Un método paso a paso para detectar anticuerpos neutralizantes contra AAV utilizando un ensayo colorimétrico basado en células

Los anticuerpos preexistentes que neutralizan el AAV representan una barrera para el avance de las terapias génicas con AAV. Este ensayo es una herramienta de detección para detectar anticuerpos neutralizantes contra el AAV. La principal ventaja es que es rentable, eficiente en el tiempo, fácil de configurar y requiere habilidades técnicas mínimas, equipos de laboratorio y reactivos.

Comience a enchapar las células HT1080 el primer día diluyendo las células a una concentración de 1 x 10 a la quinta célula por mililitro en medios DMEM completos precalentados. Luego sembra 100 microlitros de células por pozo en placas claras de fondo plano de 96 pocillos a la concentración de 1 x 10 a la cuarta célula por pozo. Incubar la placa a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono durante la noche durante 16 a 22 horas.

En el segundo día, generar diluciones seriadas de las muestras de suero de interés en tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros utilizando DMEM completo precalentado. A cada tubo con muestras de suero diluido, agregue 66 microlitros de la solución de trabajo de 7.5x10 al genoma viral de seis por microlitro de virus. Mezcle la dilución del suero del virus mediante pipeteo y luego coloque los tubos que contienen las mezclas de suero del virus en una incubadora a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono durante 30 minutos para permitir que ocurra una posible neutralización.

Después de 30 minutos, pipetee 100 microlitros de la mezcla de suero del virus a cada pocillo en la placa de 96 pocillos que contiene 1x10 a la cuarta célula por pozo, luego envuelva la placa en una lámina para colocarla en una incubadora a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono durante la noche durante 16 a 24 horas. En el tercer día, aspire los medios de los pocillos de la placa de 96 pocillos utilizando un vacío de campana de humos sin interrumpir las células adheridas y agregue 50 microlitros de paraformaldehído al 4% a cada pozo. Después de envolver el plato en papel de aluminio, déjelo durante 10 minutos a temperatura ambiente.

Más tarde, lave y aspire las células dos veces con 200 microlitros de PBS a temperatura ambiente. Después del segundo lavado, pipetee 200 microlitros de PBS precalentado en cada pozo y envuelva la placa en papel de aluminio seguido de incubación a 65 grados Celsius durante 90 minutos para desnaturalizar la actividad de la fosfatasa alcalina endógena, después de la incubación a 50 microlitros del BCIP / NBT disuelto recién preparado en cada pozo e incube las placas envueltas a temperatura ambiente durante dos a 24 horas. Más tarde, tome fotos de cada pozo usando una lente de objetivo 4X en una cámara de microscopio de luz, asegurando el uso consistente de la misma exposición, equilibrio de blancos y configuraciones de luz para todos los ensayos.

Para analizar la imagen en ImageJ, seleccione el archivo y haga clic en Abrir. Para las imágenes coloreadas, convierta a escala de grises seleccionando las pestañas Imagen, Tipo y 8 bits en orden. Luego vaya a la pestaña Imagen y seleccione Ajustar y Umbral para alterar el umbral hasta que todas las áreas de color estén coloreadas y rojas, pero el fondo no lo esté.

haga clic en Analizar y establecer mediciones y marque las casillas de verificación Área, Fracción de área, Límite al umbral y Etiqueta de visualización antes de presionar OK.To determinar la lectura de la señal de un pozo determinado, haga clic en Analizar y medir para que la columna de área porcentual de la ventana emergente muestre la lectura de la señal. El estudio estableció la dosis viral óptima mediante la adición del gen reportero AAV6-hPLAP en las células a un rango de concentraciones del genoma viral. Una multiplicidad de infección de 15, 000 confirió un 36% de coloración de la placa y se seleccionó como la dosis viral óptima.

El análisis representativo muestra la correlación entre la coloración y la multiplicidad de infecciones. Se obtuvo la concentración más alta probada que no afectó la correlación lineal entre la coloración y la concentración viral. El estudio de la actividad neutralizante en un anticuerpo monoclonal anti-AAV6 contra el virus adenoasociado o AAV6 en la dilución log 10 mostró una inhibición del 50% de la transducción AAV6 o TI50 a una concentración de 10 nanogramos por mililitro.

En el ensayo de anticuerpos neutralizantes o NAb, el grado de neutralización de AAV varió dentro de la población de muestra ingenua con valores de título de TI50 que oscilaron entre 1/2 y 1/80. Los resultados del ensayo indicaron que los valores de título ti50 de inhibición de AAV antes de la administración de AAV variaron de 1/4 a 1/80. Después de la administración de AAV, el título de TI50 aumentó a entre 1/2000 y mayor de 1/32, 000, lo que demuestra un claro contraste en los valores de título entre la administración pre y post-AAV.

Al tomar fotos de los pozos, es importante utilizar constantemente la misma configuración del microscopio durante todo el ensayo y también asegurarse de que las fotos se tomen directamente en el centro de los pozos.