Name: Aislamiento y multiplexación de núcleos de baja entrada con anticuerpos con códigos de barras de ganglios simpáticos de ratón para la secuenciación de ARN de un solo núcleo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-23T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Aprende a aislar y multiplexar núcleos de baja entrada con anticuerpos de códigos de barras desde ganglios simpáticos de ratón para secuenciación de ARN de un solo núcleo. Este método permite caracterizar neuronas cardíacas en salud y enfermedad.

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Agradecemos a Susan L. Kloet (Departamento de Genética Humana, LUMC, Leiden, Países Bajos) por su ayuda en el diseño experimental y las discusiones útiles. Agradecemos a Emile J. de Meijer (Departamento de Genética Humana, LUMC, Leiden, Países Bajos) por la ayuda con el aislamiento de ARN de un solo núcleo y la preparación de la biblioteca para la secuenciación. Este trabajo cuenta con el apoyo de la Organización Holandesa para la Investigación Científica (NWO) [016.196.346 a M.R.M.J.].

Este protocolo describe todos los pasos necesarios para el snRNA-seq de los ganglios cervicales murinos y/o cervicotorácicos (estrellados). Se utilizaron ratones C57BL/6J hembra y macho (15 semanas de edad, n = 2 para cada sexo). Se utilizó un ratón Wnt1-Cre;mT/mG adicional para visualizar los ganglios con fines de disección17,18. Este ratón adicional fue generado por el cruce de un ratón B6.Cg-Tg(Wnt1-cre)2Sor/J y un ratón B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J. Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio publicada por los NIH y aprobada por el Comité de Ética Animal de la Universidad de Leiden (número de licencia AVD1160020185325, Leiden, Países Bajos). Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles sobre todos los materiales, equipos, software y animales utilizados en el protocolo.
1. Preparativos
NOTA: Todos los pasos se realizan en un gabinete de flujo de cultivo celular.
<ol><li>Limpie las pinzas y tijeras sumergiendo los instrumentos en etanol al 70% durante 20 min.</li>
	<li>Preparar el medio ganglionar que consiste en Medio Neurobasal suplementado con B-27 más (1x), L-glutamina (2 mM) y 1% Antibiótico-Antimicótico. Precalentar el medio ganglionar a temperatura ambiente.</li>
	<li>Preparar la solución de digestión: 0,25% tripsina-EDTA (1:1) y 1.400 U/ml colagenasa tipo 2 disuelta en el medio ganglionar.</li>
	<li>Preparar tampón de lavado celular fresco y frío (4 °C) (0,4% de albúmina sérica bovina [BSA]) y tampón de lisis (10 mM Tris-HCl, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2 y detergente no iónico al 0,1%, 40 U/mL RNAse en agua libre de nucleasas) para el aislamiento del núcleo.</li>
	<li>Prepare el tampón de lavado del núcleo (1x solución salina tamponada con fosfato [PBS] con BSA al 2.0% e inhibidor de la RNasa 0.2U / μL).</li>
	<li>Prepare el tampón de tinción ST (ST-SB) (10 mM Tris-HCl, 146 mM NaCl, 21 mM MgCl2, 1 mM CaCl2, 2% BSA, 0.02% Tween-20 en agua libre de nucleasas).</li>
</ol>2. Disección de ganglios cervicales superiores (SCG) de ratón adulto
<ol><li>Sacrificar a los ratones y mantenerlos en hielo. NOTA: En el estudio actual, un total de 4 ratones C57BL6 / J fueron sacrificados por asfixia de CO2 . Alternativamente, se puede usar isoflurano seguido de exanguinación cuando se necesita recolectar una gran cantidad de sangre para otros fines de estudio.</li>
	<li>Fije el ratón en una tabla de disección con alfileres y rocíelo con etanol al 70% para minimizar la dispersión del pelaje (no es necesario afeitarse).</li>
	<li>Bajo un estereomicroscopio, abra la piel de la región del cuello haciendo un corte de línea media con tijeras, mueva las glándulas submandibulares a un lado y retire el músculo esternomastoideo para exponer y localizar la arteria carótida común y su bifurcación (Figura 1A, B, ver flecha).</li>
	<li>Diseccionar la bifurcación de la arteria carótida derecha e izquierda y el tejido adherido a ella. Transfiera cada pieza diseccionada de tejido a una placa de Petri separada de 3,5 cm que contenga PBS frío.</li>
	<li>Busque el SCG unido a la bifurcación carotídea. Limpie aún más el SCG extirpando la arteria y otro tejido adherido en la placa de Petri (Figura 1E).</li>
</ol>3. Disección de ganglios estrellados de ratón adultos (StG)
<ol><li>Para diseccionar el StG, haga un corte de línea media en el abdomen, seguido de abrir el diafragma y la pared torácica ventral.</li>
	<li>Retire el corazón y los pulmones para exponer el tórax dorsal. Busque el StG anterolateral izquierdo y derecho al musculus colli longus (MCL) a nivel de la primera costilla (Figura 1C, D, indicado por líneas discontinuas).</li>
	<li>Diseccionar stG izquierdo y derecho con fórceps y transferirlos por separado a placas de Petri de 3,5 cm que contengan PBS frío (Figura 1F). ​</li>
</ol>4. Aislamiento y criopreservación de células ganglionares de ratón
Los pasos 4-6 se resumen en la Figura 2.
<ol><li>Transfiera cuidadosamente todos los SCG y StG individuales para separar los tubos de microcentrífuga de 1,5 ml con fórceps. NOTA: No use puntas de pipeta para transferir los ganglios porque los ganglios son propensos a adherirse a la pared de las puntas de pipeta de plástico.</li>
	<li>Añadir 500 μL de solución de tripsina-EDTA al 0,25% a cada tubo de microcentrífuga e incubar en un baño de agua agitadora a 37 °C durante 40 min. NOTA: Este paso tiene como objetivo facilitar la digestión y la liberación celular en lo sucesivo en la solución de colagenasa tipo 2.</li>
	<li>Prepare un tubo de 15 ml que contenga 5 ml de medio ganglionar para cada muestra. Permita que los ganglios se asienten en la parte inferior de los tubos de la microcentrífuga. Recoja el sobrenadante, que contiene muy pocas células ganglionares, transfiera el sobrenadante a los tubos preparados de 15 ml y etiquete cada tubo. Alternativamente, para ahorrar algo de tiempo, aspire el sobrenadante de tripsina-EDTA sin recolección, ya que se pueden detectar muy pocas células disociadas en él. NOTA: Se puede dejar una pequeña cantidad de solución de tripsina-EDTA (~ 10-30 μL) en el tubo de la microcentrífuga para evitar la eliminación de los ganglios. Evite el pipeteo en este paso porque puede dañar los ganglios y conducir a una baja producción de células ganglionares después.</li>
	<li>Añadir 500 μL de solución de colagenasa tipo 2 en cada tubo de microcentrífuga e incubar en un baño de agua agitadora a 37 °C durante 35-40 min. Trate de resuspendir el ganglio después de 35 minutos; si el ganglio todavía está intacto y no se disocia, prolongue el tiempo de incubación o aumente la concentración de solución de colagenasa tipo 2 según sea necesario. NOTA: El tiempo de incubación puede variar dependiendo del tamaño del ganglio.</li>
	<li>Resuspend los ganglios en solución de colagenasa mediante pipeteo hacia arriba y hacia abajo ~ 10 veces o hasta que ya no se detecten grupos de tejido.</li>
	<li>Transfiera la suspensión celular al tubo de 15 ml utilizado anteriormente que contiene el medio de cultivo de ganglios y la suspensión de tripsina-EDTA del mismo ganglio. Gire hacia abajo la suspensión de la celda con una centrífuga de rotor de cuchara oscilante durante 10 minutos, 300 × g a temperatura ambiente. Deseche cuidadosamente el sobrenadante celular. NOTA: Debido a que las células ganglionares están disociadas de un solo ganglio, la bolita celular puede ser demasiado pequeña para detectarla a simple vista; se puede dejar una pequeña cantidad de sobrenadante en el tubo para evitar la eliminación accidental de la bolita celular.</li>
	<li>Resuspend las células ganglionares en 270 μL de suero fetal bovino (FBS, endotoxina baja) y transferir cada suspensión célula-FBS a un criovial de 1 mL.</li>
	<li>Para contar las células, mezcle 5 μL de la suspensión de células ganglionares con 5 μL de colorante azul tripano al 0,4% y cargue la mezcla en un hemocitómetro. Cuente el número total y de células vivas bajo un microscopio. NOTA: La viabilidad celular (recuento de células vivas/recuento total de células = viabilidad %) suele estar por encima del 90% con este protocolo de disociación. El recuento de células vivas de un solo ganglio (ya sea SCG o StG) generalmente cae dentro del rango de 9,000-60,000 células cuando el ganglio se aísla de un ratón de 12 a 16 semanas de edad.</li>
	<li>Agregue 30 μL de dimetilsulfóxido (DMSO) a cada suspensión de células-FBS en los crioviales, mezcle bien y transfiera los crioviales a un recipiente de congelación celular, que se mantiene a temperatura ambiente. Guarde el recipiente cargado de criovial a -80 ° C durante la noche y transfiera los crioviales a nitrógeno líquido al día siguiente para su preservación a largo plazo antes de la secuenciación.</li>
</ol>5. Aislamiento del núcleo
NOTA: El SCG izquierdo y derecho aislado de cuatro ratones (en total 8 muestras) se utilizó como ejemplo en la siguiente preparación de aislamiento y secuenciación del núcleo. Mantenga todo en hielo durante todo el procedimiento. Debido a la invisibilidad de los pequeños gránulos de núcleo, se recomienda encarecidamente una centrífuga con cubos oscilantes para facilitar la eliminación del sobrenadante durante todo el procedimiento.
<ol><li>Preparar tubos de 15 ml con un colador (30 μm) en la parte superior y preenar el colador con 1 ml del medio ganglionar.</li>
	<li>Saque los crioviales del nitrógeno líquido e inmediatamente descongele en un baño de agua a 37 °C. Cuando quede una pequeña bolita de hielo en el criovial, saque los crioviales del baño de agua.</li>
	<li>Recupere las células ganglionares dejando caer 1 ml del medio ganglionar en cada criovial mientras se agita cuidadosamente con la mano. Opcional: Para evaluar la recuperación celular, mezcle la suspensión celular después de la recuperación y saque 5 μL de suspensión celular para el conteo de células vivas, como se describe en el paso 4.8.</li>
	<li>Cargue cada suspensión de células ganglionares en un colador separado (preparado en el paso 5.1) y enjuague cada colador con 4-5 ml de medio ganglionar.</li>
	<li>Centrifugar la suspensión celular tensada durante 5 min a 300 × g, retirar el sobrenadante con cuidado y resuspendir las células en 50 μL de tampón de lavado celular.</li>
	<li>Transfiera la suspensión celular a un tubo de microcentrífuga de ADN/ARN de baja unión de 0,5 ml.</li>
	<li>Centrifugar la suspensión celular a 500 × g durante 5 min a 4 °C.</li>
	<li>Retire 45 μL del sobrenadante sin tocar la parte inferior del tubo para evitar desalojar la bolita celular.</li>
	<li>Agregue 45 μL de tampón de lisis refrigerado y pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo con una punta de pipeta de 200 μL.</li>
	<li>Incubar las células durante 8 min sobre hielo.</li>
	<li>Añadir 50 μL de tampón de lavado de núcleo frío a cada tubo. No mezclar.
</li>
	<li>Centrifugar la suspensión del núcleo a 600 × g durante 5 min a 4 °C.</li>
	<li>Retire 95 μL del sobrenadante sin interrumpir el núcleo pellet.</li>
	<li>Agregue 45 μL de tampón de lavado de núcleo refrigerado al pellet. Opcional: Tomar 5 μL de suspensión de núcleo, mezclar con 5 μL de azul de tripano al 0,4% para contar, y comprobar la calidad de los núcleos bajo un microscopio con un hemocitómetro.</li>
	<li>Centrifugar la suspensión del núcleo a 600 × g durante 5 min a 4 °C.</li>
	<li>Retire el sobrenadante sin tocar la parte inferior del tubo para evitar desalojar el núcleo pellet.</li>
</ol>6. Código de barras nucleus con hashtag oligos (HTOs) y multiplexación
NOTA: Los pasos de tinción HTO fueron modificados y optimizados para el etiquetado nuclear de cantidades muy bajas de núcleos (ganglionares) de acuerdo con la aplicación previa en tejido cortical por Gaublomme et al.15.
<ol><li>Agregue 50 μL de tampón ST-SB al gránulo del núcleo, pipetee suavemente 8-10 veces hasta que los núcleos se resuspendan por completo.</li>
	<li>Añadir 5 μL de reactivo de bloqueo de Fc por 50 μL de la mezcla ST-SB/núcleos e incubar durante 10 min sobre hielo.</li>
	<li>Añadir 1 μL (0,5 μg) de anticuerpo hashtag de un solo núcleo por tubo de la mezcla ST-SB/núcleos e incubar durante 30 min en hielo. NOTA: Un tiempo de incubación más corto conduce a una menor eficiencia del etiquetado de hashtags, como se demuestra en los resultados representativos.</li>
	<li>Añadir 100 μL de ST-SB a cada tubo. No mezclar.
</li>
	<li>Centrifugar la suspensión del núcleo durante 5 min, 600 × g a 4 °C.</li>
	<li>Retire 145 μL del sobrenadante sin interrumpir el núcleo pellet.</li>
	<li>Repita los pasos 6.4 y 6.5. Retire el sobrenadante tanto como sea posible sin tocar la parte inferior del tubo para evitar desalojar el núcleo pellet.</li>
	<li>Resuspend el núcleo pellet en 50 μL de ST-SB, y mezclar suavemente los núcleos.</li>
	<li>Tome 5 μL de la suspensión del núcleo y mézclelo con 5 μL de azul de tripano al 0,4% para contar los núcleos bajo un microscopio. Vea la Figura 3A para una imagen representativa de núcleos mezclados con azul tripano y cargados en un hemocitómetro.</li>
	<li>Centrifugar la suspensión del núcleo durante 5 min a 600 × g a 4 °C.</li>
	<li>Resuspendir los núcleos en ST-SB para alcanzar una concentración de núcleo objetivo de 1.000-3.000 núcleos/μL para cada muestra de acuerdo con el recuento de núcleos correspondiente.</li>
	<li>Agrupe las muestras para lograr el número deseado de celdas. NOTA: Por ejemplo, en este experimento, 8 muestras se agruparon igualmente para lograr un total de 25,000 núcleos para proceder inmediatamente a 10x Genomics Chromium y snRNA-seq después. El recuento de núcleos generalmente cae dentro del rango de 6,000-40,000 células cuando el ganglio se aísla de un ratón de 12 a 16 semanas. Solo alrededor de la mitad del total de núcleos cargados puede ser capturado por snRNA-seq basado en gotas. Por ejemplo, se preparó una mezcla de 25.000 núcleos para garantizar la captura de 10.000 núcleos, que es necesaria para una mayor preparación y secuenciación de la biblioteca.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Aquí, se describe un protocolo detallado que se centra en i) la disección de los ganglios simpáticos cervicales y estrellados superiores de ratón adulto, ii) el aislamiento y criopreservación de las células ganglionares, iii) el aislamiento del núcleo y iv) el código de barras del núcleo con etiquetado HTO para fines de multiplexación y snRNA-seq.
Con este protocolo, las células ganglionares simpáticas se pueden obtener fácilmente disociando los ganglios individuales utilizando tripsina y cola...

El sistema nervioso autónomo (SNA) es una parte crucial del sistema nervioso periférico que mantiene la homeostasis corporal, incluida la adaptación a las condiciones ambientales y la patología1. Está involucrado en la regulación de múltiples sistemas de órganos en todo el cuerpo, como los sistemas cardiovascular, respiratorio, digestivo y endocrino. El SNA se divide en ramas simpáticas y parasimpáticas. Las ramas espinales del sistema nervioso simpático hacen sinapsis en los ganglios de la cadena simpática, situadas bilateralmente en posición paravertebral. Los ganglios cervicales y torácicos bilaterales, especialmente el StG, son componentes importantes que participan en la inervación simpática cardíaca. En estados de enfermedad, como la isquemia cardíaca, puede ocurrir una remodelación neuronal, lo que resulta en una sobremarcha simpática2. La remodelación neuronal se ha demostrado en múltiples estudios histológicos en humanos y varias otras especies animales 3,4,5,6. Actualmente falta una caracterización biológica detallada de la remodelación neuronal inducida por isquemia cardíaca en los ganglios simpáticos cardíacos, y las características biológicas fundamentales de los tipos o subtipos de células neuronales especializadas dentro del sistema nervioso simpático cardíaco (SNS) aún no están completamente determinadas en salud y enfermedad7.
Nuevas tecnologías, como scRNA-seq, han abierto puertas de entrada para la caracterización genética de tejidos pequeños a nivel unicelular 8,9. Sin embargo, el tamaño relativamente grande de las neuronas puede impedir el uso optimizado de estas técnicas unicelulares en humanos10. Además, la secuenciación de una sola célula requiere un alto rendimiento de células para recuperar un número suficiente de células debido a una alta pérdida en el proceso de secuenciación. Esto podría resultar desafiante cuando se estudian tejidos pequeños que son difíciles de capturar en una sesión y requieren múltiples muestras para introducir suficientes células individuales para la secuenciación. La tecnología snRNA-seq basada en gotas recientemente desarrollada (es decir, la plataforma 10x Chromium) permite el estudio de las diferencias biológicas entre núcleos individuales11,12. snRNA-seq tiene una ventaja sobre scRNA-seq para células grandes (>30 μm), que pueden no ser capturadas en Gel Bead en Emulsiones (GEMs), así como una mejor compatibilidad con disociación extensa y/o preservación prolongada 13,14,15.
La heterogeneidad, el número de células neuronales y otras células enriquecidas en el SNS cardíaco son aspectos importantes para la caracterización del SNA en estados de salud y enfermedad. Además, la inervación específica del órgano o región por cada ganglio simpático contribuye a la complejidad del SNS. Además, se ha demostrado que los ganglios cervicales, estrellados y torácicos de la cadena simpática inervan diferentes regiones del corazón16. Por lo tanto, es necesario realizar un análisis de núcleo único de células ganglionares derivadas de ganglios individuales para estudiar su arquitectura biológica.
El snRNA-seq basado en gotas permite el perfil de expresión de todo el transcriptoma para un grupo de miles de células de múltiples muestras a la vez con costos más bajos que las plataformas de secuenciación basadas en placas. Este enfoque permite que el snRNA-seq basado en gotas sea más adecuado para la clasificación del fenotipo celular y la identificación de nuevas subpoblaciones de células dentro del SCG y el StG. En particular, este protocolo proporciona un enfoque paso a paso conciso para la identificación, el aislamiento y la secuenciación del ARN de un solo núcleo de los ganglios cardíacos extrínsecos simpáticos, un método que tiene el potencial de una amplia aplicación en estudios de la caracterización de los ganglios que inervan otros órganos y tejidos relacionados en salud y enfermedad.

<table><tbody><tr><td><fuerte>Productos químicos y reactivos</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,25% Tripsina-EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>0,4% tinte azul de tripano</td><td>Bio-Rad</td><td>1450021</td><td></td></tr><tr><td>Antibiótico-Antimicótico</td><td>Gibco</td><td>15240096</td><td></td></tr><tr><td>B-27</td><td>Gibco</td><td>A3582801</td><td></td></tr><tr><td>Colagenasa tipo 2</td><td>Worthington</td><td></td><td>LS004176 utilizar 1.400 U/mL</td></tr><tr><td>de dimetilsulfóxido Sigma</td><td>Aldrich</td><td>67685</td><td></td></tr><tr><td>etanol absoluto &ge; 99.5%</td><td>VWR</td><td>VWRC83813.360</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (baja endotoxina)</td><td>Biowest</td><td>S1810-500</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030024</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal Medium</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina 10%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1595-50ML</td><td>Tampón de lavado celular</td></tr><tr><td>DPBS (Ca2+, Mg2+</sin > sup)</td><td>Gibco</td><td>14190-169</td><td>Tampón de lavado celular</td></tr><tr><td>Solución de cloruro de magnesio, 1 M</td><td>Tampón de lisis del núcleo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1028</td></tr><tr><td>Nonidet P40 Sustituto (detergente no iónico)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>74385</td><td>Tampón de lisis del núcleo</td></tr><tr><td>Agua libre de nucleasa (no tratada con DEPC)</td><td>Tampón</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>de lisis del núcleo Invitrogen AM9937Protector Inhibidor de la ARNasa, 40 U/&micro; L</td><td>Tampón de lisis</td><td>del núcleo 3335399001</td><td>Sigma-Aldrich</td></tr> Albúmina sérica de <tr><td>sodio, 5 M</td><td>Tampón de lisis del núcleo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>59222C</td></tr><tr><td>Solución de clorhidrato de Trizma, 1 M, pH 7,4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T2194 Tampón</td> de <td>lisis del núcleo</td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina 10%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1595-50ML</td><td>Lavado del núcleo</td></tr><tr><td>DPBS (Ca2+, Mg2+free)</td><td>Gibco</td><td>14190-169</td><td>Protector de lavado de núcleo</td></tr><tr><td>Inhibidor de RNasa,40 U/&micro; L</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3335399001</td><td>Nucleus wash</td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina 10%</td>Tampón de tinción <td>Sigma-Aldrich</td><td>A1595-50ML</td><td>ST (ST-SB)</td></tr><tr><td>Solución de cloruro de calcio, 1 M</td> Tampón de tinción <td>Sigma-Aldrich</td><td>21115-100ML</td><td>ST (ST-SB)</td></tr><tr><td>Solución de cloruro de magnesio, 1 M</td> Tampón de tinción <td>Sigma-Aldrich</td><td>M1028</td><td>ST (ST-SB)</td></tr><tr><td>Agua libre de nucleasa (no DEPC tratado)</td><td>Invitrogen</td><td>AM9937</td><td>Tampón de tinción ST (ST-SB)</td></tr><tr><td>Solución de cloruro de sodio, 5M</td> Tampón de tinción <td>Sigma-Aldrich</td><td>59222C</td><td>ST (ST-SB)</td></tr><tr><td>Solución de clorhidrato de Trizma, 1M, pH 7,4</td> Tampón de tinción <td>Sigma-Aldrich</td><td>T2194</td><td>ST (ST-SB)</td></tr><tr><td>Tween-20</td> Tampón de tinción <td>822184</td><td>ST de Merck Millipore</td><td>(ST-SB)</td></tr><tr><td>TotalSeq-A0451 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 1 Anticuerpo</td><td>Biolegend</td><td>682205</td><td>Hashtag anticuerpo</td></tr><tr><td>TotalSeq-A0452 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 2 Anticuerpo</td><td>Biolegend</td><td>682207</td><td>Hashtag anticuerpo</td></tr><tr><td>TotalSeq-A0453 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 3 Anticuerpo</td><td>Biolegend</td><td>682209</td><td>Hashtag anticuerpo</td></tr><tr><td>TotalSeq-A0461 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 11 Anticuerpo</td><td>Biolegend</td><td>682225</td><td>Hashtag anticuerpo</td></tr><tr><td>TotalSeq-A0462 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 12 Anticuerpo</td><td>Biolegend</td><td>682227</td><td>Hashtag anticuerpo</td></tr><tr><td>TotalSeq-A0463 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 13 Anticuerpo</td><td>Biolegend</td><td>682229</td><td>Hashtag anticuerpo</td></tr><tr><td>TotalSeq-A0464 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 14 Anticuerpo</td><td>Biolegend</td><td>682231</td><td>Hashtag</td></tr><tr><td>anticuerpo TotalSeq-A0465 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 15</td><td>Anticuerpo Biolegend</td><td>682233</td><td>Hashtag anticuerpo</td></tr><tr><td>TruStain FcX (humano)</td><td>Biolegend</td><td>422302</td><td>solución de bloqueo de receptores</td></tr> <tr><td>FC<fuerte>Equipos y consumibles</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Línea brillante&nbsp; Hemacitómetro</td><td>Merck</td><td>Z359629-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga 5702/R A-4-38</td><td>Eppendorf</td><td>&nbsp; </td><td></td>EP022629905</tr><tr><td>CoolCell LX Contenedor de congelación de celdas</td><td>Corning</td><td>CLS432003-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Cryovial</td><td>Thermo Scientific</td><td>479-6840</td><td></td></tr><tr><td>DNA LoBind 0,5 mL Tubo Eppendorf</td><td>Eppendorf</td><td>EP0030108035-250EA</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Tubos Safe-Lock 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>30121872</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 35 mm No tratado con TC Placa de</td><td>Petri Corning</td><td></td><td></td>351008</tr><tr><td>Falcon 15 mL Tubos de centrífuga cónicos Pinzas</td> de <td>10773501</td><td></td><td>Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Dumont #5</td><td>Herramientas de ciencia fina</td><td>11252-40</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras finas endurecidas</td><td>Herramientas de ciencia fina</td><td>14091-09</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Bandeja de hielo, rectangular 4 L</td><td>Naranja Corning</td><td>CLS432106-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Leica MS5</td><td>Microscopio</td><td>Leica</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras Moria MC50</td><td>Herramientas de ciencia fina</td><td>15370-50</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de resorte Noyes Herramientas de</td><td>ciencia fina</td><td>15012-12</td><td></td></tr><tr><td>Olympus CK2 ULWCD</td><td>Microscopio</td><td>Olympus</td><td></td></tr><tr><td>P10</td><td>Gilson</td><td>F144802</td><td></td></tr><tr><td>Filtros de preseparación P1000</td><td>Gilson</td><td>F123602</td><td></td></tr><tr><td>P200</td><td>Gilson</td><td>F123601</td><td></td></tr><tr><td>(30 &micro; m)</td><td>Miltenyi biotec</td><td>Miltenyi biotec130-041-407</td><td></td></tr><tr><td>Baño de agua agitado</td><td>GFL</td><td>1083</td><td></td></tr><tr><td>Placa de silicona</td><td>RubberBV</td><td>3530</td><td>Tablero de disección</td></tr><tr><td>Software y paquetes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell ranger</td><td>V4.0.0</td><td></td><td></td></tr><tr><td>R programación</td><td>V4.1.1</td><td></td><td></td></tr><tr><td>R sudio</td><td>V1.3.1073</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seurat</td><td>V4.0</td><td></td><td></td></tr><tr><td>tydiverso</td><td>V1.3.1</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Animals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B6. Ratón Cg-Tg(Wnt1-cre)2Sor/J</td><td>El Laboratorio Jackson</td><td>JAX stock #022501</td><td></td></tr><tr><td>B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomate,-EGFP)Ratón Luo/J</td><td>El Laboratorio Jackson</td><td>JAX stock #007576</td><td></td></tr><tr><td>ratones C57BL/6J</td><td>Charles River</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Code para el análisis de datos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td>https://github.com/rubenmethorst/Single-cell-SCG_JoVE</tr></tbody></table>

aislamiento y multiplexación de núcleos de baja entrada con anticuerpos con códigos de barras de ganglios simpáticos de ratón para la secuenciación de arn de un solo núcleo

Low-input Nucleus Isolation and Multiplexing with Barcoded Antibodies of Mouse Sympathetic Ganglia for Single-nucleus RNA Sequencing

El sistema nervioso autónomo cardíaco es crucial en el control de la función cardíaca, como la frecuencia cardíaca y la contractilidad cardíaca, y se divide en ramas simpáticas y parasimpáticas. Normalmente, existe un equilibrio entre estas dos ramas para mantener la homeostasis. Sin embargo, los estados de enfermedad cardíaca como el infarto de miocardio, la insuficiencia cardíaca y la hipertensión pueden inducir la remodelación de las células involucradas en la inervación cardíaca, que se asocia con un resultado clínico adverso.
Aunque existen grandes cantidades de datos sobre la estructura histológica y la función del sistema nervioso autónomo cardíaco, su arquitectura biológica molecular en salud y enfermedad sigue siendo enigmática en muchos aspectos. Las nuevas tecnologías, como la secuenciación de ARN unicelular (scRNA-seq), son prometedoras para la caracterización genética de tejidos a resolución de una sola célula. Sin embargo, el tamaño relativamente grande de las neuronas puede impedir el uso estandarizado de estas técnicas. Aquí, este protocolo explota la secuenciación de ARN de un solo núcleo basada en gotas (snRNA-seq), un método para caracterizar la arquitectura biológica de las neuronas simpáticas cardíacas en la salud y la enfermedad. Se ha demostrado un enfoque gradual para realizar snRNA-seq de los ganglios cervicales superiores bilaterales (SCG) y estrellados (StG) diseccionados de ratones adultos.
Este método permite la preservación de muestras a largo plazo, manteniendo una calidad de ARN adecuada cuando las muestras de múltiples individuos / experimentos no se pueden recolectar todas a la vez en un corto período de tiempo. El código de barras de los núcleos con oligos de hashtag (HTO) permite el demultiplexo y el rastreo de distintas muestras ganglionares después de la secuenciación. Los análisis posteriores revelaron una captura exitosa de núcleos de células neuronales, gliales satélites y endoteliales de los ganglios simpáticos, según lo validado por snRNA-seq. En resumen, este protocolo proporciona un enfoque gradual para snRNA-seq de ganglios cardíacos extrínsecos simpáticos, un método que tiene el potencial de una aplicación más amplia en estudios de la inervación de otros órganos y tejidos.

Análisis de control de calidad de la preparación de la biblioteca de ADNc de núcleo único y snRNA-seq Los resultados representativos describen los resultados de secuenciación de 10.000 núcleos capturados en un solo grupo con una biblioteca de expresión génica de 25.000 lecturas/núcleo y una biblioteca de hashtags de 5.000 lecturas/núcleo. La Figura 3B ilustra los resultados del control de calidad del1er hebra de ADNc, la biblioteca de expresión génica (GEX) y l...

Este protocolo describe la preparación detallada de muestras de bajo aporte para la secuenciación de un solo núcleo, incluida la disección de ganglios cervicales y estrellados superiores de ratón, disociación celular, criopreservación, aislamiento de núcleos y código de barras hashtag.

Aislamiento y multiplexación de núcleos de baja entrada con anticuerpos con códigos de barras de ganglios simpáticos de ratón para la secuenciación de ARN de un solo núcleo

The cardiac autonomic nervous system is crucial in controlling cardiac function, such as heart rate and cardiac contractility, and is divided into ...

En este protocolo JoVE, utilizamos la secuenciación de ARN de un solo núcleo basada en gotas para caracterizar la arquitectura biológica de las neuronas simpáticas cardíacas en la salud y la enfermedad. Este método permite la secuenciación de una gran colección de muestras neuronales durante un período de tiempo. Al tirar de núcleos con código de barras con hashtag oligos, este método permite la multiplexación de las muestras.Este método tiene el potencial de extenderse a la secuenciación de neuronas de los ganglios humanos, lo que ha sido un desafío debido a su gran tamaño celular y la difícil recolección simultánea de muestras. Demostrando el procedimiento estarán Conny van Munsteren, técnico de investigación, y Lieke van Roon, estudiantes de doctorado de nuestro laboratorio Comience recolectando todos los materiales necesarios para la disección, luego fije el ratón en el tablero de disección. Humedezca el ratón con 70% de etanol para minimizar la dispersión del pelaje.Abra la piel de la región del cuello haciendo un corte de línea media con tijeras. Bajo un microscopio estereoscópico, mueva las glándulas submandibulares a un lado y retire el músculo mastoideo esternal para exponer la arteria carótida común y su bifurcación, así como los ganglios cervicales superiores y elimine el tejido unido a ella. Diseccionar la bifurcación de la arteria carótida derecha e izquierda y el tejido adherido a ella.Transfiera cada pieza diseccionada de tejido a una placa de Petri separada de 3,5 centímetros que contenga PBS frío. Localice los ganglios cervicales superiores unidos a la bifurcación carotídea. Limpie los ganglios cervicales superiores extirpando la arteria y el tejido adherido.Para diseccionar los ganglios estrellados, haga un corte de la línea media en el abdomen, seguido de abrir el diafragma y la pared torácica ventral. Extirpar los pulmones, seguido del corazón, para exponer el tórax dorsal. A nivel de la primera costilla, localice los ganglios estrellados izquierdo y derecho anterolateral al musculus colli longus.Diseccionar ambos ganglios estrellados con fórceps mediante la eliminación del tejido circundante. Transfiéralos a placas de Petri de 3,5 centímetros que contengan PBS frío. Usando fórceps, transfiera los ganglios cervicales superiores y los ganglios estrellados para separar los tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros y luego agregue 500 microlitros de solución de tripsina-EDTA al 0,25% a cada tubo e incube en un baño de agua agitada.Permita que los ganglios se asienten en la parte inferior de los tubos de la microcentrífuga. Transfiera el sobrenadante a un tubo de 15 mililitros que contenga cinco mililitros de medio ganglionar. A los tubos de la microcentrífuga, agregue 500 microlitros de solución de colagenasa tipo 2 e incube en un baño de agua agitada.Después de la incubación, vuelva a suspender los ganglios en solución de colagenasa mediante pipeteo hasta que ya no se detecten grupos de tejido. Transfiera la suspensión celular al tubo de 15 mililitros utilizado anteriormente que contiene el medio de cultivo de ganglios con suspensión de tripsina-EDTA. Centrifugar la suspensión celular y desechar el sobrenadante celular.Resuspend el pellet en 270 microlitros de suero fetal bovino y transfiéralo a un criovial de 1 mililitro. Para contar las células, mezcle 5 microlitros de la suspensión celular ganglionar con cinco microlitros de colorante azul tripano al 0,4%. Cargue la mezcla en un hemocitómetro y cuente el número total y de células vivas bajo un microscopio.A continuación, agregue 30 microlitros de dimetilsulfóxido a cada criovial y mezcle bien. Transfiera los crioviales a un recipiente de congelación celular y colóquelo a menos 80 grados centígrados durante la noche. Prepare tubos de 15 mililitros con un colador de 30 micrómetros en la parte superior.Enjuague previamente el colador con 1 mililitro de medio ganglionar. Saque los crioviales del nitrógeno líquido e inmediatamente descongelarlos en un baño de agua a 37 grados centígrados hasta que quede una pequeña bolita de hielo en el criovial. Agregue 1 mililitro del medio ganglionar en cada criovial mientras agita cuidadosamente el vial para recuperar las células ganglionares.Cargue la suspensión de células ganglionares en el colador y enjuague con 4 a 5 mililitros de medio ganglionar. Centrifugar la suspensión celular tensa. Retire el sobrenadante y resuspenda las células en 50 microlitros de tampón de lavado celular.Transfiera la suspensión celular a un tubo de microcentrífuga de baja unión de 0,5 mililitros. Centrifugar la suspensión celular. Una centrífuga con un rotor de cucharón oscilante es esencial a partir de ahora.Después de la centrifugación, retire 45 microlitros del sobrenadante sin desalojar la bolita celular. Agregue 45 microlitros de tampón de lisis refrigerado, mezclado suavemente por pipeteo, e incube las células durante 8 minutos en hielo, luego agregue 50 microlitros de tampón de lavado de núcleos fríos a cada tubo. Centrifugar la suspensión de núcleos y retirar 95 microlitros del sobrenadante sin interrumpir el pellet de núcleos.Agregue 45 microlitros de tampón de lavado de núcleos refrigerados al pellet, repita la centrifugación y retire el sobrenadante. Al núcleo pellet, agregue 50 microlitros de ST-SB y pipetee suavemente hasta que los núcleos estén completamente resuspendidos, luego agregue 5 microlitros de reactivo de bloqueo FC e incube durante 10 minutos en hielo. A continuación, agregue 1 microlitro de anticuerpo hashtag de un solo núcleo e incube durante 30 minutos en hielo.Después de la incubación, agregue 100 microlitros de ST-SB a cada tubo. Centrifugar la suspensión y retirar 145 microlitros del sobrenadante sin interrumpir el pellet de núcleos. Repita la centrifugación y retire el sobrenadante.Resuspend los núcleos pellet en 50 microlitros de ST-SB y mezclar suavemente. Tome 5 microlitros de la suspensión de núcleos y mézclelo con 5 microlitros de azul de tripano al 0,4% para contar los núcleos bajo un microscopio. Una vez más, centrifugue la suspensión de núcleos y resuspenda el pellet de núcleos en ST-SB para lograr una concentración de núcleos objetivo de 1, 000 a 3, 000 núcleos por microlitro.Tire de las muestras para lograr el número deseado de células. El análisis de control de calidad para la preparación de la biblioteca mostró cDNA oligoderivados de hashtag menores que 180 pares de bases. Un pico amplio de 300 a 1,000 pares de bases representó una biblioteca de expresión génica de alta calidad, mientras que un pico específico de 194 pares de bases mostró la biblioteca de oligo hashtag.El análisis de secuenciación de ARN de un solo núcleo reveló que 12 grupos que fueron visualizados por UMAP y los anticuerpos hashtag se distribuyeron entre todos los grupos. El etiquetado específico por hashtag oligos fue confirmado por la expresión de Xist. Los hashtags 1 a 4 etiquetaron a las mujeres, mientras que de 5 a 8 etiquetaron a las muestras masculinas.La calidad y la resolución de los datos de secuenciación se verificaron mediante transcripciones clave como TH, DBH y SNAP25 en los grupos 5 y 7 para las neuronas simpáticas, S100B en los grupos 0 a 3 para las células gliales satélite, PECAM 1 en el grupo 4 para las células endoteliales y ACTA2 en el grupo 8 para las células estromales. Al intentar este método, es importante recordar la preparación adecuada y el equipo adecuado, como tijeras de disección fina, pinzas afiladas y una centrífuga con un rotor de cucharón oscilante son esenciales. El enfoque gradual para la secuenciación de ARN de un solo núcleo de ganglios cardíacos extrínsecos simpáticos tiene el potencial de una amplia aplicación en la caracterización de los ganglios que inervan otros órganos y tejidos relacionados en la salud y la enfermedad.

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Aislamiento y multiplexación de núcleos de baja entrada con anticuerpos con códigos de barras de ganglios simpáticos de ratón para la secuenciación de ARN de un solo núcleo (Video) | JoVE Journal

Aislamiento y multiplexación de núcleos de baja entrada con anticuerpos con códigos de barras de ganglios simpáticos de ratón para la secuenciación de ARN de un solo núcleo

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