Name: Bioprospección de microorganismos extremófilos para hacer frente a la contaminación ambiental (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-30T16:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 20 s
Description: Aprende a aislar microorganismos resistentes a metales pesados de fuentes geotérmicas para aplicaciones en bioremediación y biosensores. Este protocolo facilita la identificación de nuevas especies con potencial para descontaminar el medio ambiente.

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Este trabajo fue apoyado por ERA-NET Cofund MarTERA: "FLAshMoB: Functional Amyloid Chimera for Marine Biosensing", PRIN 2017-PANACEA CUP:E69E19000530001 y por GoodbyWaste: ObtainGOOD products-exploit BY-products-reduce WASTE, MIUR 2017-JTNK78.006, Italia. Monica Piochi y la Dra. Angela Mormone (Istituto Nazionale di Geofisica e Vulcanologia, Sezione di Napoli Osservatorio Vesuviano, Italia) por la identificación y caracterización del sitio geotérmico.

1. Muestreo de microorganismos de sitios geotérmicos
<ol><li>Elija el sitio para el muestreo utilizando como criterio lugares con la temperatura y el pH deseados. Mida los parámetros físicos a través de una sonda de termopar digital, insertándola en las piscinas o lodos seleccionados.</li>
	<li>Recolecte 20 g de muestras de suelos (en este caso, de lodo en el sitio hidrotermal de Pisciarelli Solfatara), recogiéndolos con una cuchara esterilizada. Tome al menos dos muestras para cada sitio elegido.</li>
	<li>Coloque las muestras en tubos de polipropileno estéril de 50 ml y cierre inmediatamente.</li>
	<li>Mida el pH y la temperatura con una sonda de termopar digital insertándola directamente en el sitio de muestreo. Después de su uso, enjuague la sonda cuidadosamente con agua desionizada.</li>
</ol>2. Aislamiento de microorganismos resistentes a metales pesados
NOTA: Realice los pasos 2.1-2.7 bajo una capucha biológica estéril.
<ol><li>Inocular 2 g de cada muestra recogida en 50 ml de medio Luria-Bertani (LB) recién preparado, en el que el pH se ha ajustado a 4 o 7 mediante la adición de HCl o NaOH.</li>
	<li>Incubar las muestras a la misma temperatura del sitio de muestreo y a ±5 °C (55 °C y 60 °C para muestras de Pisciarelli) en un agitador orbital con temperatura controlada durante 24 h con una velocidad de agitación de 180 rpm.</li>
	<li>Placa 200 μL de las muestras cultivadas en agar LB (pH 4 o pH 7) e incubar en condiciones estáticas durante 48 h a 55 °C o 60 °C.</li>
	<li>Aísle las colonias individuales y repita los ciclos de recubrimiento de rayas (pasos 2.3 y 2.4) al menos tres veces.</li>
	<li>Para preparar reservas de células congeladas a -80 °C, cultive los cultivos durante la noche (ON) y agregue a las células cultivadas un 20% de glicerol (en un volumen final de 1 ml); use una mezcla de acetona y hielo seco para una congelación rápida.</li>
	<li>Para preparar un inóculo a partir de una cepa de glicerol, inocular 50 μL en 50 ml de LB (pH 4 o pH 6) e incubar a 55 °C o 60 °C en el agitador orbital a 180 rpm ON.</li>
	<li>Para obtener un perfil de crecimiento, diluya un precultivo (obtenido desde el paso 2.6) a 0.1 OD600 nm en 10 mL de LB (pH 4 o pH 6), haga crecer las células a 55 °C o 60 °C durante 16 h en el agitador orbital y mida el OD600 nm a intervalos de 30 min.</li>
	<li>Construya una curva de crecimiento a partir de los datos obtenidos en el paso 2.7 con tiempo (min) en el eje X y OD600 nm en el eje Y.</li>
	<li>Realice la misma curva de crecimiento descrita en los pasos 2.7 y 2.8, pero variando el pH (± 1 unidad) del medio de cultivo (por ejemplo, pH 3 y 5 para muestras cultivadas a pH 4) para determinar el pH óptimo para condiciones de laboratorio.</li>
</ol>3. Identificación de aislados microbianos
<ol><li>Preparación de ADN genómico<ol>
<li>Inocular el aislado rayado de la cepa de glicerol en 50 mL de lb medio (pH 4 o pH 6) y crecer en un agitador orbital a 55 °C o 60 °C a 180 rpm ON.</li>
		<li>Cosechar el cultivo ON por centrifugación durante 10 min a 5000 x g. Deseche el sobrenadante.</li>
		<li>Preparar 10 mL de tampón de lisis bacteriana compuesto por: 20 mM Tris-HCl pH 8.0, 2 mM EDTA, 1.2% Triton X-100 y lisozima (20 mg/mL) inmediatamente antes de su uso.</li>
		<li>Resuspend el pellet en 180 μL de tampón de lisis de bacterias. Incubar durante 30 min a 37 °C.</li>
		<li>Siga las pautas indicadas por un kit de purificación de ADN genómico (Tabla de materiales) para extraer ADN genómico.</li>
		<li>Cuantificar el ADN genómico extraído y su pureza mediante medición UV-Vis. Para la pureza, determine las proporciones: OD 260/280 nm y OD 260/230 nm.</li>
		<li>Evaluar la integridad del ADN genómico cargando 200 ng de cada muestra en un gel de agarosa al 0,8% y comparando la distribución del tamaño con un marcador molecular de alto peso.</li>
		<li>Encarga a un servicio externo la preparación del fragmento de ARNr 16S, secuenciación y análisis comparativo de la secuencia obtenida (1000 pb) con las presentes en la base de datos de nucleótidos del Centro Nacional de Información Biotecnológica de Estados Unidos (NCBI)33.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para corroborar los datos de la secuenciación del ARNr 16S, también se realiza un ribotipado automatizado sobre el ADN cromosómico digerido (servicio externo, Tabla de Materiales).</li>
	<li>En el caso de que la identificación de la especie no pueda determinarse únicamente con datos de ribotipado, encargar un análisis MALDI-TOF MS para la identificación de ácidos grasos.</li>
	<li>Para realizar un análisis filogenético del género identificado, analizar la secuencia de ARNr 16S del aislado con BLASTn34. Las secuencias con identidades del 99% al 97% deben usarse para construir una alineación de secuencia múltiple utilizando CLUSTAL Omega35. Construya un árbol de unión al vecino utilizando la opción predeterminada de ClustalW2 (Filogenia simple).</li>
</ol>4. Susceptibilidad a los metales pesados y los antibióticos
<ol><li>Inocular el aislado de un stock de glicerol (ver paso 2.5) y cultivarlo en 200 mL de LB bajo las condiciones óptimas de pH y temperatura previamente determinadas.</li>
	<li>Diluir cada precultivo a 0,1 OD600 nm en 5 ml de lb medio (al pH apropiado) que contenga concentraciones crecientes de metales pesados. Las concentraciones varían de 0.01-120 mM para metales pesados [As(V), As(III), Cd(II), Co(III), Cr(VI), Cu(II), Hg(II), Ni(II), V(V)] o 0.5-1 mg/mL para los antibióticos [Ampicilina, Bacitracina, Cloranfenicol, Ciprofloxacina, Eritromicina, Kanamicina, Estreptomicina, Tetraciclina y Vancomicina].</li>
	<li>Realice tratamientos con metales pesados y antibióticos por separado. Utilice un tubo de polipropileno de 50 ml y haga crecer las células en un agitador orbital con temperatura controlada con una velocidad de agitación de 180 rpm a 55 °C o 60 °C durante 16 h para cada condición/tratamiento.</li>
	<li>Calcular la Concentración Inhibitoria Mínima (CMI) ya sea para antibióticos o metales pesados identificando los valores de concentración en los tubos donde no se produce crecimiento microbiano, es decir, determinando los valores que inhiben completamente el crecimiento celular después de 16 h.</li>
	<li>Comprobar que la concentración es inhibitoria y no letal para las células mediante el recubrimiento de 200 μL del cultivo cultivado al valor que se considera como MIC en placas lb-agar (al pH y temperatura adecuados) y verificando la presencia de colonias después de la incubación ON. NOTA: Dado que el cultivo en placa de agar LB es viable a 4 °C solo durante unas pocas semanas, para preservar los aislados durante más tiempo, se prepararon y almacenaron existencias de glicerol a -80 °C. Para la determinación de la CMI, se llevaron a cabo al menos tres réplicas independientes utilizando cultivos independientes. La desviación estándar se calculó entre experimentos triplicados.</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen conflictos de intereses.

Las aguas termales contienen una diversidad sin explotar de microbiomas con capacidades metabólicas igualmente diversas12. El desarrollo de estrategias para el aislamiento de microorganismos que puedan convertir eficientemente metales pesados en compuestos menos tóxicos10 representa un área de investigación de creciente interés a nivel mundial. Este documento tiene como objetivo describir un enfoque simplificado para la detección y el aislamiento de microbios con la capacid...

Los ambientes extremos de nuestro planeta son excelentes fuentes de microorganismos capaces de tolerar condiciones duras (es decir, temperatura, pH, salinidad, presión y metales pesados)1,2, siendo Islandia, Italia, ESTADOS UNIDOS, Nueva Zelanda, Japón, África Central e India, las áreas volcánicas más reconocidas y estudiadas 3,4,5,6,7,8,9 . Los termófilos han evolucionado en ambientes hostiles en un rango de temperaturas de 45 °C a 80 °C 10,11,12. Los microorganismos termófilos, ya sean pertenecientes a los reinos arqueal o bacteriano, son un reservorio para el estudio de la biodiversidad, la filogénesis y la producción de biomoléculas exclusivas para aplicaciones industriales 13,14,15,16. De hecho, en las últimas décadas, la continua demanda industrial en el mercado global ha fomentado la explotación de extremófilos y termozimas para sus aplicaciones diversificadas en varios campos biotecnológicos 17,18,19.
Las aguas termales, donde los organismos viven en consorcios, son ricas fuentes de biodiversidad, representando así un hábitat atractivo para estudiar la ecología microbiana20,21. Además, estas áreas volcánicas ricas en metales son comúnmente colonizadas por microorganismos que han desarrollado sistemas de tolerancia para sobrevivir y adaptarse a la presencia de metales pesados22,23 y, por lo tanto, participan activamente en sus ciclos biogeoquímicos. Hoy en día, los metales pesados se consideran contaminantes prioritarios para los seres humanos y el medio ambiente. Los microorganismos resistentes a metales pesados son capaces de solubilizar y precipitar metales transformándolos y remodelando sus ecosistemas24,25. La comprensión de los mecanismos moleculares de la resistencia a metales pesados es un tema candente para la urgencia de desarrollar nuevos enfoques verdes 26,27,28. En este contexto, el descubrimiento de nuevas bacterias tolerantes representa el punto de partida para desarrollar nuevas estrategias de biorremediación ambiental24,29. Para acompañar los esfuerzos para explorar ambientes hidrotermales a través de procedimientos microbiológicos y aumentar el conocimiento sobre el papel del gen (s) que sustenta la tolerancia a los metales pesados, se realizó un cribado microbiano en el área de aguas termales de Campi Flegrei en Italia. Este ambiente rico en metales pesados muestra una poderosa actividad hidrotermal, fumarola y piscinas hirviendo, variables en pH y temperatura en dependencia de la estacionalidad, las precipitaciones y los movimientos geológicos subterráneos30. En esta perspectiva, describimos una forma fácil de aplicar y eficaz de aislar bacterias resistentes a metales pesados, por ejemplo, Geobacillus stearothermophilus GF1631 (nombrado como aislado 1) y Alicyclobacillus mali FL1832 (nombrado como aislado 2) del área de Pisciarelli de Campi Flegrei.

<table><tbody><tr><td>Ampicilina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9393</td><td></td></tr><tr><td>Aura Mini bio</td><td>air s.c.r.l.</td><td></td><td>Campana biológica</td></tr><tr><td>Bacitracina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B0125</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de cadmio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>202908</td><td></td></tr><tr><td>Cloranfenicol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C0378</td><td></td></tr><tr><td>Ciprofloxacina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>17850</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de cobalto</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C8661</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de</td> <td>cobreSigma Aldrich</td><td>224332</td><td></td></tr><tr><td>Eritromicina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E5389</td><td></td></tr><tr><td>Servicio Externo</td><td>DSMZ</td><td></td><td>Instituto Leibniz DSMZ-Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares GmbH Kit de</td></tr><tr><td>purificación de ADN genómico</td><td>Thermo Scientific</td><td>#K0721</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de kanamicina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>60615</td><td></td></tr><tr><td>MaxQTM 4000 Agitador orbital de sobremesa</td><td>Thermo Scientific</td><td>SHKE4000</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de mercurio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>215465</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 1000 Espectrofotómetro</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de níquel</td><td>Sigma Aldrich</td><td>654507</td><td></td></tr><tr><td>Orion Star A221 Medidor de pH portátil</td><td>Thermo Scientific</td><td>STARA2218</td><td></td></tr><tr><td>Sodio (meta) arsenito</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7400</td><td></td></tr><tr><td>Arseniato de sodio dibásico heptahidratado</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A6756</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>Estreptomicina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S6501</td><td></td></tr><tr><td>Tetraciclina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>87128</td><td></td></tr><tr><td>Triptona BioChemica</td><td>Applichem Panreac</td><td>A1553</td><td></td></tr><tr><td>Vancomicina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>PHR1732</td><td></td></tr><tr><td>Extracto de levadura para biología molecular</td><td>Applichem Panreac</td><td>&nbsp; A3732</td><td></td></tr></tbody></table>

bioprospección de microorganismos extremófilos para hacer frente a la contaminación ambiental

Bioprospecting of Extremophilic Microorganisms to Address Environmental Pollution

Los manantiales geotérmicos son ricos en varios iones metálicos debido a la interacción entre la roca y el agua que tiene lugar en el acuífero profundo. Además, debido a la variación estacional en el pH y la temperatura, la fluctuación en la composición de los elementos se observa periódicamente dentro de estos ambientes extremos, influyendo en las comunidades microbianas ambientales. Los microorganismos extremófilos que prosperan en los respiraderos térmicos volcánicos han desarrollado mecanismos de resistencia para manejar varios iones metálicos presentes en el medio ambiente, participando así en complejos ciclos biogeoquímicos metálicos. Además, los extremófilos y sus productos han encontrado un amplio punto de apoyo en el mercado, y esto es cierto especialmente para sus enzimas. En este contexto, su caracterización es funcional al desarrollo de biosistemas y bioprocesos para el monitoreo ambiental y la biorremediación. Hasta la fecha, el aislamiento y el cultivo en condiciones de laboratorio de microorganismos extremófilos siguen representando un cuello de botella para explotar plenamente su potencial biotecnológico. Este trabajo describe un protocolo simplificado para el aislamiento de microorganismos termófilos de aguas termales, así como su identificación genotípica y fenotípica a través de los siguientes pasos: (1) Muestreo de microorganismos de sitios geotérmicos ("Pisciarelli", un área volcánica de Campi Flegrei en Nápoles, Italia); (2) Aislamiento de microorganismos resistentes a metales pesados; (3) Identificación de aislados microbianos; (4) Caracterización fenotípica de los aislados. Las metodologías descritas en este trabajo podrían aplicarse generalmente también para el aislamiento de microorganismos de otros ambientes extremos.

Sitio de muestreo Este protocolo ilustra un método para el aislamiento de bacterias resistentes a metales pesados de una fuente termal. En este estudio, el área de Pisciarelli, un ambiente geotérmico ácido-sulfídico, se utilizó como sitio de muestreo (Figura 1). Este ecosistema se caracteriza por el flujo de fluidos sulfurosos agresivos derivados de actividades volcánicas. Se ha demostrado que las comunidades microbianas en los sistemas geotérmicos ácido-...

El aislamiento de microbios resistentes a metales pesados de las fuentes geotérmicas es un tema candente para el desarrollo de biosistemas de biorremediación y monitoreo ambiental. Este estudio proporciona un enfoque metodológico para aislar e identificar bacterias tolerantes a metales pesados de aguas termales.

Bioprospección de microorganismos extremófilos para hacer frente a la contaminación ambiental

Geothermal springs are rich in various metal ions due to the interaction between rock and water that takes place in the deep aquifer. Moreover, due to ...

El protocolo describe un enfoque simplificado para la detección y el aislamiento de microbios resistentes a metales pesados de manantiales geotérmicos. Este enfoque representa un área de investigación de creciente interés en todo el mundo para su aplicación en el campo de la biodetección y la biorremediación. El método descrito en el mismo se puede modificar fácilmente para aislar microbios de diversas fuentes ambientales como agua, alimentos, suelo o sedimentos.La concentración inhibitoria mínima para identificar microbios resistentes es una estrategia rápida para caracterizar las nuevas especies o cepas. Este protocolo es fácil de realizar y solo requiere habilidad manual y experiencia con las técnicas básicas de microbiología. Para comenzar, inocule dos gramos de muestra recolectada en 50 microlitos de medio Luria-Bertani recién preparado con un pH de cuatro o siete.Incubar esta muestra a la temperatura del sitio de muestreo más o menos cinco grados centígrados. Placa 200 microlitros de la muestra sobre agar Luria-Bertani con un pH de cuatro o siete y manténgalo en una condición estática a 55 o 60 grados centígrados durante 48 horas. Después de la incubación, aísle las colonias individuales y repita este ciclo de recubrimiento de rayas al menos tres veces.Para preparar un mililitro de material de células congeladas, agregue 20% de glicerol a las células cultivadas durante la noche. Use una mezcla de acetona y hielo seco para una congelación rápida. Para preparar un inóculo a partir de una cepa de glicerol, inocule 50 microlitros en 50 mililitros de Luria-Bertani.Para obtener un perfil de crecimiento, diluir este pre cultivo en 10 microlitros de Luria-Bertani. Para ajustar la densidad óptica a 0.1 agregue 600 nanómetros. Cultive estas células durante 16 horas a 55 o 60 grados Celsius en el agitador orbital.Mida la densidad óptica a 600 nanómetros a intervalos de 30 minutos. Curva a partir de estos datos con tiempo en el eje X y densidad óptica a 600 nanómetros en el eje Y. Trazar curvas de crecimiento similares con pH variable del medio de cultivo, para determinar el pH óptimo para condiciones de laboratorio, inocular el aislado rayado de la cepa de glicerol en 50 microlitros de medio Luria-Bertani e incubar durante la noche.Centrifugar este cultivo cultivado durante la noche durante 10 minutos a 5, 000 veces G, luego desechar el sobrenadante y cosechar la paleta de cultivo. Preparar 10 mililitros de tampón de lisis de bacterias compuesto por 20 milimolares Tris-HCL, dos milimolares EDTA, 1.2% Triton X-100 y 20 miligramos por mililitro lisosoma inmediatamente antes de su uso. Vuelva a suspender el pellet en 180 microlitros de tampón de etólisis.Extracción de ADN genómico según las instrucciones en el kit de purificación y medición de ADN genómico y su pureza por UV-Vis. Para evaluar la pureza, determine las relaciones de densidad óptica de 260 a 280 y de 260 a 230. Evaluar la integridad del ADN genómico cargando 200 nanogramos de cada muestra en un gel de agarosa al 0,8% y comparando la distribución del tamaño con un marcador molecular de altura y peso.Cultive el aislado a partir de cepas de glicerol en 200 mililitros de Luria-Bertani condiciones óptimas de pH y temperatura. Diluir cada pre cultivo en cinco mililitros de medio Luria-Bertani en 50 mililitros de tubos de polipropileno que contengan concentraciones crecientes de metales pesados y antibióticos para obtener una densidad óptica de 0,1 a 600 nanómetros. Cultive las células durante 16 horas en un agitador orbital con 180 revoluciones por minuto a 55 o 60 grados centígrados.Calcule la concentración inhibitoria mínima para antibióticos o metales pesados identificando los valores de concentración en los tubos donde no se produce crecimiento microbiano. Comprobar que la concentración es inhibitoria y no letal para las células mediante el emplatado de 200 microlitros del cultivo cultivado a concentraciones inhibitorias mínimas sobre placas de agar Luria-Bertani y verificando la presencia de colonias tras la incubación nocturna. Este protocolo se utilizó para analizar muestras bacterianas del área de Piscarelli, un ambiente geotérmico sulfúrico ácido La caracterización fenotípica de los microorganismos aislados mostró que el aislado uno tiene una mayor tolerancia al arseniato y al vanadato y es resistente al cadmio.Los datos comparativos sugieren que aislar uno tiene una fuerte resistencia al arsénico pentavalente, mientras que aislar dos tiene resistencia al arsénico trivalente. Las pruebas de resistencia a los antibióticos mostraron que aislar uno es altamente sensible a todos los antibióticos probados, incluso cuando se usaron concentraciones bajas. Por el contrario, el aislado dos es resistente a todos los antibióticos probados, excepto al cloranfenicol y la tetraciclina.El microorganismo probablemente ha adquirido resistencia a los antibióticos debido a mutaciones aleatorias o transferencia horizontal de genes que representan una ventaja selectiva en condiciones ambientales extremas. Este estudio demuestra la utilidad de tales métodos para seleccionar microorganismos ambientales que puedan inactivar los contaminantes y convertirlos en productos inofensivos.

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Establecimiento de cultivos de enriquecimiento microbianos eucariotas a partir de un estratificado químicamente lago de la Antártida y evaluación del potencial de carbono de fijación

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Cribado de bacterias marinas para el aislamiento de cepas degradantes de contaminantes

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