Name: Medición del contenido de hierro no hemo en tejidos utilizando un ensayo colorimétrico basado en batofenantrolina (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-31T14:45:00.000+00:00
Duration: 5 min 8 s
Description: Aprende a medir el contenido de hierro no hemo en tejidos animales mediante un ensayo colorimétrico con batofenantrolina. Este método accesible permite analizar el metabolismo del hierro en modelos experimentales.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabajo fue financiado por fondos nacionales a través de FCT-Fundação para a Ciência e a Tecnologia, I.P., en el marco del proyecto UIDB/04293/2020.

Los ratones C57BL/6 fueron comprados comercialmente y los ratones con hepcidina nula (Hamp1−/−) sobre un fondo C57BL/68 fueron un amable regalo de Sophie Vaulont (Institut Cochin, Francia). Los animales fueron alojados en la instalación de animales i3S en condiciones específicas libres de patógenos, en un ambiente controlado por la temperatura y la luz, con libre acceso a chow y agua estándar para roedores. La lubina europea (Dicentrarchus labrax) se compró en una piscifactoría comercial y se alojó en las instalaciones de animales del ICBAS, en un entorno controlado por la temperatura y la luz, y se alimentó diariamente ad libitum con alimento estándar para lubinas. Todos los procedimientos que involucran animales vertebrados fueron aprobados por el Comité de Ética Animal i3S y la autoridad nacional, Direção-Geral de Alimentação e Veterinária (DGAV). La información sobre reactivos comerciales, equipos y animales se enumera en la Tabla de materiales.
1. Preparación de la solución
NOTA: Manipule y prepare todos los reactivos y soluciones con cristalería sin hierro o artículos de plástico desechables. No permita que los materiales metálicos de laboratorio (por ejemplo, espátulas de acero inoxidable) entren en contacto con ningún reactivo o solución, debido al riesgo de contaminación por hierro. Asegúrese de que cualquier cristalería reutilizable esté libre de hierro. Lave los materiales con el detergente de laboratorio apropiado durante 30-60 min, enjuague con agua desionizada, remoje durante la noche en una solución de ácido nítrico al 37% diluida 1: 3 con agua desionizada, enjuague nuevamente con agua desionizada y deje secar.
<ol><li>Mezcla ácida: Agregue 10 g de ácido tricloroacético a 82.2 ml de ácido clorhídrico al 37% en una botella de vidrio, disuelva completamente y ajuste el volumen final a 100 ml con agua desionizada. Agitar antes de usar. Alternativamente, use solo ácido clorhídrico al 37% para la digestión de los tejidos. NOTA: La solución es estable durante al menos 2 meses cuando se almacena en botellas de reactivo de vidrio marrón oscuro. PRECAUCIÓN: El ácido clorhídrico y el ácido tricloroacético son corrosivos, y las formas concentradas liberan vapores ácidos tóxicos. Use prendas protectoras, guantes resistentes a los productos químicos y gafas de salpicaduras químicas en todo momento cuando manipule ácidos. Evite inhalarlos y siempre manipule los ácidos mientras está debajo de una campana de humos.</li>
	<li>Acetato de sodio saturado: Agregue 228 g de acetato de sodio anhidro a 400 ml de agua desionizada en una botella de vidrio y agite durante la noche a temperatura ambiente. Deje que la solución descanse y precipite durante un día. Si no se produce precipitación, continúe agregando pequeñas cantidades de acetato de sodio. Guarde la solución en una botella de vidrio.</li>
	<li>Reactivo de cromógeno: Para preparar 1 ml de reactivo de cromógeno, agregue 1 mg de sal disódica de ácido disódico disulfónico de 4,7-difenil-1,10-fenantrolina a 500 μL de agua desionizada y 10 μL de ácido tioglicólico concentrado (100%) y disuelva completamente. Enrasar el volumen final a 1 mL con agua desionizada. NOTA: Prepare tanto reactivo de cromógeno como sea necesario. La solución es estable durante 1 mes cuando está protegida de la luz.</li>
	<li>Reactivo de cromógeno de trabajo (WCR): Agregue 1 volumen del reactivo de cromógeno a 5 volúmenes de acetato de sodio saturado y 5 volúmenes de agua desionizada. NOTA: Esta solución debe prepararse recién hecha el día de su uso.</li>
	<li>Solución estándar de hierro en stock: Para preparar una solución de hierro de 20 mM, coloque 111,5 mg de polvo de hierro carbonilo en un matraz aforado de 250 ml que contenga 5.480 μL de ácido clorhídrico al 37%. Dejar disolver durante la noche a temperatura ambiente (o incubar en un baño de agua hirviendo). Luego, haga la solución a un volumen final de 100 ml con agua desionizada. NOTA: La solución estándar se puede mantener indefinidamente cuando se almacena en un recipiente herméticamente sellado.</li>
	<li>Solución estándar de hierro de trabajo (WISS): Agregue 13.5 μL de ácido clorhídrico al 37% a 500 μL de agua desionizada. Añadir 10 μL de la Solución Estándar de Hierro Stock y constituir el volumen final a 1 mL con agua desionizada (11,169 μg de Fe/mL, 200 μM; medido por AAS). NOTA: La solución de trabajo debe prepararse recién hecha el día de su uso.</li>
</ol>2. Secado de muestras
<ol><li>Corte una muestra de tejido que pese 10-100 mg con una cuchilla de bisturí. Péselo con precisión en una balanza analítica / de precisión sobre una pequeña pieza de parafilm (Fresh Weight).</li>
	<li>Usando pinzas de plástico, coloque el trozo de tejido en una placa de 24 pocillos (sin deslizar para permitir la evaporación del agua) y déjelo secar en una incubadora estándar a 65 ° C durante 48 h.</li>
	<li>Alternativamente, use un horno de digestión por microondas de laboratorio para secar muestras de tejido. Usando pinzas de plástico, coloque el pedazo de tejido pesado en una taza de teflón sin hierro y séquelo en el microondas. Establezca los parámetros de funcionamiento de acuerdo con el manual de instrucciones del instrumento. NOTA: Como referencia, los parámetros de funcionamiento para el secado de muestras de hígado utilizando el horno de digestión específico (ver Tabla de Materiales) se muestran en la Tabla 1.</li>
	<li>Usando pinzas de plástico, coloque cada pieza seca de tejido sobre una pequeña pieza de parafilm dentro de una balanza analítica / de precisión y pésela con precisión (peso seco).</li>
</ol>3. Digestión ácida de la muestra
<ol><li>Usando pinzas de plástico, transfiera cada pieza seca de tejido a un tubo de microcentrífuga de 1.5 ml.</li>
	<li>Agregue 1 ml de la mezcla ácida y cierre el tubo de la microcentrífuga. Prepare un ácido en blanco de la misma manera, excepto que se omita el tejido. PRECAUCIÓN: La mezcla ácida es corrosiva y libera vapores tóxicos. Use prendas protectoras, guantes resistentes a los productos químicos y gafas de salpicaduras químicas cuando manipule la mezcla ácida. Evite respirarlo y siempre manipularlo mientras está debajo de una campana de humos.</li>
	<li>Digiera los tejidos incubando los tubos de la microcentrífuga en una incubadora a 65 °C durante 20 h.</li>
	<li>Después de enfriar a temperatura ambiente, transfiera 500 μL del extracto de ácido transparente (amarillo) (sobrenadante) a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml utilizando una micropipeta equipada con puntas de plástico. Si no es posible obtener un sobrenadante claro, realice un giro de centrifugación corto. PRECAUCIÓN: El sobrenadante es altamente ácido. Use prendas protectoras, guantes resistentes a los productos químicos y gafas de salpicaduras químicas cuando manipule los sobrenadantes. Siempre manipularlos mientras está debajo de una campana de humos. NOTA: En este punto, los extractos ácidos pueden usarse inmediatamente para el ensayo colorimétrico o congelarse a -20 ° C para su uso posterior. Descongelar completamente las muestras congeladas a temperatura ambiente y vórtice antes de su uso.</li>
</ol>4. Desarrollo del color
<ol><li>Preparar las reacciones cromogénicas como se indica en la Tabla 2 en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml o, para un mayor rendimiento, directamente en las microplacas de poliestireno transparentes y sin tratar de fondo plano, de 96 pocillos. Prepare todas las reacciones (ácido en blanco, estándar y muestra) al menos por duplicado.</li>
	<li>Incubar a temperatura ambiente durante 15 min.</li>
</ol>5. Lectura de absorbancia
<ol><li>Mida la absorbancia de la muestra en un espectrofotómetro o lector de placas a una longitud de onda de 535 nm contra una referencia de agua desionizada. Las placas se pueden leer sin deslizar o con tapa. En el estuche con tapa, elimine cualquier condensación formada debido a la liberación de vapores ácidos de la tapa justo antes de la medición para evitar posibles interferencias con la lectura de absorbancia. NOTA: La absorbancia óptica del ácido en blanco leído contra agua desionizada (referencia) debe ser inferior a 0,015; la absorbancia óptica del estándar y las muestras debe estar entre 0,100 y 1,000. Para muestras con un contenido de hierro muy alto o muy bajo, puede ser necesario ajustar los volúmenes de extracto ácido (sobrenadante) y diH2O (Tabla 2): si la absorbancia es mayor que 1.0, use un volumen de muestra (sobrenadante) más pequeño; cuando la absorbancia sea inferior a 0,1, utilice un volumen mayor del sobrenadante. El volumen de la muestra (Vsmp) se tiene en cuenta al calcular el contenido de hierro tisular de cada muestra (consulte el paso 6).</li>
</ol>6. Cálculo del contenido de hierro tisular
<ol><li>Calcule el contenido de hierro en tejidos no hemo con la siguiente ecuación: Hierro tisular (μg/g de tejido seco) = <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63469/63469eq01v2.jpg"> AT = absorbancia de la muestra de prueba AB = absorbancia del ácido en blanco AS = absorbancia del estándar Fes = concentración de hierro de WISS (μg Fe/ml) W = peso del tejido seco (g) Vsmp = volumen de muestra (volumen variable de sobrenadante en la Tabla 2 convertido a mL) Vf = volumen final de la mezcla ácida después de la incubación nocturna a 65 °C (correspondiente al volumen ácido más el volumen de tejido seco en ml; si los pesos de la muestra no difieren significativamente, supongamos un volumen constante ≈ 1 ml) Vstd = volumen estándar de hierro (volumen de WISS en la Tabla 2 convertido a mL) Vrv = volumen de reacción final (Volumen total en la Tabla 2 convertido a mL)</li>
</ol>

<ol><li>Muckenthaler, M. U., Rivella, S., Hentze, M. W., Galy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+red+carpet+for+iron+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A red carpet for iron metabolism.</a> Cell. 168, 344-361 (2017).</li>
<li>Pagani, A., Nai, A., Silvestri, L., Camaschella, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepcidin+and+anemia%3A+A+tight+relationship%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Hepcidin and anemia: A tight relationship.</a> Frontiers in Physiology. 10, 1294(2019).</li>
<li>Weiss, G., Ganz, T., Goodnough, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anemia+of+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Anemia of inflammation.</a> Blood. 133 (1), 40-50 (2019).</li>
<li>Altamura, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+iron+homeostasis%3A+Lessons+from+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Aspects+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Regulation of iron homeostasis: Lessons from mouse models.</a> Molecular Aspects of Medicine. 75, 100872(2020).</li>
<li>Torrance, J. D., Bothwell, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+technique+for+measuring+storage+iron+concentrations+in+formalinised+liver+samples%5BTitle%5D)+AND+%22South+African+Journal+of+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">A simple technique for measuring storage iron concentrations in formalinised liver samples.</a> South African Journal of Medical Sciences. 33 (1), 9-11 (1968).</li>
<li>Torrence, J. D., Bothwell, T. H. Tissue iron stores. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTorrence%2C+JD+%22Methods+in+Haematology%22">Methods in Haematology</a>. Cook, J. D. , Churchill Livingston Press. New York. 104-109 (1980).</li>
<li>Rebouche, C. J., Wilcox, C. L., Widness, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microanalysis+of+non-heme+iron+in+animal+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemical+and+Biophysical+Methods%22%5BJournal%5D)">Microanalysis of non-heme iron in animal tissues.</a> Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 58 (3), 239-251 (2004).</li>
<li>Lesbordes-Brion, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+disruption+of+the+hepcidin+1+gene+results+in+severe+hemochromatosis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Targeted disruption of the hepcidin 1 gene results in severe hemochromatosis.</a> Blood. 108, 1402-1405 (2006).</li>
<li>Jumbo-Lucioni, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systems+genetics+analysis+of+body+weight+and+energy+metabolism+traits+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Systems genetics analysis of body weight and energy metabolism traits in Drosophila melanogaster.</a> BMC Genomics. 11, 297(2010).</li>
<li>Mandilaras, K., Pathmanathan, T., Missirlis, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+Absorption+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrients%22%5BJournal%5D)">Iron Absorption in Drosophila melanogaster.</a> Nutrients. 5, 1622-1647 (2013).</li>
<li>Grundy, M. A., Gorman, N., Sinclair, P. R., Chorney, M. J., Gerhard, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+non-heme+iron+assay+for+animal+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemical+and+Biophysical+Methods%22%5BJournal%5D)">High-throughput non-heme iron assay for animal tissues.</a> Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 59, 195-200 (2004).</li>
<li>Adrian, W. J., Stevens, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wet+versus+dry+weights+for+heavy+metal+toxicity+determinations+in+duck+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Wildlife+Diseases%22%5BJournal%5D)">Wet versus dry weights for heavy metal toxicity determinations in duck liver.</a> Journal of Wildlife Diseases. 15, 125-126 (1979).</li>
</ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses.

Se proporciona un protocolo para la medición del contenido de hierro no hemo en tejidos animales, utilizando una adaptación del ensayo colorimétrico basado en batofenantrolina descrito originalmente por Torrance y Bothwell5,6. Los pasos críticos del método son el secado de muestras de tejido; desnaturalización de proteínas y liberación de hierro inorgánico por hidrólisis ácida; reducción del hierro férrico (Fe3+) al estado ferroso (Fe2+) en ...

El hierro es un micronutriente esencial, necesario para la función de las proteínas involucradas en procesos biológicos cruciales como el transporte de oxígeno, la producción de energía o la síntesis de ADN. Es importante destacar que tanto el exceso de hierro como la deficiencia de hierro son altamente perjudiciales para la salud humana, y los niveles de hierro en los tejidos están finamente regulados. La absorción anormal de hierro en la dieta, las dietas deficientes en hierro, las transfusiones de sangre repetidas y la inflamación crónica son causas comunes de trastornos asociados con el hierro que afectan a miles de millones de personas en todo el mundo1,2,3.
Los modelos animales experimentales de sobrecarga o deficiencia de hierro han sido fundamentales para avanzar en nuestro conocimiento de los mecanismos implicados en la regulación sistémica y celular de la homeostasis del hierro4. A pesar de los progresos sustanciales realizados durante las dos últimas décadas, muchos aspectos clave siguen siendo difíciles de alcanzar. En los próximos años, la medición precisa de los niveles totales de hierro en los tejidos animales seguirá siendo un paso crítico para avanzar en la investigación en el campo de la biología del hierro.
La mayoría de los laboratorios cuantifican el hierro tisular con espectroscopia de absorción atómica (AAS), espectrometría de masas de plasma acoplada inductivamente (ICP-MS) o un ensayo colorimétrico basado en la reacción del hierro no hemo con un reactivo de batofenantrolina. Este último se basa en el método original descrito por Torrance y Bothwell hace más de 50 años5,6. Si bien posteriormente se desarrolló una variación de este método empleando ferrozina como alternativa a la batofenantrolina7, este último sigue siendo el reactivo cromogénico más citado en la literatura.
El método de elección a menudo depende de la experiencia y la infraestructura disponibles. Si bien AAS e ICP-MS son más sensibles, el ensayo colorimétrico sigue siendo ampliamente utilizado porque presenta las siguientes ventajas importantes: i) excluye la contribución de hierro hemo derivado de la hemoglobina contenida en los glóbulos rojos; ii) no requiere habilidades analíticas sofisticadas o equipos altamente costosos; y iii) el ensayo original basado en cubeta se puede adaptar a un formato de microplaca, lo que permite un mayor rendimiento de la muestra. El enfoque colorimétrico presentado en este trabajo se utiliza rutinariamente para cuantificar alteraciones en los niveles de hierro no hemo tisular en una variedad de modelos animales experimentales de sobrecarga o deficiencia de hierro, desde roedores hasta peces y moscas de la fruta. Aquí, se proporciona un protocolo para la medición del contenido de hierro no hemo en los tejidos animales, utilizando un ensayo colorimétrico simple, bien establecido que la mayoría de los laboratorios deberían encontrar fácil de implementar.

<table><tbody><tr><td>Placa transparente UV de 96 pocillos</td><td>Sarstedt</td><td>82.1581.001</td><td></td></tr><tr><td>Balanza analítica</td><td>Kern</td><td>ABJ 220-4M</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de sodio anhidro</td><td>Merck</td><td>106268</td><td></td></tr><tr><td>sulfonato de tofofenantrolina (ácido 4,7-difenil-1,10-fenantrolina dissulfónico)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B1375</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6 ratones (Mus musculus)</td><td>Laboratorios</td><td></td><td></td>Charles River</tr><tr><td>Polvo de hierro carbonilo, &ge; 99.5%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>44890</td><td></td></tr><tr><td>Cubetas desechables de polimetacrilato de metilo (PMMA)</td><td>VWR</td><td>634-0678P</td><td></td></tr><tr><td>Agua estéril de doble destilación</td><td>B. Braun</td><td>0082479E Lector de</td><td></td></tr><tr><td>microplacas de fluorescencia</td><td>BioTek Instruments</td><td>FLx800</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorhídrico, 37%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>258148</td><td></td></tr><tr><td>Horno de digestión por microondas y tazas de teflón blanco</td><td>CEM</td><td>MDS-2000</td><td></td></tr><tr><td>Ácido nítrico</td><td>Fisher Scientific</td><td>15687290</td><td></td></tr><tr><td>Oven</td><td>Binder</td><td>ED115</td><td></td></tr><tr><td>Comida para roedores</td><td>Harlan Laboratories</td><td>2014S</td><td>Teklad Global 14% Protein Dieta de Mantenimiento de Roedores que contiene 175 mg/kg de hierro</td></tr><tr><td>Lubina (Dicentrarchus labrax)</td><td>Sonrionansa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pienso para lubina</td><td>Skretting</td><td>L-2 Alterna 1P</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotómetro UV-Vis de haz único</td><td>Shimadzu</td><td>UV mini 1240</td><td></td></tr><tr><td>Ácido tioglicólico</td><td>Merck</td><td>100700</td><td></td></tr><tr><td>Ácido tricloroacético</td><td>Merck</td><td>100807</td><td></td></tr></tbody></table>

medición del contenido de hierro no hemo en tejidos utilizando un ensayo colorimétrico basado en batofenantrolina

Measurement of Tissue Non-Heme Iron Content using a Bathophenanthroline-Based Colorimetric Assay

El hierro es un micronutriente esencial. Tanto la sobrecarga como la deficiencia de hierro son altamente perjudiciales para los seres humanos, y los niveles de hierro en los tejidos están finamente regulados. El uso de modelos animales experimentales de sobrecarga o deficiencia de hierro ha sido fundamental para avanzar en el conocimiento de los mecanismos implicados en la regulación sistémica y celular de la homeostasis del hierro. La medición de los niveles totales de hierro en tejidos animales se realiza comúnmente con espectroscopia de absorción atómica o con un ensayo colorimétrico basado en la reacción del hierro no hemo con un reactivo de batofenolantrolina. Durante muchos años, el ensayo colorimétrico se ha utilizado para la medición del contenido de hierro no hemo en una amplia gama de tejidos animales. A diferencia de la espectroscopia de absorción atómica, excluye la contribución de hierro hemo derivado de la hemoglobina contenida en los glóbulos rojos. Además, no requiere habilidades analíticas sofisticadas ni equipos altamente costosos, y por lo tanto se puede implementar fácilmente en la mayoría de los laboratorios. Finalmente, el ensayo colorimétrico puede basarse en cubetas o adaptarse a un formato de microplaca, lo que permite un mayor rendimiento de la muestra. El presente trabajo proporciona un protocolo bien establecido que es adecuado para la detección de alteraciones en los niveles de hierro tisular en una variedad de modelos animales experimentales de sobrecarga o deficiencia de hierro.

Comparación de cubeta versus microplacas de 96 pocillos La medición del hierro tisular no hemo por reacción con un reactivo de batofenolantrolina descrito originalmente por Torrance y Bothwell5,6 se basa en el uso de un espectrofotómetro para la lectura de la absorbancia. Por lo tanto, los volúmenes empleados en la reacción cromática son compatibles con el tamaño de una cubeta de espectrofotómetro regular. El presente trabajo describe un métod...

Aquí, se proporciona un protocolo para la medición del contenido de hierro no hemo en tejidos animales, utilizando un ensayo colorimétrico simple y bien establecido que se puede implementar fácilmente en la mayoría de los laboratorios.

Medición del contenido de hierro no hemo en tejidos utilizando un ensayo colorimétrico basado en batofenantrolina

Iron is an essential micronutrient. Both iron overload and deficiency are highly detrimental to humans, and tissue iron levels are finely regulated. The ...

Aquí hemos proporcionado un protocolo para medir el contenido no hemo en tejidos animales. Utilizando un ensayo colorimétrico simple y bien establecido que se puede implementar fácilmente en la mayoría de los laboratorios. El ensayo colorimétrico basado en batofenantrolina no requiere habilidades sofisticadas ni equipos altamente costosos y se puede adaptar al formato de microplaca para un mayor rendimiento de la muestra y rentabilidad.Este protocolo es adecuado para detectar alteraciones en los niveles de hierro tisular en una variedad de modelos animales experimentales de sobrecargas de hierro o eficiencia del hierro. Comience cortando una muestra de tejido que pese de 10 a 100 gramos con una cuchilla de bisturí. Péselo con precisión en una balanza analítica sobre un pequeño trozo de parafilm.Use pinzas de plástico para colocar el pedazo de tejido en una placa de 24 pocillos. Déjelo secar en una incubadora estándar a 65 grados centígrados durante 48 horas. Alternativamente, coloque el pedazo de tejido con pinzas de palo en una taza de teflón sin hierro y séquelo en el horno de digestión por microondas del laboratorio.Coloque cada pieza seca de tejido sobre una pequeña pieza de paraforma dentro de una balanza analítica y pésela con precisión. Transfiera cada pieza seca de tejido a un tubo de micro centrífuga de 1,5 mililitros. Agregue una luz de la mezcla ácida al tubo y ciérrelo.Prepare un ácido en blanco de la misma manera, excepto que el tejido se omite aquí. Incubar los tubos a 65 grados centígrados durante 20 horas para digerir el tejido. Después de enfriar a temperatura ambiente, use una micro pipeta equipada con puntas de plástico para transferir 500 microlitros del extracto de ácido transparente a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros.Prepare las reacciones de cromógeno directamente en las microplacas de poliestireno transparentes sin tratar de fondo plano de 96 pocillos. Incubado a temperatura ambiente durante 15 minutos. Mida la absorbancia de la muestra en un lector de placas a una longitud de onda de 535 nanómetros contra una referencia de agua desionizada.La determinación del hierro no hemo mediante los ensayos colorimétricos basados en cubeta y microplacas de 96 pocillos se muestran aquí. La correlación entre los niveles de hierro no hemo a base de cubeta y basado en microplacas en 55 muestras de tejido de seis meses de edad macho negro, seis ratones, incluyendo hígado, bazo, corazón, pulmones y médula ósea se muestran aquí. La alta correlación entre las dos metodologías indica que el método basado en microplacas es una alternativa válida al método original basado en cubetas.Finalmente, los niveles de hierro no hemo se cuantificaron con el método basado en microplacas después de la digestión ácida de la muestra derivada de los mismos tejidos con una mezcla de ácido clorhídrico y ácido tricloroacético o ácido clorhídrico solo. La alta correlación muestra que el ácido tricloroacético puede ser emitido por la digestión ácida. La imagen representativa muestra los niveles de hierro no hemo en el hígado, el bazo, el corazón y el páncreas de ratones machos negros de seis tipos salvajes y ratones machos de hepcidina knockout en fondo genético de seis negros medidos con el ensayo colorimétrico basado en batofenolantrolina.La interrupción de la hepcidina conduce a una hemocromatosis como el fenotipo de deposición de hierro con acumulación severa de hierro hepático, pancreático y cardíaco y agotamiento esplénico de hierro. Aquí se muestran los niveles hepáticos de hierro no hemo en lubina europea hembra juvenil después de la modulación experimental del hierro. Los niveles de hierro hepático aumentaron masivamente en animales tratados con hierro.Mientras que la anemia causó una reducción leve en las reservas hepáticas de hierro. Las imágenes representativas muestran los niveles de hierro no hemo en Drosophila de un mes de edad medidos con un ensayo colorimétrico basado en batofenantrolina. Los resultados muestran el contenido de hierro no hemo en cada grupo de 20 moscas o el contenido estimado de hierro de cada mosca.Considerando un peso promedio de 0.64 miligramos por mosca. Al intentar este procedimiento, recuerde limpiar a fondo todo el desgaste del vidrio y no permita que los materiales metálicos de laboratorio entren en contacto con ningún reactivo o solución debido al riesgo de contaminación.

measurement-tissue-non-heme-iron-content-using-bathophenanthroline

Research

Investigación

JoVE Journal

Medicine

Medicina

En este video, describimos un método basado en la colorimetría para determinar el contenido de hierro no hemo en el tejido hepático de ratón. El sulfonato de batofenantrolina se utiliza como sustrato cromogénico en presencia de un agente reductor, que convierte el hierro férrico en hierro ferroso quelastable.

Ensayo colorimétrico basado en sulfonato de bateofenantrolina: un método simple y rápido para la cuantificación de hierro no hemo en tejido hepático de ratón

Este video muestra una técnica in vitro para evaluar la biodisponibilidad de hierro en fuentes de alimentos complejas. La técnica combina la simulación de la digestión humana junto con la absorción de hierro por parte de células Caco-2 diferenciadas. La formación de ferritina intracelular actúa como un marcador para la absorción de hierro celular.

Bioensayo celular Caco-2: un método in vitro para medir la biodisponibilidad del hierro en fuentes alimentarias complejas

Los niveles alterados de hemo intracelular se asocian con enfermedades comunes como el cáncer. Por lo tanto, existe la necesidad de medir los niveles de biosíntesis de hemo en diversas células. El objetivo de este protocolo es proporcionar un método rápido y sensible para medir y comparar los niveles de síntesis de hemo en diferentes células.

Medición de niveles hemo síntesis en células de mamífero

Presentamos un protocolo sencillo y fiable para medir el contenido de hierro en los tejidos de la planta usando el método colorimétrico de azul de Prusia.

Un método colorimétrico para medir el contenido de hierro en plantas

Presentamos un ensayo para una fácil cuantificación de metales introducidos en muestras preparadas mediante cromatografía de afinidad de metales inmovilizadas. El método utiliza el azul hidroxinaphthol como indicador de metal colorimétrico y un espectrofotómetro UV-Vis como detector.

Cuantificación de la lixiviación de metal en la cromatografía de afinidad de metal inmovilizada

Este método de especiación redox de hierro se basa en la espectrometría de masas plasmáticas acoplada inductivamente por electroforesis capilar con apilamiento de muestras combinada con análisis cortos en una sola ejecución. El método analiza rápidamente y proporciona bajos límites de cuantificación para las especies de redox de hierro en una amplia gama de tejidos y muestras de biofluidos.

Configuración de Espectrometría de Masas De Plasma Acoplada Inductivamente Electroforesistiva (CE-ICP-MS) para Cuantificación de Especies redox de Hierro (Fe(II), Fe(III))

Este artículo demuestra cómo preparar y administrar hierro isotópico no radiactivo unido a transferrina para estudios de transporte de hierro en el embarazo de ratón. También se describe el enfoque para cuantificar el hierro isotópico en compartimentos fetoplacentarios.

Cuantificación del transporte de hierro a través de la placenta del ratón in vivo utilizando isótopos de hierro no radiactivos

El bioensayo de células Caco-2 para la biodisponibilidad de hierro (Fe) representa un enfoque rentable y versátil para evaluar la biodisponibilidad de Fe de alimentos, productos alimenticios, suplementos, comidas e incluso regímenes dietéticos. Completamente validado para estudios en humanos, representa el estado del arte para estudios de biodisponibilidad de Fe.

El bioensayo de células Caco-2 para la medición de la biodisponibilidad de hierro en los alimentos

Describimos un ensayo fluorescente que puede confirmar de forma rápida y económica la capacidad de nuevos compuestos para quelar el hierro. El ensayo mide la capacidad de los compuestos para superar la actividad de unión al hierro de la sonda fluorescente quelante de hierro débil Calceína, lo que resulta en un aumento cuantificable de la fluorescencia cuando se produce la quelación.

Método fluorescente sin células, cuantificable y económico, para confirmar la capacidad de nuevos compuestos para quelar el hierro 

Este protocolo presenta métodos para evaluar la distribución y cantidad de deposición de hierro en los tejidos, especialmente en el cerebro. El protocolo detalla los procedimientos para la preparación de muestras, la tinción de Perls/DAB, la captura de imágenes y el análisis de datos.

Evaluación de la deposición de hierro en el cerebro de ratones 5xFAD mediante tinción de Perls/DAB

Este trabajo ha discutido el protocolo para diseñar y desarrollar un dispositivo E-Eye-Enable POCT para detectar Fe, Cr, As y F en muestras ambientales, muestras biológicas y alimentos y bebidas. Se han analizado casi 2000 muestras y los resultados concuerdan con la técnica estándar de oro.

Técnica avanzada de detección E-Eye guiada por TD-DFT para la cuantificación in situ de Fe, Cr, F y As en muestras ambientales, biológicas y alimentarias

Aprende a medir el contenido de hierro no hemo en tejidos animales mediante un ensayo colorimétrico con batofenantrolina. Este método accesible permite analizar el metabolismo del hierro en modelos experimentales.

Medición del contenido de hierro no hemo en tejidos utilizando un ensayo colorimétrico basado en batofenantrolina

Explorar más videos