y humedad deseadas.

Registre la mortalidad de los especímenes a las 24 horas después del inicio de la exposición a insecticidas. Clasificar a los mosquitos como vivos si pueden volar y mantenerse erguidos y muertos si son inmóviles o atáxicos, como lo describe la OMS. Siga la misma evaluación de mortalidad para las moscas de la fruta.

Después de realizar el bioensayo, se obtuvieron datos de dosis-respuesta con dos cepas que son el genotipo Rockefeller y IICC para el Aedes aegypti masculino y femenino. La dosis letal media relativizada en masa para Rockefeller e IICC fue de 0,008 y 0,336 nanogramos por miligramo, respectivamente. Los resultados no revelaron diferencias entre las curvas de dosis-respuesta de los mosquitos hembra y macho dentro de cada cepa.

Por lo tanto, los datos de ambos sexos se combinaron para calcular los valores medios de dosis letales. Dado que los intervalos de confianza del 95% para la dosis letal mediana de estas dos cepas no se superpusieron, estos valores se consideraron significativamente diferentes. Además, al calcular las proporciones de resistencia, la cepa IICC fue más de 40 veces más resistente que la cepa Rockefeller susceptible.

También se obtuvieron datos de dosis-respuesta para la mosca de la fruta, Drosophila melanogaster, cepa Canton-S, y se encontró que la dosis letal media relativizada en masa era de 0,213 nanogramos por miligramo. La consistencia es crítica, especialmente cuando se almacena y aplica el insecticida y se evalúa la mortalidad. Además, tenga cuidado al manipular el espécimen para evitar daños o muerte no inducidos por el insecticida.

Con este método, ahora podemos determinar con precisión la resistencia técnica de una población de mosquitos y cómo las condiciones ambientales afectan la resistencia o cómo la resistencia técnica predice la resistencia práctica.