Name: Optrode Array para modulación optogenética simultánea y grabación neuronal eléctrica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 36 s
Description: Aprende a fabricar un sistema optrode LED para estimulación optogenética y grabación electrofisiológica simultánea en ratones transgénicos con channelrhodopsin-2. Este método permite investigar respuestas neuronales evocadas con bajo consumo energético.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Esta investigación fue apoyada por el Programa de I + D de Tecnología Convergente para el Aumento Humano a través de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF), financiado por el Ministerio de Ciencia y TIC (NRF-2019M3C1B8090805), y apoyado por una subvención de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF) financiada por el gobierno de Corea (MSIT) (no. 2019R1A2C1088909). Agradecemos al laboratorio de Seung-Hee Lee en el Departamento de Ciencias Biológicas, KAIST, Daejeon, Corea, por proporcionar amablemente a los ratones transgénicos.

El cuidado de los animales y los procedimientos quirúrgicos fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) en la Universidad de Mujeres Ewha (no. 20-029).
1. Preparación de una matriz optrode (Figura 1 y Figura 2)
<ol><li>Conecte fibras ópticas con la matriz de microlentes.<ol>
<li>Retire el recubrimiento de pasivación de la fibra óptica y córtelo en trozos de 5 mm de largo con una cuchilla de fibra óptica de precisión.</li>
		<li>Sumerja la fibra óptica en la resina UV transparente y coloque las fibras ópticas en la matriz de microlentes.</li>
		<li>Curar la resina con una lámpara UV.</li>
		<li>Conecte la matriz de microlentes a la carcasa impresa en 3D mediante epoxi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Alinee los cables de tungsteno recubiertos de perfluoroalcoxi (PFA).<ol>
<li>Suelde las 4 piezas de cables de tungsteno PFA de 30 mm de largo y 1 cable plateado al conector hembra de paso de 5 pines y 1,27 mm. Utilice alambre de plata como electrodo de referencia.</li>
		<li>Conecte el conector hembra de paso de 1,27 mm al preamplificador del cabezal.</li>
		<li>Coloque cuidadosamente los cables de tungsteno a través del silicio a través de los orificios (Figura 1B) para ayudar a la alineación fina de los electrodos de tungsteno.</li>
		<li>Corte los cables de tungsteno alineados 1 mm más cortos que la longitud de la fibra óptica.</li>
		<li>Conecte el conector a la carcasa impresa en 3D mediante epoxi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Colocación del LED<ol>
<li>Coloque el LED en la carcasa impresa en 3D.</li>
		<li>Conecte el LED al circuito de conducción que genera la modulación de ancho de pulso (PWM). NOTA: El pulso PWM es generado por el microcontrolador.</li>
		<li>Dado el ruido inducido por el circuito de conducción LED, asegúrese de que los electrodos de grabación estén a 50 mm de distancia del circuito de conducción LED.</li>
		<li>Mida la intensidad de la luz en el extremo de la punta de la fibra óptica utilizando un fotodiodo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sumergir los electrodos de tungsteno y las fibras ópticas en alcohol durante 15 min. Luego sumerja el sistema en agua D.I estéril y esterilize con gas óxido de etileno.</li>
</ol>2. Cirugía de implantación (Figura 3 y Figura 4)
NOTA: Se debe seguir la técnica estéril durante la cirugía.
<ol><li>Prepare a los animales transgénicos, que están modificados genéticamente para expresar proteínas opsina sensibles a la luz en el tipo específico de células neuronales. NOTA: En este estudio se utilizó un ratón transgénico macho de 2 meses de edad que expresa canalrodopsina-2 (ChR2) en neuronas positivas para la proteína quinasa II dependiente de Ca2+/calmodulina (ratón CaMKIIα::ChR2)41.</li>
	<li>Anestesiar al ratón con un cóctel de ketamina-xilazina,una mezcla de ketamina (100 mg/kg) y xilazina (10 mg/kg)- mediante administración intraperitoneal.<ol>
<li>Revise al animal anestesiado cada 30 minutos monitoreando el movimiento del bigote y la reacción al pellizco de la pata.</li>
		<li>Inyecte el cóctel de ketamina-xilazina a la mitad de la dosis inicial si se necesita anestesia adicional.</li>
	</ol></li>
	<li>Afeitar la piel de la cabeza y colocar el ratón anestesiado en el marco estereotáctico. NOTA: Realice la preparación quirúrgica de la piel y cubra el animal. La preparación de la piel implica la depilación seguida de la limpieza de la piel con agentes antimicrobianos.<ol>
<li>Coloque la cabeza dentro del marco estereotáctico e inserte barras para los oídos en el meato.</li>
		<li>Centra la cabeza del ratón en el marco estereotáctico aflojando y apretando repetidamente las barras de los oídos para un posicionamiento exacto.</li>
		<li>Coloque la barra incisiva de modo que los incisivos superiores se enganchen sobre el borde interior delantero.</li>
		<li>Ajuste la barra incisiva para ajustar la altura de la barra incisiva y apriete la abrazadera nasal contra el hocico.</li>
		<li>Encienda la almohadilla térmica incrustada en el marco estereotáctico con anticipación para mantener la temperatura corporal a 37 ° C durante los procedimientos quirúrgicos.</li>
		<li>Coloque la sonda térmica en el recto del ratón para la regulación homeotérmica. NOTA: La colocación de la barra de la oreja debe verificarse agarrando y balanceando suavemente el hocico. La barra de la oreja debe reajustarse si el hocico se puede mover más de ~ 4 mm lateralmente.</li>
	</ol></li>
	<li>Cubra los ojos con vaselina (ver la Tabla de Materiales) para evitar la sequedad.</li>
	<li>Inyecte lidocaína al 1% en el cuero cabelludo. Levante la piel de la cabeza con fórceps, asegure un espacio de inyección e inyecte la lidocaína debajo del cuero cabelludo.</li>
	<li>Realice una incisión sagital con un bisturí y tijeras finas. Sostenga la piel incisa con una microclamp para ampliar la visibilidad del área quirúrgica. NOTA: La longitud de la incisión es de &lt;1 cm por encima del bregma y el borde caudal del hueso interparietal.</li>
	<li>Retire el periostio con hisopos de algodón. Si hay sangrado, cauterice el cráneo usando un bovie para sellar los vasos sanguíneos.</li>
	<li>Limpie el cráneo con solución salina y marque los sitios de craneotomía con un brazo manipulador: hipocampo anterior-posterior (AP) −1.8 a −2.8 mm, Medial-Lateral (ML) 0.5-2.5 mm y Dorsal-Ventral (DV) −1 a −2 mm. NOTA: Teniendo en cuenta el grosor del cráneo del ratón, inserte la matriz optrode de -1.2 a -2.2 mm desde el área del cerebro expuesta. Dada la vía del hipocampo, las células piramidales de CA3 envían sus axones a CA1. Por lo tanto, las fibras ópticas son 1 mm más largas que los electrodos de grabación, de modo que las fibras ópticas se colocan en CA3 y los electrodos de grabación en CA1.</li>
	<li>Perfore un orificio por encima del cerebelo e inserte un tornillo para el suelo. Coloque el tornillo de tierra a 0,5 mm de profundidad con un tornillo de precisión hasta que llegue a la parte superior del cerebelo. NOTA: Asegúrese de una inserción hermética del tornillo, que se utilizará como electrodo de tierra y estructura de soporte para maximizar la estabilidad a largo plazo de la implantación, ya que aumenta la superficie tridimensional para la adherencia del cemento dental.</li>
	<li>Perfore el área marcada y retire un pedazo del cráneo con fórceps.</li>
	<li>Doble la punta de una aguja de 26 G en el sentido de las agujas del reloj 120° y exponga el área del cerebro insertando el lado biselado de la aguja hacia arriba. Tenga cuidado de no dañar el cerebro y los vasos sanguíneos.</li>
	<li>Limpie el cerebro expuesto con solución salina para eliminar el polvo óseo y la materia extraña.</li>
	<li>Fije la matriz optrode en el brazo manipulador y muévase cerca del área expuesta. NOTA: Al colocar el dispositivo, volver a calcular el área objetivo desde el bregma puede aumentar la precisión de la colocación.</li>
	<li>Inserte lentamente la matriz optrode y conecte el tornillo de tierra al cable plateado conectado al sistema42. NOTA: En este proceso, la matriz debe fijarse firmemente al brazo manipulador para minimizar el bamboleo y evitar el daño cerebral por micromovimiento durante la inserción. La inserción debe realizarse lentamente, con reposo durante 10 minutos para tener en cuenta la hinchazón del cerebro que puede haber sido presionada después de la inserción. Se recomienda una velocidad de inserción inferior a 1 μm/s en el tejido cerebral por la alta calidad de la relación señal-ruido y el número de unidades individuales separables42.</li>
	<li>Si hay sangrado, aplique presión directa a los sangrados con un hisopo de algodón seco o use cauterización. No pase a los siguientes pasos hasta que el sangrado se detenga por completo.</li>
	<li>Inserte espuma de gel entre el cerebro expuesto y el dispositivo para proteger los productos químicos del contacto directo con el cerebro. NOTA: La espuma de gel también ayuda a la hemostasia y mantiene el cerebro húmedo.</li>
	<li>Limpie el cráneo con hisopos de algodón para eliminar la humedad tanto como sea posible y continúe con el siguiente paso de fijación.</li>
	<li>Aplique cuidadosamente cemento dental en el cráneo para fijar el dispositivo y cubrir la espuma de gel. Antes de que el cemento dental se endurezca por completo, separe el cuero cabelludo si está unido al cemento dental. Tire de la piel incisa con fórceps para cubrir el cemento dental endurecido y suture el cuero cabelludo. Luego, suelte el dispositivo del brazo manipulador. NOTA: Asegúrese de que el cemento dental no se adhiera a la piel y solo cubra la región del cráneo. Cuando la piel crece, puede empujar el cemento y, eventualmente, el dispositivo se caerá. Esto causará un problema crítico para los experimentos in vivo a largo plazo.</li>
</ol>3. Recuperación y cuidado de implantes
<ol><li>Saque el ratón del marco estereotáctico.</li>
	<li>Administrar la solución de carprofeno con una aguja de 26 G. Inyecte una vez antes de la cirugía y 12 h (a la mañana siguiente en caso de cirugía por la tarde) y 24 h después de la cirugía para reducir el dolor. NOTA: La concentración del fármaco en el frasco es de 50 mg/ml, y se almacena a 4 °C. El carprofeno es viscoso y debe diluirse en agua estéril 1:10. Si se mantiene la esterilidad, la solución se puede almacenar hasta por 4 semanas. Para mantener la duración efectiva del medicamento, inyecte la solución de Carprofen a intervalos de 12 h.</li>
	<li>Coloque el ratón sobre la almohadilla térmica y compruebe si se recupera bien de la anestesia. NOTA: El animal no se deja desatendido hasta que recupere la conciencia suficiente.</li>
	<li>Retire los hilos de sutura de 7 a 10 días después de la cirugía.</li>
	<li>Permita que el animal se recupere durante 1 semana. Controle la ingesta de alimentos y agua durante el tiempo de recuperación. Administre el analgésico y verifique si hay signos de malestar o dolor. NOTA: Los animales que se han sometido a cirugía no pueden permanecer con los otros animales hasta que se recuperen por completo.<ol>
<li>Durante el período de recuperación, pese el ratón todos los días para verificar si hay cambios de peso. Sacrificar el ratón (ver sección 6) si hay una pérdida de peso del 20% en comparación con la edad y el sexo de los animales de control emparejados.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Estimulación optogenética y registro electrofisiológico
<ol><li>Anestesia el ratón y coloca el ratón anestesiado en el marco estereotáctico.</li>
	<li>Configure los parámetros de estimulación.<ol>
<li>Ajuste la receta de pulso de luz al 4% del ciclo de trabajo y a la frecuencia de 10 Hz43. Configure la estimulación de luz durante 2 s (20 pulsos) durante la grabación neuronal.</li>
		<li>Utilice una corriente de 50 mA para impulsar una intensidad de luz de 3 mW/mm2 en la punta de la fibra óptica. Mida la potencia de la luz utilizando un fotodiodo y un medidor de potencia y divida la potencia de la luz por el área de la faceta de fibra óptica.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Retire la cubierta de plástico y conecte la parte superior que contiene el sistema de suministro de luz con el LED y los circuitos reutilizables.</li>
	<li>Conecte el preamplificador del cabezal al conector implantado de 5 pines.</li>
	<li>Abra el software para grabar señales neuronales.</li>
	<li>Configure los filtros de software. Utilice un filtro de paso de banda a 0,1-20 kHz y un filtro de muesca a 60 Hz. Ajuste la frecuencia de muestreo del amplificador a 20 kHz.</li>
	<li>Antes de la grabación, verifique si se detectan las señales de pico neuronal. NOTA: La cancelación de ruido es importante porque las señales neuronales son demasiado pequeñas. Si el nivel de ruido es demasiado alto, las señales neuronales pueden ser oscurecidas por el ruido y volverse invisibles. Utilice la conexión a tierra adecuada y el blindaje de ondas electromagnéticas para reducir el ruido.</li>
	<li>Después de la verificación de la señal, grabe las señales neuronales sin estimulación de la luz para el registro de referencia.</li>
	<li>Entregue luz LED y registre simultáneamente las respuestas neuronales (Figura 5 y Figura 6). NOTA: Una vez estimulado, el siguiente experimento de estimulación debe realizarse después de un intervalo de al menos 5 min para que la actividad neuronal evocada por la estimulación anterior no afecte al siguiente experimento.</li>
</ol>5. Análisis de datos
<ol><li>Cargue los datos adquiridos mediante el programa MATLAB.</li>
	<li>Obtener actividades neuronales individuales utilizando un algoritmo de clasificación de picos "Wave-Clus"44,45. Detecte los picos en cada canal por un umbral de amplitud como en Eq (1)45. Umbral = mediana de <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63460/63460eq01.jpg"> 5 × (1) Donde x es la señal filtrada por paso de banda.<ol>
<li>Para instalar "Wave-Clus", consulte el enlace de descarga en la Tabla de materiales.</li>
		<li>Para abrir la interfaz gráfica de usuario (GUI), escriba wave_clus en el símbolo del sistema de MATLAB.</li>
		<li>Escriba Get_spikes('filename.ext') para la extensión de archivo preparada para la detección de picos. Luego, ejecute Do_clustering ('filename_spikes.mat') para la clasificación de picos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cuente los picos clasificados antes, durante y después de la estimulación de la luz con contenedores de tiempo específicos. Utilice contenedores de tiempo de 0,2 s y 2 s para el análisis.</li>
	<li>Traza el número de picos de cada canal de grabación. NOTA: Se calculó y graficó la media con error estándar de las medias (SEM) de los datos de los resultados de 8 experimentos repetidos.</li>
</ol>6. Eutanasia
<ol><li>Después de todos los experimentos, sacrifique al ratón por inhalación de dióxido de carbono (CO2).</li>
	<li>Sin precargar la cámara, coloque el ratón en la cámara de eutanasia transparente, sin suministro de CO2 y/o fugas.</li>
	<li>Encienda el gas CO2 y desplace el aire a una velocidad del 30 al 50% del volumen de aire de la cámara de eutanasia por minuto. NOTA: Se debe conectar un caudalímetro al cilindro de gas CO2 para garantizar que la tasa de desplazamiento del aire sea del 30-50% del volumen de la cámara de eutanasia por minuto.</li>
	<li>Monitoree al ratón sacrificado por falta de respiración y cambio de color de ojos. NOTA: El tiempo esperado para la eutanasia suele ser dentro de 10 a 15 minutos.</li>
	<li>Después de observar los signos de muerte, retire el ratón de la cámara de eutanasia.</li>
	<li>Para completar el procedimiento de eutanasia, verifique la muerte confirmando el paro respiratorio y cardíaco.</li>
</ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Se verificó la viabilidad del sistema de estimulación optogenética simultánea y registro electrofisiológico (Figura 6). Los grandes picos durante la estimulación de la luz son artefactos fotoeléctricos que ocurren al mismo tiempo que la estimulación de la luz (Figura 6A). Esto queda claro en la vista ampliada de la forma de onda en el rectángulo discontinuo rojo (Figura 6A). Como se muestra en la Figura 6A</stro...

Registrar y controlar la actividad neuronal es esencial para comprender cómo funciona el cerebro en una red neuronal y a nivel celular. Los métodos convencionales de registro electrofisiológico incluyen la pinza de parche 1,2,3,4 utilizando una micropipeta y el registro extracelular utilizando electrodos microneurales 5,6,7,8. Como método de neuromodulación, la estimulación eléctrica se ha utilizado con frecuencia para estimular directamente una región focal del cerebro a través de la despolarización directa o indirecta de las células neuronales. Sin embargo, el método eléctrico no puede distinguir los tipos de células neuronales para el registro o la estimulación porque las corrientes eléctricas se propagan en todas las direcciones.
Como tecnología emergente, la optogenética ha marcado el comienzo de una nueva era en la comprensión de cómo funciona el sistema nervioso 9,10,11,12,13,14,15,16. La esencia de las técnicas optogenéticas es utilizar la luz para controlar la actividad de las proteínas opsina sensibles a la luz expresadas por células modificadas genéticamente. Así, la optogenética permite la modulación o monitorización sofisticada de células seleccionadas genéticamente en circuitos neuronales complicados14,17. El uso más amplio del enfoque optogenético ha requerido la grabación neuronal simultánea para confirmar directamente la neuromodulación óptica. Por lo tanto, un dispositivo integrado con funciones de control de luz y grabación sería extremadamente valioso 16,18,19,20,21,22,23,24,25.
Existen limitaciones de la estimulación optogenética convencional basada en láser, que requiere un sistema de suministro de luz voluminoso y costoso 26,27,28,29,30. Por lo tanto, algunos grupos de investigación emplearon sondas de silicio basadas en μLED para minimizar el tamaño del sistema de suministro de luz 31,32,33,34. Sin embargo, existe el riesgo de daño cerebral térmico causado por el contacto directo con μLED debido a la baja eficiencia de conversión de energía de los LED. Se han aplicado guías de onda de luz, como fibras ópticas, SU-8 y oxinitruro de silicio (SiON), para evitar daños térmicos 30,35,36,37,38,39. Sin embargo, esta estrategia también tiene un inconveniente debido a su baja eficiencia de acoplamiento entre las fuentes de luz y las guías de onda.
La matriz de microlentes se introdujo anteriormente para mejorar la eficiencia de acoplamiento de luz entre LED y fibras ópticas40. Se desarrolló un sistema optrode basado en tecnologías de sistemas microelectromecánicos (MEMS) para la estimulación óptica y el registro eléctrico a microescala40. La matriz de microlentes entre un LED y fibras ópticas aumentó la eficiencia de la luz en 3,13 dB. Como se muestra en la Figura 1, una matriz de fibra óptica 2x2 está alineada en la matriz de microlentes 4x4, y el LED se coloca debajo de la matriz de microlentes. Las fibras ópticas 2x2 se montan en lugar de 4x4 para reducir el daño cerebral. Una matriz de electrodos de tungsteno se coloca adyacente a la matriz optrode utilizando silicio a través de orificios para el registro electrofisiológico (Figura 1B).
El sistema consta de una parte superior desechable y partes inferiores desmontables. La parte superior desechable, que incluye la matriz de fibra óptica, la matriz de microlentes y la matriz de electrodos de tungsteno, está diseñada para implantarse permanentemente en el cerebro para experimentos in vivo . La parte inferior incluye una fuente de luz LED y una línea de fuente de alimentación externa, que es fácilmente extraíble y reutilizable para otro experimento con animales. Una cubierta de plástico acoplable protege la pieza desechable cuando se retira la pieza desmontable.
La viabilidad del sistema se verifica mediante la implantación en el cerebro de ratones transgénicos que expresan canalrodopsina-2 (ChR2) en neuronas positivas para la proteína quinasa II dependiente de Ca2+/calmodulina (ratón CaMKIIα::ChR2). Se utilizaron electrodos de grabación para registrar las actividades neuronales de neuronas individuales durante la estimulación óptica de las neuronas.

<table><tbody><tr><td>Conector de 5 pines</td><td>NW3</td><td>HD127K</td> Paso de <td>1,27 mm (0,050")</td></tr><tr><td>Bovie</td><td>Fine Science Tools(F.S.T)</td><td>18010-00 Software de adquisición de</td> datos del <td>kit de cauterización de alta temperatura</td></tr><tr><td></td><td>Intan Technologies, LLC</td><td>Software de la placa de interfaz USB</td><td>Trabaje con la placa de interfaz USB RHD</td></tr><tr><td>Cemento dental</td><td>Lang Dental Manufacturing Company, Inc.</td><td>1223CLR</td><td>Utilice el líquido y el polvo a chorro en el paquete de reparación de dentaduras postizas a chorro</td></tr><tr><td>Brazo manipulador digital</td><td>Stoelting Co.</td><td>51904/51906</td><td>Izquierda, Derecha cada uno Brazo Manipulador Digital, 3 Ejes, Espuma de</td></tr><tr><td>Gel</td> Adicional <td>Cutanplast</td><td>Standard (70*50*10 mm)</td><td>Esponja de gelatina reabsorbible estéril con efecto hemostático</td></tr><tr><td>Preamplificador de Headstage</td><td>Intan Technologies, LLC</td><td></td>#C3314 <td>RHD Cabezal de grabación de 16 canales</td></tr><tr><td>Almohadilla térmica</td><td>Stoelting Co.</td><td>53800R</td><td>Calentador de roedores de almacenamiento X1 con almohadilla térmica para ratas</td></tr><tr><td>LED</td><td>OSLON</td><td>GB CS8PM1.13</td><td>&lambda; typ. 470 nm, Ángulo de visión 80 &deg;, Tensión directa 2.85 V</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks, Inc.</td><td>R2019a</td><td></td></tr><tr><td>Micro Clamp</td><td>SURGIWAY</td><td>12-1002-04</td><td>Tipo recto, Serre-fino DIEFFENBACH droite 3,5 cm</td></tr><tr><td>Fibra óptica</td><td>Thorlabs, Inc.</td><td>FT200UMT</td><td>0,39 NA, &Oslash; 200 &micro; Fibra óptica multimodo de núcleo m, alto OH para alambre</td></tr><tr><td>de tungsteno recubierto de PFA</td> de 300 - 1200 nm <td>Sistema A-M Tipo de</td> varilla <td>pedido por encargo</td><td>, &Oslash; 101.6 &mu; m (.004")</td></tr><tr><td>Fotodiodo</td><td>Thorlabs</td><td>S121C</td><td></td></tr><tr><td>medidor</td><td>de potencia Thorlabs Inc.</td><td>PM100D</td><td></td></tr><tr><td>Cuchilla de precisión</td><td>FITEL</td><td>S326</td><td>Herramienta de corte de fibra</td></tr><tr><td>Prisma</td><td>GraphPad</td><td>versión 5.01</td><td></td></tr><tr><td>Bisturí</td><td>Feather&trade;</td><td>#20</td><td>Hoja de bisturí con tornillo de mango de bisturí de 100 mm de largo</td></tr><tr><td></td><td>Nasa Korea</td><td>acero inoxidable</td><td>diámetro: 1,2 mm, longitud: 3 mm</td></tr><tr><td>Alambre de plata</td><td>The Nilaco Corporation</td><td>AG-401265</td> <td>& Oslash; 200 &micro; m</td></tr><tr><td>Fxrame estereotáxico</td><td>Stoelting Co.</td><td>51500D</td> Nueva sutura <td>estereotáxica, rata y ratón estándar digital</td></tr><tr><td></td><td>ETHICON</td><td>W9106</td><td>tamaño de sutura: 4-0, longitud:75 cm, diámetro del alambre: 4-0</td></tr><tr><td>Vaselina</td><td>Unilever PLC Vaselina</td><td>Original</td><td>100% pura vaselina</td></tr><tr><td>Wave_Clus</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table> https://github.com/csn-le/wave_clus

optrode array para modulación optogenética simultánea y grabación neuronal eléctrica

Optrode Array for Simultaneous Optogenetic Modulation and Electrical Neural Recording

Durante la última década, la optogenética se ha convertido en una herramienta esencial para la investigación de la señalización neuronal debido a su capacidad única de modulación o monitoreo neuronal selectivo. Como tipos específicos de células neuronales pueden modificarse genéticamente para expresar proteínas opsina, la optogenética permite la estimulación óptica o la inhibición de las neuronas seleccionadas. Ha habido varios avances tecnológicos en el sistema óptico para la optogenética. Recientemente, se propuso combinar la guía de onda óptica para la entrega de luz con el registro electrofisiológico para monitorear simultáneamente las respuestas neuronales a la estimulación o inhibición optogenética. En este estudio, se desarrolló una matriz optrode implantable (fibras ópticas 2x2) con electrodos multicanal integrados. 
Se empleó un diodo emisor de luz (LED) como fuente de luz, y se integró una matriz de microlentes microfabricadas para proporcionar suficiente potencia de luz en la punta de las fibras ópticas. El sistema optrode array comprende la parte desechable y la parte reutilizable. La parte desechable tiene fibras ópticas y electrodos, mientras que la parte reutilizable tiene el LED y los circuitos electrónicos para el control de la luz y el procesamiento de la señal neuronal. El novedoso diseño del sistema de matriz optrode implantable se introduce en el video adjunto, además del procedimiento de la cirugía de implantación optrode, la estimulación optogenética de la luz y el registro neuronal electrofisiológico. Los resultados de los experimentos in vivo mostraron con éxito picos neuronales bloqueados en el tiempo evocados por los estímulos de luz de las neuronas excitadoras del hipocampo de ratones.

El sistema optrode se fabrica con éxito para proporcionar suficiente potencia de luz para activar las neuronas objetivo. La alineación fina de los electrodos de tungsteno se logra a través del silicio microfabricado a través de los agujeros. La intensidad de luz medida es de 3,6 mW/mm2 en la punta de la fibra óptica cuando se aplica una corriente de 50 mA. La microlente aumentó la eficiencia lumínica en 3,13 dB. Debido a la matriz de microlentes, que mejora el acoplamiento de luz, la corriente aplicada es apro...

Aquí, presentamos el método de fabricación de un sistema optrode con fibras ópticas para la entrega de luz y una matriz de electrodos para la grabación neuronal. Los experimentos in vivo con ratones transgénicos que expresan canalrodopsina-2 muestran la viabilidad del sistema para la estimulación optogenética simultánea y el registro electrofisiológico.

Optrode Array para modulación optogenética simultánea y grabación neuronal eléctrica

During the last decade, optogenetics has become an essential tool for the investigation of neural signaling due to its unique capability of selective ...

Este protocolo incluye la fabricación en el sistema optrode para la estimulación optogenética simultánea y el registro electrofisiológico. El sistema basado en LED propuesto mejora la eficiencia del acoplamiento de luz a través de una matriz de microlentes. Una fuente de luz LED tiene una configuración de iluminación simple que una fuente de luz láser para que el sistema sea fácilmente aplicable al sistema inalámbrico.La optogenética es una técnica de camino para comprender la patología de la enfermedad neurológica y los mecanismos de tratamiento. La optogenética se puede aplicar para tratar lesiones de la médula espinal, epilepsia, enfermedad de Parkinson y enfermedad de Alzheimer. Nuestro dispositivo basado en LED se puede implementar aún más como un sistema inalámbrico con varias ventajas, como la baja complejidad del sistema, la rentabilidad y el bajo consumo de energía.Primero, conecte el conector hembra de paso de 1,27 milímetros al preamplificador de la etapa principal. Coloque el LED en la carcasa impresa en 3D. Mida la intensidad de la luz en el extremo de la punta de la fibra óptica utilizando un fotodiodo.Sumergir los electrodos de tungsteno y las fibras ópticas en alcohol durante 15 minutos y secarlos al aire. Afeitar la piel de la cabeza y colocar el ratón anestesiado en el marco estereotáctico. Coloque la cabeza dentro del marco estereotáctico e inserte barras para los oídos en el meato.Encienda la almohadilla térmica incrustada en el marco estereotáctico y mantenga la temperatura corporal a 37 grados centígrados durante los procedimientos quirúrgicos. Ajuste la barra de incisión para ajustar la altura de la barra de incisión y apriete la pinza nasal contra el hocico. Cubra los ojos con vaselina para evitar la sequedad.Levante la piel de la cabeza con fórceps, asegure un espacio de inyección e inyecte 1% de lidocaína debajo del cuero cabelludo. Realice una incisión sagital con un bisturí y tijeras finas. Sostenga la piel incisa con una microclamp para ampliar la visibilidad del área quirúrgica.Retire el periostio con hisopos de algodón. Si hay sangrado, cauterice el cráneo usando un bovie para sellar los vasos sanguíneos. Limpie el cráneo con solución salina y marque los sitios de craneotomía con un brazo manipulador.Perfore un agujero por encima del cerebelo e inserte un tornillo para el suelo. Usando un tornillo de precisión, coloque el tornillo de tierra a 0,5 milímetros de profundidad hasta que llegue a la parte superior del cerebelo. Perfore el área marcada y retire un pedazo del cráneo con fórceps.Doble la punta de una aguja de calibre 26 en el sentido de las agujas del reloj en un ángulo de 120 grados y exponga el área del cerebro insertando el lado biselado de la aguja hacia arriba. Fije la matriz optrode en el brazo manipulador y muévase cerca del área expuesta. Inserte lentamente la matriz optrode y conecte el tornillo de tierra al cable plateado conectado al sistema.Inserte espuma de gel entre el cerebro expuesto y el dispositivo para proteger los productos químicos del contacto directo con el cerebro. Aplique cuidadosamente cemento dental en el cráneo para fijar el dispositivo y cubrir la espuma de gel. Antes de que el cemento dental se endurezca por completo, separe el cuero cabelludo si está unido al cemento dental.Tire de la piel incisa con fórceps para cubrir el cemento dental endurecido y suture el cuero cabelludo. Coloque el ratón anestesiado en el marco estereotáctico. Ajuste la receta de pulso de luz al 4% del ciclo de trabajo en una frecuencia de 10 Hertz.Configure la estimulación de la luz durante dos segundos durante la grabación neuronal. Retire la cubierta de plástico y conecte la parte superior de los sistemas de suministro de luz con el LED reutilizable en los circuitos. Conecte el preamplificador de la etapa de la cabeza al conector implantado de cinco pines.Abra el software y configure los filtros de software. A continuación, haga clic y establezca la frecuencia de muestreo del amplificador. A continuación, haga clic en cambiar ancho de banda.Ajuste el ancho de banda inferior del amplificador y el ancho de banda superior del amplificador. Compruebe el software DAC High-Pass Filter. Abra Spike Scope y verifique las señales neuronales utilizando el umbral de voltaje.Haga clic en Detener y grabar. Cargue los datos adquiridos mediante MATLAB y compruebe los datos sin procesar. A continuación, ejecute el código de clasificación de picos que contiene el algoritmo de registro de onda.Compruebe los picos ordenados en el diagrama ráster. Ahora traza los picos de conteo y comprueba los picos evocados durante la estimulación de la luz. La figura muestra formas de onda enteras registradas con condiciones exactas, incluyendo dos segundos de luz en el período en el medio.El número de picos neuronales individuales evocados después de cada pulso de estimulación de luz aumentó significativamente en comparación con la línea de base con diferentes intervalos de tiempo de dos segundos y 0,2 segundos. La figura muestra un histograma de pico para cada canal antes, durante y después de la estimulación de la luz. La figura del recuadro indica la ubicación de la matriz optrode implantada.Además, la versión ampliada muestra un histograma de pico con un contenedor de tiempo de 100 milisegundos. La barra azul representa el período de tiempo en que la luz LED estuvo encendida para registrar la respuesta. Para minimizar el ruido del artefacto del proceso de corriente de conducción LED, el sistema debe diseñarse para garantizar una distancia suficiente entre la vía de la señal eléctrica y el circuito LED.El sistema optrode basado en LED propuesto puede investigar las diversas neurocodiñaciones relacionadas con los comportamientos de los animales porque puede proporcionar estimulación optogenética y registrar las respuestas neuronales evocadas. Una matriz de optrode LED es compatible con la interfaz optogenética inalámbrica, que se puede utilizar en la investigación de animales en movimiento libre.

optrode-array-for-simultaneous-optogenetic-modulation-electrical

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Se describe un procedimiento para la manipulación de la actividad de las neuronas piramidales corticales cerebrales optogenetically mientras que el electroencefalograma, electromiograma, y ​​la concentración de lactato cerebral son monitoreados. Grabaciones experimentales se realizaron en ratones de cable-atados mientras se someten espontáneas de sueño / vigilia ciclos. Optogenético equipo es ensamblado en nuestro laboratorio; aparato de control está disponible comercialmente.

Electroencefalografía simultánea, en tiempo real Medición de la concentración de lactato y Manipulación optogenético de la actividad neuronal en la corteza cerebral de roedores

Este video describe un método para obtener imágenes y registrar simultáneamente la actividad eléctrica de cortes de cerebro transgénicos que contienen proteínas fluorescentes específicas de neuronas. El procedimiento consiste en mantener el corte de cerebro en una cámara de perfusión con líquido cefalorraquídeo artificial aireado, utilizar una fuente de luz para excitar las células marcadas con fluorescencia y registrar las señales eléctricas con una sonda multicanal y una pinza de parche.

Monitorización óptica y electrofisiológica simultánea de células neuronales en cortes de cerebro

Este video demuestra el procedimiento para estudiar la eficiencia sináptica en la corteza entorrinal lateral (LEC) mediante la estimulación optogenética de los axones de la corteza prefrontal medial (mPFC) y el registro de las respuestas de las neuronas piramidales en la LEC. Este método combina registros de patch-clamp con activación sináptica por estimulación lumínica para estudiar la plasticidad sináptica.

Estimulación optogenética y registro electrofisiológico de eventos sinápticos en cortes de cerebro de rata

El reciente desarrollo de herramientas de la neurociencia, que combinan la genética y la óptica, denominada "optogenética", permite el control sobre la actividad de circuitos neuronales con un nivel sin precedentes de la resolución espacial y temporal. Aquí les ofrecemos un protocolo para la integración en la grabación vivo con la manipulación optogenética de subconjuntos definidos genéticamente las neuronas piramidales corticales y subicular prefrontales.

Un método para la alta fidelidad Optogenética control de un individuo neuronas piramidales<em&gt; En vivo</em

Diferentes recubrimientos de electrodos afectan al rendimiento de grabación neural a través de cambios en las propiedades electroquímicas, químicas y mecánicas. Comparación de los electrodos in vitro es relativamente simple, sin embargo la comparación de la respuesta in vivo típicamente se complica por las variaciones en la distancia de los electrodos / neurona y entre animales. Este artículo proporciona un método robusto para comparar electrodos de grabación neural.

Un método para Sistemática Electroquímica y electrofisiológico Evaluación de Neuronales Grabación Electrodos

optogenética se ha convertido en una poderosa herramienta para su uso en experimentos de neurociencia conductual. Este protocolo ofrece una guía paso a paso para el diseño y la configuración de sistemas láser, y proporciona un protocolo completo para llevar a cabo estimulaciones optogenéticas in vivo múltiples y simultáneas compatibles con la mayoría de los paradigmas de pruebas de comportamiento de roedores.

In vivo optogenético la estimulación del sistema nervioso central de roedores

Aquí describimos nuestra estrategia para obtener registros estables y bien aislados de una sola unidad a partir de interneuronas inhibitorias identificadas en la corteza del ratón anestesiado. Las neuronas que expresan ChR2 se identifican por su respuesta a la luz azul. El método utiliza un equipo de registro extracelular estándar y sirve como una alternativa económica a las imágenes de calcio o a los parches guiados visualmente.

Una guía para En vivo Single-unidad de grabación de Optogenetically Identificado cortical inhibitorio interneuronas

Este trabajo presenta un método para realizar un optogenetic de una sola unidad grabación fiable desde un ratón despierto utilizando un optrode de cristal a medida.

Optogenetics identificación de un tipo Neuronal con un vidrio Optrode en ratones despiertos

Hemos desarrollado un enfoque simplificado y rentable para la fabricación de electrodos y hemos realizado grabaciones de señales en múltiples regiones en ratones que se mueven libremente. El uso de la optogenética, junto con la electrofisiología multirregional y el registro de señales de calcio, permitió la revelación de las actividades neuronales en todas las regiones del modelo de convulsiones.

Un método integrado para crear optrodes electrofisiológicos flexibles y convenientes para el registro in vivo en múltiples regiones

Aquí, presentamos dos protocolos para el registro de microelectrocorticografía de alta densidad (μEcoG) en ratas y ratones, incluidos los métodos quirúrgicos, de implantación y de registro. Los registros de μECoG se realizan en combinación con el registro de politrodos laminares en la corteza auditiva de la rata o con la manipulación optogenética de la actividad neuronal en la corteza somatosensorial del ratón.

Investigaciones multiescala del procesamiento cortical mediante la integración de politrodos laminares y optogenética con microelectrocorticografía en roedores

Este protocolo proporciona un método integrado que incluye la administración viral, la implantación de optrode, la inducción fototrombótica, el registro simultáneo de la actividad de astrocitos y neuronales, y la estimulación optogenética de los astrocitos. Este método integrado tiene como objetivo proporcionar una investigación simultánea de la relación astrocito-neurona a lo largo de las etapas agudas a crónicas del ictus isquémico.

Un método integrado para el modelado fototrombótico del ictus y el registro in vivo de la actividad neuronal y astrocítica en ratones en comportamiento

Aprende a fabricar un sistema optrode LED para estimulación optogenética y grabación electrofisiológica simultánea en ratones transgénicos con channelrhodopsin-2. Este método permite investigar respuestas neuronales evocadas con bajo consumo energético.

Optrode Array para modulación optogenética simultánea y grabación neuronal eléctrica

Explorar más videos