Cultivo y cribado del nematodo parásito de la planta Ditylenchus dipsaci

Este protocolo permite el descubrimiento de nuevos nematicidas para combatir Ditylenchus dipsaci mediante la técnica de cultivo y las pantallas químicas de rendimiento medio. La simplicidad de esta técnica permite el cribado de miles de compuestos por semana para identificar compuestos con potencial nematicida. Esta técnica puede identificar nuevos compuestos para matar los nematodos parásitos de las plantas de los cultivos y, por lo tanto, aumentar el suministro mundial de alimentos.

Para empezar, prepara 500 mililitros de agar nutriente, o medios NA, con 23 gramos por litro de NA y agua ultrapura. Usando la técnica estéril, vierta 25 mililitros de medios NA en autoclave en 20 placas de Petri desechables de 100 milímetros de diámetro y 15 milímetros de profundidad. Prepare 500 mililitros de Gamborg B5, o medio GA, que contenga 3.2 gramos por litro de medio basal GA con un mínimo de compuestos orgánicos, 20 gramos por litro de sacarosa, 15 gramos por litro de agar y agua destilada.

Usando la técnica estéril, vierta 50 mililitros de medios GA en autoclave en 10 placas de Petri desechables. Para realizar la esterilización de semillas, vierta 150 semillas de guisantes en un vaso de precipitados estéril de dos litros con una barra de agitación cerca de una llama de quemador Bunsen en un banco de laboratorio. Agregue 200 mililitros de etanol al 95% a las semillas y revuelva vigorosamente en la placa de agitación durante cinco minutos.

Luego, vierta el etanol en un contenedor de desechos. Vierta la solución de lejía en el vaso de precipitados para sumergir completamente las semillas. Revuelva vigorosamente en un plato de agitación durante 20 minutos.

Luego, vierta la lejía en un recipiente de desechos. Vierta agua destilada en el vaso de precipitados para sumergir las semillas y revuelva vigorosamente en un plato de agitación durante 20 minutos. Después del lavado final con agua, vierta las semillas esterilizadas en la placa de Petri de vidrio.

Para verificar si hay contaminación, transfiera seis semillas a cada placa de NA de 10 centímetros en la campana de flujo laminar con fórceps esterilizadas. Coloque las semillas alrededor de la circunferencia del plato. Envuelva las placas individualmente en una película de envoltura de laboratorio e incube en la oscuridad durante tres días a 26 grados centígrados.

En una campana de flujo laminar, coloque dos semillas no contaminadas en cada placa GA con pinzas esterilizadas. Incubar a temperatura ambiente durante 7 a 10 días para permitir que las semillas broten. Prepare 50 mililitros de solución de sacarosa de 20 gramos por litro.

El filtro esteriliza la solución de sacarosa y reserva. En una campana de flujo laminar, corte un trozo de agar que contenga tejido radicular de una placa de cultivo existente. Pipete 500 microlitros de solución de sacarosa en una nueva placa de GA con plántulas de guisante y coloque un cubo de agar encima de la sacarosa.

Mantenga el cultivo en una caja forrada con papel de aluminio a temperatura ambiente. Para mantener el cultivo, subcultivar los nematodos en placas frescas de GA cada ocho a nueve semanas. Los nematodos están listos para ser extraídos después de alrededor de ocho semanas.

En una campana de flujo laminar, corte el agar y el tejido radicular en cubos de un centímetro con un bisturí estéril. Transfiera los cubos de agar al embudo forrado de filtro de café y vierta lentamente agua destilada en el agar para humedecer el filtro de café. Retire el embudo forrado con filtro de café del vaso de precipitados y llene el vaso de precipitados con agua destilada hasta que el nivel de agua toque la parte inferior del filtro una vez que se reemplace el embudo forrado con filtro de café.

Cubra el embudo y el vaso de precipitados forrados con filtro de café con papel de aluminio. Para recolectar los gusanos, retire el embudo forrado con filtro de café y aspire los 40 mililitros superiores de agua del vaso de precipitados de recolección, sin interrumpir los gusanos asentados. Recoja el líquido restante en un tubo de centrífuga cónica de 15 mililitros con una pipeta serológica de plástico de 10 mililitros.

Para preparar las placas de ensayo, vierta agua destilada en autoclave en un canal estéril y dispense 40 microlitros de agua destilada del canal en cada pozo de una placa plana de 96 pocillos con una pipeta multicanal. Agregue los productos químicos de las placas de stock de productos químicos de 96 pocillos a las placas de ensayo fijando tres veces en la placa química. Luego, transfiera los pines 10 veces a la placa de ensayo.

Seque en el papel frente a la solución de limpieza. Para contar el número de nematodos de la colección, primero, vuelva a suspender la colección y luego pipetee cinco microlitros de la solución usando puntas de baja retención en una diapositiva. Cuente el número de nematodos en cinco microlitros usando un microscopio de disección.

Luego, ajuste la concentración a dos gusanos por microlitro usando agua destilada estéril. A continuación, agregue 10 microlitros de la muestra a cada pozo de las placas de 96 pocillos con una pipeta multicanal y un canal. Envuelva los platos con una toalla de papel húmeda y colóquelos en una caja.

Luego, agregue una toalla de papel húmeda adicional para estabilizar y garantizar un movimiento mínimo de las placas y colóquela en una almohadilla adhesiva en una incubadora de agitación de 20 grados Celsius a 200 RPM. Observe las placas en el quinto día bajo un microscopio de disección. Contar el número de D.dipsaci móviles y totales en controles de disolventes DMSO y pozos tratados con fármacos.

Si los gusanos están inmóviles, agregue dos microlitros de hidróxido de sodio de un molar a una concentración final de 40 milimolares al pozo para estimular el movimiento. Calcule la proporción de gusanos móviles. En las pantallas D.dipsaci, los pozos que produjeron de manera reproducible gusanos 0% móviles se clasifican como golpes fuertes.

Se examinaron tres placas de medicamentos diferentes a una concentración de 60 micromolares, donde cada placa de medicamentos tiene tres réplicas biológicas. Las tres placas incluían el 6% de los controles dmSO-solvente-solo. Muchas placas que contenían fármacos de la biblioteca de moléculas pequeñas carecían de cualquier molécula con bioactividad observable contra D.dipsaci.

Algunas placas tenían golpes totalmente reproducibles, mientras que otras contenían nematicidas caracterizados variaban en su actividad. Las barras de error representan el error estándar de la media. Aquí, fluopyram exhibió una actividad robusta en el ensayo.

Fluopyram indujo un efecto aparente dependiente de la dosis sobre la movilidad de D.dipsaci con un EC50 de 9,3-micromolar. Oxamyl no tuvo un efecto significativo sobre la movilidad hasta una concentración de 120 micromolares. Oxamyl no tuvo un efecto significativo sobre la movilidad hasta una concentración de 120 micromolares.

La adición de hidróxido de sodio mejoró la sensibilidad del ensayo en la detección de gusanos inmóviles. Se utilizó 40 milimolar de hidróxido de sodio como punto final del ensayo para estimular el movimiento en individuos capaces y, por lo tanto, distinguir los gusanos en reposo de los gusanos enfermos. Este protocolo ha permitido la identificación de compuestos con nuevos mecanismos de acción contra D.dipsaci y otras especies.