Name: Un enfoque altamente escalable para realizar estudios ecológicos de los nematodos de Caenorhabditis Selfing (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-01T14:15:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: Aprende un método escalable para estudios ecológicos de nematodos Caenorhabditis en su hábitat natural. Utiliza aplicaciones móviles y bases de datos en la nube para recolectar y gestionar datos ambientales con precisión.

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Esta investigación fue apoyada por fondos de puesta en marcha de la Universidad Northwestern y un Premio CAREER de la Fundación Nacional de Ciencias (IOS-1751035), ambos otorgados a E.C.A.

<ol><li>Frézal, L., Félix, M. -A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans+outside+the+Petri+dish%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">C. elegans outside the Petri dish.</a> eLife. 4, 05849(2015).</li>
<li>Sivasundar, A., Hey, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sampling+from+natural+populations+with+RNAI+reveals+high+outcrossing+and+population+structure+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%3A+CB%22%5BJournal%5D)">Sampling from natural populations with RNAI reveals high outcrossing and population structure in Caenorhabditis elegans.</a> Current Biology: CB. 15 (17), 1598-1602 (2005).</li>
<li>Kiontke, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phylogeny+and+molecular+barcodes+for+Caenorhabditis%2C+with+numerous+new+species+from+rotting+fruits%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Evolutionary+Biology%22%5BJournal%5D)">A phylogeny and molecular barcodes for Caenorhabditis, with numerous new species from rotting fruits.</a> BMC Evolutionary Biology. 11, 339(2011).</li>
<li>Petersen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ten+years+of+life+in+compost%3A+temporal+and+spatial+variation+of+North+German+Caenorhabditis+elegans+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Ecology+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Ten years of life in compost: temporal and spatial variation of North German Caenorhabditis elegans populations.</a> Ecology and Evolution. 5 (16), 3250-3263 (2015).</li>
<li>Richaud, A., Zhang, G., Lee, D., Lee, J., Félix, M. -A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+local+coexistence+pattern+of+selfing+genotypes+in+Caenorhabditis+elegans+natural+metapopulations%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The local coexistence pattern of selfing genotypes in Caenorhabditis elegans natural metapopulations.</a> Genetics. 208 (2), 807-821 (2018).</li>
<li>Ferrari, C., Salle, R., Callemeyn-Torre, N., Jovelin, R., Cutter, A. D., Braendle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ephemeral-habitat+colonization+and+neotropical+species+richness+of+Caenorhabditis+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Ecology%22%5BJournal%5D)">Ephemeral-habitat colonization and neotropical species richness of Caenorhabditis nematodes.</a> BMC Ecology. 17 (1), 43(2017).</li>
<li>Crombie, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+sampling+of+Hawaiian+Caenorhabditis+elegans+reveals+high+genetic+diversity+and+admixture+with+global+populations%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Deep sampling of Hawaiian Caenorhabditis elegans reveals high genetic diversity and admixture with global populations.</a> eLife. 8, 50465(2019).</li>
<li>Crombie, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+adaptation+and+spatiotemporal+patterns+of+genetic+diversity+revealed+by+repeated+sampling+of+Caenorhabditis+elegans+across+the+Hawaiian+Islands%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Local adaptation and spatiotemporal patterns of genetic diversity revealed by repeated sampling of Caenorhabditis elegans across the Hawaiian Islands.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Noble, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selfing+is+the+safest+sex+for+Caenorhabditis+tropicalis%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Selfing is the safest sex for Caenorhabditis tropicalis.</a> eLife. 10, 62587(2021).</li>
<li>Cutter, A. D., Morran, L. T., Phillips, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Males%2C+Outcrossing%2C+and+Sexual+Selection+in+Caenorhabditis+Nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Males, Outcrossing, and Sexual Selection in Caenorhabditis Nematodes.</a> Genetics. 213 (1), 27-57 (2019).</li>
<li>Petersen, C., Dirksen, P., Schulenburg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+we+need+more+ecology+for+genetic+models+such+as+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%3A+TIG%22%5BJournal%5D)">Why we need more ecology for genetic models such as C. elegans.</a> Trends in Genetics: TIG. 31 (3), 120-127 (2015).</li>
<li>Haber, M., Schüngel, M., Putz, A., Müller, S., Hasert, B., Schulenburg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+history+of+Caenorhabditis+elegans+inferred+from+microsatellites%3A+evidence+for+spatial+and+temporal+genetic+differentiation+and+the+occurrence+of+outbreeding%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Evolutionary history of Caenorhabditis elegans inferred from microsatellites: evidence for spatial and temporal genetic differentiation and the occurrence of outbreeding.</a> Molecular Biology and Evolution. 22 (1), 160-173 (2005).</li>
<li>Barrière, A., Félix, M. -A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+C.+elegans+and+Related+Nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Isolation of C. elegans and Related Nematodes.</a> WormBook. , https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK19764/ (2018).</li>
<li>Poullet, N., Braendle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sampling+and+isolation+of+C.+elegans+from+the+natural+habitat%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Sampling and isolation of C. elegans from the natural habitat.</a> Methods in Molecular Biology. 1327, 221-229 (2015).</li>
<li>Di Bernardo, M., Crombie, T. A., Cook, D. E., Andersen, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((easyFulcrum%3A+An+R+package+to+process+and+analyze+ecological+sampling+data+generated+using+the+Fulcrum+mobile+application%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">easyFulcrum: An R package to process and analyze ecological sampling data generated using the Fulcrum mobile application.</a> PloS one. 16 (10), 0254293(2021).</li>
<li>Mobile data collection & workflow automation in NCAP. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.fulcrumapp.com/">https://www.fulcrumapp.com/</a> (2021).</li>
<li>Nematode Isolation Application. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.fulcrumapp.com/apps/nematode-isolation">https://www.fulcrumapp.com/apps/nematode-isolation</a> (2021).</li>
<li>Nematode Field Sampling Application. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.fulcrumapp.com/apps/nematode-field-sampling">https://www.fulcrumapp.com/apps/nematode-field-sampling</a> (2021).</li>
<li>JOVE wild_isolate-genotyping-template. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://docs.google.com/spreadsheets/d/1oEP40jy6_K6Wkwn7Qm4iF58rTUe4JWk2zhJ20-keoOk/edit">https://docs.google.com/spreadsheets/d/1oEP40jy6_K6Wkwn7Qm4iF58rTUe4JWk2zhJ20-keoOk/edit</a> (2021).</li>
<li>Nucleotide BLAST: Search nucleotide databases using a nucleotide query. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://blast.ncbi.nim.nih.gov/Blast.cgi?PAGE_TYPE=BlastSearch">https://blast.ncbi.nim.nih.gov/Blast.cgi?PAGE_TYPE=BlastSearch</a> (2021).</li>
<li>easyFulcrum. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://andersenlab.org/easyfulcrum/articles/easyFulcrum.html">http://andersenlab.org/easyfulcrum/articles/easyFulcrum.html</a> (2021).</li>
<li>Andersen, E. C., Bloom, J. S., Gerke, J. P., Kruglyak, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+variant+in+the+neuropeptide+receptor+npr-1+is+a+major+determinant+of+Caenorhabditis+elegans+growth+and+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">A variant in the neuropeptide receptor npr-1 is a major determinant of Caenorhabditis elegans growth and physiology.</a> PLoS Genetics. 10 (2), 1004156(2014).</li>
<li>Tuli, M. A., Daul, A., Schedl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WormBook%3A+Caenorhabditis+Nomenclature%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">WormBook: Caenorhabditis Nomenclature.</a> WormBook. , (2018).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WormBook%3A+Maintenance+of+C.+Elegant%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">WormBook: Maintenance of C. Elegant.</a> WormBook. , (2006).</li>
</ol>

Los autores informan que no hay conflictos de intereses.

Este protocolo contiene pasos críticos que deben ejecutarse con precaución. Por ejemplo, es importante que los equipos de campo y aislamiento tengan cuidado de seleccionar el proyecto de recolección correcto en la aplicación antes de recolectar muestras del campo o aislar nematodos de las muestras en el laboratorio. En el caso de que se seleccione el proyecto de recopilación incorrecto, los registros de datos errantes se corrigen mejor en la base de datos Fulcrum utilizando las herramientas de edición de registros en línea. Este proceso puede ser tedioso para muchos registros extraviados. Sin embargo, la base de datos conserva cualquier cambio en los registros para que sea posible una auditoría completa de los registros de recopilación y aislamiento. Los otros pasos críticos en este protocolo implican el manejo de muestras del campo y los nematodos aislados de esas muestras. Para garantizar que los nematodos caenorhabditis sobrevivan a las etapas de muestreo y envío, la temperatura de las muestras debe mantenerse entre 4 °C y 25 °C. Las temperaturas superiores a 25 °C pueden causar esterilidad en C. elegans14. Asegúrese de que las muestras se transfieran de las bolsas de recolección a las placas de recolección dentro de los cinco días siempre que sea posible para minimizar la pérdida de nematodos. Después de aislar los nematodos, es fundamental que sean genotipados y criopreservados antes de que perezcan. Es difícil encontrar nematodos vivos en las placas S que tienen más de dos o tres semanas de edad porque la contaminación fúngica y bacteriana puede hacer que las placas S sean inhóspitas.
Este protocolo se puede modificar fácilmente para acomodar diferentes tipos de datos que los investigadores pueden querer recopilar mientras están en el campo. Por ejemplo, es fácil personalizar la aplicación 'Nematode field sampling' con nuevos campos de entrada de datos utilizando la GUI en línea de Fulcrum para la edición de aplicaciones. Además, el paquete de análisis de datos, easyFulcrum, puede acomodar estas ediciones al procesar los nuevos datos15. Otra modificación que los usuarios pueden encontrar atractiva es usar un método de muestreo diferente en el campo. En lugar de muestrear sustratos discretos, los investigadores pueden desear muestrear áreas más grandes que contengan múltiples tipos de sustratos. Estas muestras más grandes se procesan mejor en el laboratorio utilizando los métodos de extracción de embudo o bandeja de Baermann13. Es importante destacar que el uso de etiquetas C y S todavía se aplican a estas técnicas y, por lo tanto, son compatibles con las aplicaciones móviles.
Las principales limitaciones de este protocolo se relacionan con el tiempo de manipulación de los nematodos antes del aislamiento en el laboratorio. En primer lugar, el tiempo de retraso entre la recolección de la muestra y el aislamiento de los nematodos hace que sea imposible registrar las etapas de desarrollo de los nematodos en una muestra determinada en el momento de la recolección. En segundo lugar, la frecuencia de los machos y el cruce en la naturaleza son cuestiones evolutivas clave para la autogestión de los nematodos Caenorhabditis10. Este método no es adecuado para abordar estas preguntas porque es probable que los nematodos hayan pasado por múltiples generaciones antes del aislamiento. El aislamiento tardío significa que la evidencia directa de la frecuencia masculina en la naturaleza es imposible. Además, el retraso multigeneracional durante los pasos de genotipado significa que la evidencia genómica de cruce (heterocigosidad) se erosionará antes de que se pueda secuenciar una cepa de nematodo. Para identificar la heterocigosidad en la naturaleza, se utilizan las crías producidas por un nematodo directamente aislado de la naturaleza para la secuenciación2. Otra limitación potencial de este protocolo es que está sesgado hacia la identificación de caenorhabditis autointencional. Esto se debe a que los nematodos aislados de las especies que se autoalifican tienen una mayor probabilidad de proliferar que los cruzados obligados, que solo proliferarán si se aísla una hembra fertilizada.
Este método de recolección se basa en los protocolos de recolección existentes13,14. El mayor avance de esta técnica es el uso de tecnología móvil y software personalizado para facilitar la organización de grandes cantidades de datos ecológicos y moleculares asociados con proyectos de recolección a gran escala. Los datos ecológicos generados utilizando este protocolo de recolección se pueden utilizar para abordar preguntas pendientes para las poblaciones naturales de especies de Caenorhabditis. Por ejemplo, los datos generados con este método se han utilizado para descubrir preferencias de nicho para la especie en las islas hawaianas. Además, al secuenciar los genomas de los nematodos criopreservados, los investigadores pueden investigar cómo los patrones de variación genética se correlacionan con los datos ecológicos. Investigaciones de este tipo pueden descubrir firmas de adaptación local en poblaciones de Caenorhabditis y proporcionar información importante sobre la relevancia de la variación genética en contextos naturales8. Para obtener una comprensión funcional de muchos genes en los nematodos caenorhabditis, es probable que se requieran estudios ecológicos11. Incluso para C. elegans una gran fracción de genes carece de anotaciones funcionales, a pesar de ser el primer animal multicelular en ser secuenciado y uno de los animales más estudiados en la Tierra. Este protocolo de recolección fue desarrollado para ayudar a abordar esta brecha de conocimiento al facilitar la recolección de nematodos silvestres de Caenorhabditis y el estudio de su ecología y diversidad genética natural.

Las últimas dos décadas han traído un mayor interés en la ecología de los nematodos Caenorhabditis. A partir de estos estudios, sabemos que las especies de Caenorhabditis de vida libre pueden aislarse de microhábitats efímeros tanto en regiones templadas como tropicales, donde se alimentan de floraciones microbianas asociadas con material vegetal en descomposición, a veces en simpatía1,2,3,4,5,6,7,8 . También hemos aprendido que la evolución convergente de la autofertilización ha ocurrido en el género tres veces, y el auto-envenenamiento es el modo dominante de reproducción para C. briggsae, C. elegans y C. tropicalis9,10. Entre estos selfers, C. elegans es uno de los animales más ampliamente estudiados en la Tierra y ha sido utilizado por los investigadores para hacer avances críticos en biología. Es importante destacar que las otras especies de Caenorhabditis comparten muchas de las ventajas experimentales de C. elegans y están avanzando rápidamente en los estudios comparativos en el género. Sin embargo, la naturaleza críptica de estos nematodos en la naturaleza dificulta el estudio de su ecología y diversidad natural, lo cual es fundamental para comprender las funciones biológicas de sus genes y las formas en que la evolución ha dado forma a la diversidad genética entre las especies10,11.
El mayor desafío para estudiar la ecología de los nematodos Caenorhabditis en la naturaleza es su pequeño tamaño; los nematodos adultos son a menudo de 1 mm de longitud o menos. Este desafío requiere que los investigadores tomen muestras de sustratos de la naturaleza e intenten separar los nematodos de interés de los sustratos en el laboratorio sin la capacidad de observar animales en la naturaleza. Debido a que incluso a los expertos capacitados les resulta difícil discriminar a los nematodos caenorhabditis de otros nematodos de vida libre bajo el microscopio, los nematodos generalmente se eliminan del sustrato, se aíslan y se dejan proliferar antes de que se identifiquen por identidad de secuencia utilizando códigos de barras moleculares establecidos3,12,13,14 . El tiempo y el esfuerzo necesarios para procesar cada nematodo de esta manera presentan un desafío organizativo, ya que los investigadores deben poder rastrear la identidad de cada nematodo aislado en el laboratorio hasta el sustrato exacto y los datos ecológicos asociados muestreados en el campo. Aquí, describimos un proceso paso a paso para recopilar e identificar eficientemente los nematodos Caenorhabditis del campo y vincular fielmente estos aislamientos con sus datos espaciales y ecológicos asociados a gran escala.
Este método de recolección aumenta la escala y la precisión de los estudios ecológicos mediante el uso de plataformas móviles de recopilación de datos, bases de datos basadas en la nube y el entorno de software R. Fulcrum es una plataforma de recopilación de datos personalizable que funciona con la mayoría de los dispositivos móviles y permite a los usuarios crear aplicaciones personalizadas para recopilar y organizar datos basados en la ubicación (https://www.fulcrumapp.com). Este protocolo proporciona instrucciones detalladas sobre cómo utilizar aplicaciones personalizadas de recopilación de datos para organizar datos ecológicos espacialmente explícitos del campo y vincular con precisión esos datos con la identidad de los nematodos aislados en el laboratorio. El protocolo también explica cómo identificar eficientemente los nematodos Caenorhabditis que se autogestionan utilizando códigos de barras moleculares establecidos. Los datos de estos métodos se pueden procesar de manera simple y reproducible con el paquete de software R que lo acompaña easyFulcrum15 para explorar la ecología y la diversidad genética de las poblaciones naturales de Caenorhabditis.

<table><tbody><tr><td>Etiquetas adhesivas</td><td>Avery</td><td>61533</td><td>Impresión de las etiquetas C y S</td></tr><tr><td>Agarosa</td><td>Thomas Scientific</td><td>C748D75</td><td>preparación de gel de agarosa</td></tr><tr><td>Mochila</td><td></td><td></td><td>Una mochila para que cada miembro del equipo guarde el equipo, las muestras, la comida y el agua para el día.</td></tr><tr><td>Cajas de cartón</td><td>Fisher Scientific</td><td>AS261</td><td>Almacenamiento de placas S</td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Neamtode lysis, SSU e ITS2 PCR</td></tr><tr><td>Bolsas de recogida</td><td>Zip-lock</td><td>NA</td><td>Recogida de sustratos Medidor digital</td></tr> de <tr><td>temperatura/humedad</td><td>Preciva</td><td>HT-86</td><td>Medición de la temperatura y la humedad ambiente</td></tr><tr><td>Osciloscopio de disección</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Aislamiento de nematodos, lisis</td></tr><tr><td>Reservorios desechables</td><td>USA Scientific</td><td>1306-1010</td><td>Mezcla maestra de PCR alícuota y carga de colorante</td></tr><tr><td>Escalera de ADN, 1 KB más</td><td>Thermo Scientific</td><td>SM0243</td><td>Visualización de productos de PCR SSU e ITS2</td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Thomas Scientific</td><td>CB4430-2 Componente de</td><td>mezcla maestra de PCR</td></tr><tr><td>easyFulcrum R paquete</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Un paquete R para el procesamiento de datos de recogida http://andersenlab.org/easyfulcrum/articles/easyFulcrum.html</td></tr><tr><td>solución de EDTA (0,5 M, pH 8,0)</td><td>NA</td>, <td>NA</td><td>Consulte la tabla complementaria 3 para la receta</td></tr><tr><td>Etanol (95%)</td><td>NA</td><td></td><td>NA Siembra de muestras, esterilización con cuchara</td></tr><tr><td>Solución de bromuro de etidio (10 mg/mL)</td><td>VWR</td><td>97064-602</td><td>Visualización de productos</td></tr> <tr><td>SSU e ITS2 PCRCargador de batería externo para dispositivo móvil</td><td>NA</td><td></td><td>NA Cargador de batería externo y cable de carga para iPhone o Android</td></tr><tr><td>Matraz (500 mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB501500</td><td>preparación de gel de agarosa</td></tr><tr><td>Alimentos</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Empaquetar en consecuencia</td></tr><tr><td>Aparato de electroforesis en gel</td><td>Thermo Scientific</td><td>B2</td><td>Visualización de productos SSU e ITS2 PCR</td></tr><tr><td>Gel fuente de alimentación para electroforesis</td><td>BioRad</td><td>1645050</td><td>Visualización de productos SSU e ITS2 PCR</td></tr><tr><td>Colorante de carga de gel, 6x</td><td>NEB</td><td>B7022S</td><td>Visualización de productos SSU e ITS2 PCR</td></tr><tr><td>Juego de cebadores ITS2</td><td>NA</td><td>NA</td><td>oECA1687 = imprimación directa CTGCGTTACTTACCACGAATTG CARAC, oECA202 = imprimación inversa GCGGTATTTGCTACTACCAYYAM GATCTGC</td></tr><tr><td>Imprimación secuencial ITS2</td><td>NA</td><td>NA NA</td><td>oECA306 = cebador directo CACTTTCAAGCAACCCGAC</td></tr><tr><td>Tampón de lisis</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Lisis de nematodos, consulte el protocolo para la receta</td></tr><tr><td>Preparación</td> del <td>gel de agarosa</td><td>NA</td><td>NA</td></tr><tr><td>Microondas Dispositivo móvil</td><td>NA</td><td>NA Teléfono</td><td>cargado en modo avión. Las posiciones GPS de la aplicación Fulcrum son inexactas en comparación con las posiciones GPS extraídas de las imágenes. Esta configuración garantiza que use menos energía y obtenga mediciones GPS más precisas.</td></tr><tr><td>Placas NGMA,</td> placas <td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713</td> C de 10 cm<td>, consulte Andersen et al. 2014 para el protocolo de placas NGMA.</td></tr><tr><td>Placas NGMA,</td> placas <td>S Greiner Bio-One</td><td>5662-7102Q</td> de 3,5 cm<td>, consulte Andersen et al. 2014 para el protocolo de placas NGMA.</td></tr><tr><td>Termómetro infrarrojo sin contacto</td><td>Etekcity</td><td>B00837ZGRY</td><td>Medición de la temperatura del sustrato</td></tr><tr><td>Toallas de papel</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Toallas de papel para absorber el exceso de humedad en una muestra embolsada.</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-374-12</td><td>Sellado de placas</td></tr><tr><td>Lámina adhesiva para PCR</td><td>VWR</td><td>60941-126</td><td>Lámina adhesiva para PCR</td></tr><tr><td>Tampón para PCR (10x)</td><td>Thomas Scientific</td><td>CB3702-7 Placa de</td> PCR <td>de componente de mezcla maestra</td></tr><tr><td>de PCR (96 pocillos)</td><td>Thomas Scientific</td><td>1149K04</td><td>SSU e ITS2 PCRs</td></tr><tr><td>Lápiz</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Cucharas de plástico</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Enchapado de muestras</td></tr><tr><td>Selección de platino</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Aislamiento de nematodos, lisis</td></tr><tr><td>Bolsas de recolección con cierre hermético preetiquetadas</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Paquetes de bolsas de plástico con cierre hermético preetiquetadas con códigos de barras con etiqueta C. Cada paquete debe contener 25 bolsas con código de barras envueltas con una banda elástica.</td></tr><tr><td>Proteinasa K</td><td>Sigma</td><td>3115879001</td><td>Lisis de nematodos, añadida al tampón de lisis justo antes de su uso</td></tr><tr><td>Software R NA</td><td></td><td>NA</td><td>Software R: Un lenguaje y un entorno para la computación estadística https://www.R-project.org/</td></tr> <tr><td>Bolsa de nevera blanda y bolsa de hielo</td><td>NA</td><td></td><td>NA Colección de neveras y paquetes de nevera para mantener las muestras frías cuando la temperatura ambiente es superior a 25 °C.</td></tr><tr><td>Baterías de repuesto</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Baterías de repuesto para equipos de muestreo</td></tr><tr><td>Juego de cebadores SSU</td><td>NA</td><td>NA oECA1271</td><td>= cebador directo TACAATGGAAGGCAGCAGGC, oECA1272 = cebador inverso CCTCTGACTTTCGTTCTTGATTAA</td></tr><tr><td>Tapas de tubo de tiras de tiras (12 pocillos)</td><td>Thomas Scientific</td><td>1159V29</td><td>Lisis de nematodos</td></tr><tr><td>Tubos de tiras (12 pocillos)</td><td>Thomas Scientific</td><td>1159V31</td><td>Lisis de nematodos</td></tr><tr><td>Tampón TAE (1x)</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Visualización de productos PCR SSU e ITS2. Consulte la tabla complementaria 3 para obtener la receta</td></tr><tr><td>de la polimerasa Taq</td><td>Thomas Scientific</td><td>C775Y45</td><td>PCR componente de mezcla maestra</td></tr><tr><td>Termociclador</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Neamtode lysis, SSU e ITS2 PCR</td></tr><tr><td>Water</td><td>NA</td><td></td><td>NA Pack en consecuencia</td></tr></tbody></table>

un enfoque altamente escalable para realizar estudios ecológicos de los nematodos de caenorhabditis selfing

A Highly Scalable Approach to Perform Ecological Surveys of Selfing Caenorhabditis Nematodes

Caenorhabditis elegans es uno de los principales organismos modelo en biología, pero solo recientemente los investigadores se han centrado en su ecología natural. La relativa escasez de información sobre C. elegans en su contexto natural proviene de los desafíos involucrados en la identificación del pequeño nematodo en la naturaleza. A pesar de estos desafíos, un enfoque cada vez mayor en la ecología de C. elegans ha causado una gran cantidad de nueva información sobre su vida fuera del laboratorio. La búsqueda intensificada de C. elegans en la naturaleza ha contribuido al descubrimiento de muchas nuevas especies de Caenorhabditis y reveló que los nematodos congenéricos cohabitan con frecuencia en la naturaleza, donde se alimentan de floraciones microbianas asociadas con material vegetal en descomposición. La identificación de nuevas especies también ha revelado que el sistema de apareamiento androdioico de machos y hermafroditas autofertilizantes ha evolucionado tres veces de forma independiente dentro de Caenorhabditis. Las otras dos especies de selfing, C. briggsae y C. tropicalis, comparten las ventajas experimentales de C. elegans y han permitido estudios comparativos sobre la base mecanicista de rasgos importantes, incluida la autofertilización. A pesar de estos avances, queda mucho por aprender sobre la ecología y la diversidad natural de estas importantes especies. Por ejemplo, todavía carecemos de información funcional para muchos de sus genes, que solo podría lograrse a través de una comprensión de su ecología natural. Para facilitar la investigación ecológica de los nematodos Caenorhabditis , desarrollamos un método altamente escalable para recolectar nematodos de la naturaleza. Nuestro método hace uso de plataformas móviles de recopilación de datos, bases de datos basadas en la nube y el entorno de software R para mejorar la capacidad de los investigadores para recolectar nematodos de la naturaleza, registrar datos ecológicos asociados e identificar nematodos silvestres utilizando códigos de barras moleculares.

Este protocolo se ha utilizado para recolectar nematodos Caenorhabditis de múltiples ubicaciones, incluyendo Hawai y California. La tasa de éxito del aislamiento para los nematodos caenorhabditis varía según la ubicación de recolección, el clima, la experiencia de muestreo y los tipos de sustrato muestreados. El protocolo se ha utilizado para muestrear ampliamente las islas hawaianas, donde se han llevado a cabo nueve proyectos de recolección durante varios años y temporadas. Las tasas de éxito de aislamiento para las especies de Caenorhabditis son casi idénticas para C. briggsae (162 de 4.506 muestras, 3,6%) y C. elegans (163 de 4.506 muestras, 3,6%), y mucho más bajas para C. tropicalis (26 de 4.506 muestras, 0,58%)8. Cada una de las especies de selfing se enriquece con sustratos de frutas y flores en descomposición en relación con las otras categorías de sustratos. Muestree sustratos de frutas y flores podridas si el investigador está tratando de maximizar la tasa de éxito en lugar de caracterizar las preferencias de sustrato. Sin embargo, la tasa de éxito varía con la calidad del sustrato seleccionado. Por ejemplo, entre los sustratos de frutas y flores, aquellos sustratos que son demasiado secos, húmedos o frescos probablemente no producirán nematodos Caenorhabditis .
La escalabilidad de este protocolo de recolección es evidente por el número de colecciones que un solo par de investigadores puede recolectar de la naturaleza. Por ejemplo, en octubre de 2018, un par de investigadores que utilizaron este protocolo de recolección pudieron recolectar un total de más de 1,000 muestras en 7 días de múltiples ubicaciones en dos islas hawaianas. Este equipo de campo envió las muestras durante la noche al laboratorio, donde un equipo de ocho investigadores aisló más de 2.000 nematodos de las muestras a medida que llegaban. Una ventaja clave de este protocolo es que minimiza el costo asociado con el muestreo en ubicaciones remotas al reducir el equipo y el personal requerido en el campo. Usando este protocolo, un pequeño equipo de campo puede centrarse en el muestreo, mientras que el equipo de aislamiento puede procesar las muestras en su institución de origen utilizando equipos frágiles y pesados como microscopios de disección y placas de agar para aislar nematodos. Además, la implementación de la aplicación móvil de recopilación de datos permite que todos los datos de campo asociados con las muestras se vinculen directamente a la etiqueta C, lo que permite al equipo de aislamiento trabajar de forma independiente del equipo de campo mientras procesa las muestras.
Los investigadores que utilizan este protocolo de recolección deben considerar el esfuerzo que se requiere para aislar los nematodos antes de un proyecto de recolección. Los pasos de aislamiento e identificación limitan la velocidad, y un pequeño equipo de recolección puede abrumar rápidamente a los aisladores con muestras. Además, el espacio de laboratorio requerido para procesar muchas colecciones puede interferir con la investigación en curso (Figura 3). Además, algunos nematodos aislados requieren un esfuerzo adicional para genotipar. Por ejemplo, aproximadamente el 2% de los aislados no logran amplificarse con el conjunto de cebadores de PCR SSU después del primer intento de lisis y deben volver a lisarse para garantizar que el material de lisis sea adecuado para la amplificación con el conjunto de cebadores ITS2 (Figura 8). Además, aproximadamente el 3% de los aislados no producen secuencias de calidad después de una ronda inicial de secuenciación de Sanger. Para estos aislamientos, a menudo se requiere otra ronda de lisis, ITS2 PCR y secuenciación de Sanger, lo que puede aumentar el tiempo de entrega para el equipo de aislamiento. Es importante destacar que la identidad de secuencia por sí sola no es evidencia suficiente para justificar una nueva especie de Caenorhabditis (Figura 7). Para justificar adecuadamente la cría de un aislado como una nueva especie de Caenorhabditis, se debe hacer un esfuerzo adicional para realizar experimentos de apareamiento y establecer un espécimen mecanografiado13. También se prefiere una descripción morfológica formal del espécimen mecanografiado, pero no se requiere3. En conjunto, estas consideraciones sugieren que los investigadores que adopten este protocolo de recolección se beneficiarán de las pruebas de ensayo de los pasos de aislamiento e identificación para garantizar que los recursos se asignen adecuadamente antes de que comience un proyecto de recolección. Es importante destacar que incluso los pequeños proyectos de recolección pueden beneficiarse de este protocolo porque el proceso es altamente reproducible y los datos se pueden auditar fácilmente con fines de control de calidad en todos los grupos de laboratorio.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63486/63486fig01.jpg"> Figura 1: Ejemplos de sustrato. (A) Una fruta podrida ideal se muestra en el centro de la imagen (1), la fruta es casi irreconocible. Se muestra menos fruta podrida cerca; evitar tomar muestras de frutas recién caídas (2). (B) Una flor idealmente descompuesta se muestra en la parte superior (3). Evite probar flores recién caídas (4). (C) La hojarasca oscura debajo de la capa superior de hojas secas es ideal cuando se toma el muestreo para autogestionar nematodos Caenorhabditis (5). Evite tomar muestras de hojarasca seca (6). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63486/63486fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63486/63486fig02.jpg"> Figura 2: La aplicación móvil Nematode Field Sampling. (A) La pantalla inicial después de abrir la aplicación Nematode Field Sampling en un dispositivo Apple en Fulcrum. La flecha roja en la parte inferior derecha apunta al botón + utilizado para crear un nuevo registro de colección. (B) Un ejemplo de un nuevo registro de colección que se muestra en un dispositivo Apple. La flecha roja apunta al campo 'Proyecto' en la parte superior de la pantalla de registro de colección. Asegúrese de seleccionar el proyecto correcto al muestrear en el campo. El campo de proyecto será de forma predeterminada el último proyecto utilizado al crear registros de recopilación posteriores. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63486/63486fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63486/63486fig03.jpg"> Figura 3: Bolsas de recolección y placas de recolección organizadas antes de emplatar muestras. Esta figura muestra las muestras en bolsas de recolección con etiqueta C a la izquierda. Cada bolsa de colección tiene una placa de 10 cm con etiqueta C a juego en la parte superior. A la derecha hay placas de recolección de 10 cm que contienen material de muestra después de que se transfirió de las bolsas de recolección. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63486/63486fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63486/63486fig04.jpg"> Figura 4: Una placa de recolección (placa C) con una muestra transferida adecuadamente. Una placa C de 10 cm con fruta en descomposición colocada en el borde del césped bacteriano. La etiqueta C está unida a la tapa de la placa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63486/63486fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63486/63486fig05.jpg"> Figura 5: La aplicación móvil de aislamiento de nematodos. (A) La pantalla de selección de aplicaciones en la aplicación móvil Fulcrum. La flecha roja apunta a la aplicación Nematode Isolation . (B) La pantalla inicial después de abrir la aplicación Nematode Isolation en un dispositivo Apple en Fulcrum. La flecha roja en la parte inferior derecha apunta al botón + utilizado para crear un nuevo registro de aislamiento. (C) Un ejemplo de un nuevo registro de aislamiento que se muestra en un dispositivo Apple. La flecha roja apunta al campo 'Proyecto' en la parte superior de la pantalla de registro de aislamiento. Asegúrese de seleccionar el proyecto correcto al aislar. El campo de proyecto será de forma predeterminada el último proyecto utilizado al crear registros de aislamiento posteriores. (D) Después de tocar el campo Seleccionar debajo de la etiqueta C, los usuarios tocarán el botón de búsqueda (flecha roja) para encontrar la etiqueta C de la que están aislando los nematodos. (E) Después de seleccionar la etiqueta C, los usuarios fotografiarán la placa C utilizando la cámara del dispositivo. (F) Los usuarios luego ingresan si hay nematodos en la placa C o no. Las etiquetas S se agregan al registro de aislamiento si hay nematodos que se deben aislar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63486/63486fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63486/63486fig06.jpg"> Figura 6: Página de resultados de NCBI BLAST. (1) El menú desplegable utilizado para ver los resultados de BLAST para todas las secuencias. (2) La descripción de la secuencia actual seleccionada en el menú desplegable. En este caso se muestran los resultados para la etiqueta S S-05554. (3) Se muestra el golpe BLAST superior para S-05554. El texto púrpura indica que se ha hecho clic en el enlace para visualizar esta alineación. Asegúrese de inspeccionar las alineaciones a ojo para identificar posibles nuevas especies de Caenorhabditis , consulte el paso 9.8 anterior. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63486/63486fig06large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63486/63486fig07.jpg"> Figura 7: Ejemplos de visualización de alineación de NCBI BLAST. (A) Un ejemplo de la secuencia de consulta ITS2 de un aislado alineada con una secuencia de sujeto de C. kamaaina . (1) La identidad porcentual de la alineación (89%), que es baja para un golpe BLAST superior. (2) Un desajuste entre la consulta y la secuencia de asunto (G a A). (3) Una brecha de cuatro pares de bases en la secuencia de sujetos hecha por el algoritmo de alineación; los huecos en la consulta o el asunto indican una alineación deficiente. (4) Una región generalizada en el centro de la alineación con muchos desajustes y brechas. Una región como esta sugiere que la secuencia de consulta podría provenir de una nueva especie de Caenorhabditis . Se muestra un ejemplo de alineación real de una nueva especie, C. oiwi, que se descubrió en 2017. (B) Un ejemplo de una buena alineación entre la secuencia de consulta ITS2 de un aislado y una secuencia de sujetos. (5) La identidad porcentual de la alineación (99%), lo que generalmente significa que la secuencia de consulta proviene de un aislado de la misma especie que el sujeto. (6) Una región central de la alineación con identidad perfecta. Una región como esta sugiere que el aislado de consulta es probablemente la misma especie que el sujeto. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63486/63486fig07large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63486/63486fig08.jpg"> Figura 8: Productos de PCR SSU e ITS2. El gel superior muestra los productos de PCR generados con el juego de imprimación SSU para 12 muestras representativas. Una escalera de ADN se incluye a la izquierda como referencia. Los productos SSU PCR para nematodos Caenorhabditis tienen aproximadamente 500 pb de longitud. Las muestras 2-12 se amplificaron con el conjunto de cebadores SSU, pero la muestra uno no lo hizo. La ausencia de un amplicóN SSU de 500 pb para la muestra uno sugiere que el material de lisis era de mala calidad y la muestra debe volver a lisarse. El gel inferior muestra los productos de PCR generados con el conjunto de imprimación ITS2 para las mismas 12 muestras que se muestran en el gel superior. La escalera y las muestras están en la misma orientación para ambos geles. Seis de las 12 muestras no se amplificaron con el conjunto de cebadores ITS2. Las muestras con bandas SSU e ITS2 son secuenciadas por Sanger e identificadas por similitud de secuencia utilizando el algoritmo NCBI BLAST. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63486/63486fig08large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Expediente suplementario 1: Etiquetas C. Un archivo PDF que contiene 2500 etiquetas C únicas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63486/C-labels.pdf" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Expediente suplementario 2: Etiquetas S. Un archivo PDF que contiene 5000 etiquetas S únicas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63486/S-labels.pdf" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Tabla suplementaria 1: Materiales de campo. Una lista de embalaje de los materiales utilizados en el campo para tomar muestras de nematodos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63486/Supplemental_Table_1.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta tabla.</a>
Tabla suplementaria 2: Recetas de PCR y condiciones del termociclador. Tabla de recetas de PCR y condiciones del termociclador para las PCR ITS2 y SSU. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63486/Supplemental_Table_2.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta Tabla.</a>
Tabla suplementaria 3: Recetas tampón de electroforesis. Una receta para la solución de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) de 0,5 M pH 8,0 y la solución tampón TRIS-acetato-EDTA (TAE). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63486/Supplemental_Table_3.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta tabla.</a>

Este protocolo se puede utilizar para realizar estudios ecológicos a gran escala de los nematodos Caenorhabditis . La principal ventaja de este método es la organización y el análisis eficientes de los datos ecológicos y moleculares asociados con los nematodos recogidos de la naturaleza.

Un enfoque altamente escalable para realizar estudios ecológicos de los nematodos de Caenorhabditis Selfing

Caenorhabditis elegans is one of the major model organisms in biology, but only recently have researchers focused on its natural ecology. The relative ...

Este protocolo se puede utilizar para agilizar el aislamiento y la identificación de los nematodos Caenorhabditis de la naturaleza y registrar datos ecológicos y ambientales importantes asociados con el entorno natural de los nematodos. Las principales ventajas de esta técnica son su escalabilidad y precisión, que son posibles gracias al aprovechar las plataformas de recopilación de datos móviles, las bases de datos basadas en la nube y las funciones estandarizadas de procesamiento de datos. Para comenzar, identifique una ubicación para inspeccionar los nematodos Caenorhabditis.Para crear un proyecto Fulcrum, cree una cuenta con Fulcrum en línea utilizando un acuerdo educativo sin costo y agregue la aplicación de muestreo de campo de nematodos. A continuación, agregue la aplicación de aislamiento de nematodos. Imprima un conjunto de etiquetas de código QR como etiquetas C para rastrear las colecciones y etiquetas S para rastrear los aislamientos de nematodos.Coloque las etiquetas C en las bolsas de plástico Ziploc para empacar. Mantenga el conjunto de etiquetas S para su uso en el laboratorio. Seleccione el muestreo de campo de nematodos en el menú desplegable de la aplicación móvil Fulcrum y presione más para iniciar un nuevo registro en el proyecto.Tome una foto del sustrato. Toque el campo C-Label y elija escanear. Escanee el código de barras en la bolsa de recolección con la cámara del dispositivo móvil y, a continuación, toque Listo.Toque el campo de sustrato y seleccione un tipo de sustrato. Mida la temperatura superficial del sustrato utilizando el termómetro sin contacto y registre el valor en el campo de temperatura del sustrato. También mida y registre la temperatura ambiente y la humedad.Guarde y grabe en Fulcrum tocando guardar en la parte superior izquierda de la pantalla. Recoge una cucharada del sustrato sin palos u otras piezas duras invirtiendo la bolsa de recogida como guante para recoger el sustrato, luego sella la bolsa. Para cada bolsa Ziploc, anote la etiqueta C en la bolsa y coloque una etiqueta C a juego en la tapa de una placa de 10 centímetros manchada con bacterias OP50.Transfiera una cucharada de muestra de cada bolsa de recolección a las placas C con una cuchara de plástico limpia. En la aplicación Fulcrum, elija aislamiento de nematodos en el menú de la aplicación. A continuación, cree un nuevo registro de aislamiento tocando el icono más en la parte inferior derecha.Toque el botón de selección para encontrar la etiqueta C asociada con una muestra. Toque el icono de búsqueda. Luego toque el ícono de escaneo para escanear el código QR de C-Label.Busque nematodos en la placa C con un microscopio de disección. Toque los gusanos en el campo de muestra para registrar la presencia de nematodos en la muestra. Si no hay nematodos presentes, parafilme la placa C y deséchela en un contenedor de riesgo biológico.Si hay nematodos presentes, aísle hasta cinco nematodos de la placa C y transfiera cada uno a su propia placa S. A continuación, toque el campo placas con etiqueta S para ingresar la placa S utilizada para este aislamiento. Toca el más en la parte inferior derecha.Toque S-Label y luego haga clic en escanear para abrir la cámara del dispositivo, luego escanee el código QR S-Label en la placa S. Toque el botón de guardar en la parte superior derecha una vez que el registro de aislamiento tenga toda la información agregada correctamente, luego parafilme las placas S con nematodos aislados y déjelos a un lado en un área designada para sostener placas S con nematodos. Inicie sesión en el sitio web de Fulcrum y seleccione la aplicación de aislamiento de nematodos.Haga clic en exportador para descargar un archivo zip que contiene el aislamiento de nematodos s_labeled_plates. archivo csv. Navega a la plantilla de genotipado aislado salvaje de Google Sheet y copia la hoja de cálculo de Google.Coloque las etiquetas S copiadas del aislamiento de nematodos s_labeled_plates. csv en la hoja de genotipado. Compruebe si hay animales que proliferan en las placas S 48 horas después del aislamiento.Si una placa S tiene animales en proliferación, ingrese uno en la columna de proliferación 48 en la hoja de genotipado, luego mueva la placa S a una caja etiquetada como caja de proliferación de 48 horas uno. Verifique las placas S que no proliferaron a las 48 horas posteriores al aislamiento nuevamente a las 168 horas posteriores al aislamiento. Si una placa S está proliferando ahora, ingrese una en la columna de proliferación 168 en la hoja de genotipado y luego mueva la placa S a una caja etiquetada como caja de proliferación de 168 horas uno.Filtra el genotipo en Hoja de cálculo de Google para incluir solo las etiquetas S en un cuadro de proliferación que se va a lisar y, a continuación, selecciona las columnas etiqueta S a través de los nodos de lisis. Imprima una hoja de cálculo de lisis para cada caja de proliferación que se va a lisar. Prepare 12 tubos de tira de pozo para que las muestras se lisen.Destapar un tubo de tira y añadir ocho microlitros de tampón de lisis a cada tapón con un pipete de repetición. Elija de tres a cinco animales de las placas de origen en las posiciones de la tapa indicadas en la hoja de trabajo de lisis. Repita hasta ocho tubos de tira y coloque los tubos de tira en el congelador de menos 80 grados centígrados.Retire los juegos de tubos de tira y ejecute el programa de lisis en el termociclador. Luego guarde los lisados a menos 80 grados centígrados durante un máximo de una semana. Retire los tubos de la tira del congelador de menos 80 grados centígrados y descongele el material de lisis en hielo.Mientras el material de lisis se descongela, prepare mezclas maestras ITS2 y SSU en tubos separados sobre hielo. Agregue dos microlitros de lisado al pozo apropiado en la placa de PCR con una pipeta multicanal de bajo volumen. Ejecute las PCR con el programa de termociclador apropiado y registre qué S-Labels producen productos ITS2 o SSU PCR en la hoja de genotipado.Para cada muestra que sea ITS2 positiva, utilice el producto ITS2 PCR restante para la secuenciación de Sanger y obtenga los archivos de salida seq para cada S-Label de la plataforma de secuenciación. Navegue hasta el sitio web de NBCI BLAST en un navegador web para comenzar la búsqueda de BLAST. Para las secuencias de placa S que BLAST a una especie de Caenorhabditis, ingrese el género completo y el nombre de la especie del golpe BLAST superior en la columna de identificación de especies.Asigne un nombre a las cepas con nombres únicos, siguiendo las convenciones de nomenclatura de Caenorhabditis e introduzca los nombres de las cepas en la columna de nombre de cepa. Para procesar los datos, navegue hasta el sitio web de Fulcrum y exporte los datos sin procesar del proyecto desde la base de datos de Fulcrum. Abra un nuevo script de R y siga las instrucciones de la viñeta easyfulcrum para procesar los datos de recopilación.En NBCI BLAST, los resultados de S-Label S-05554 muestran que el mayor éxito es Caenorhabditis briggsae. Además, algunos nematodos aislados requieren un esfuerzo adicional para genotipar. Por ejemplo, aproximadamente el 2% de los aislados no se amplifican con el conjunto de cebadores de PCR SSU después del primer intento de lisis y se debe confiar en que el material de lisis es adecuado para la amplificación con el conjunto de imprimación ITS2.Después de este procedimiento, los investigadores pueden explorar los datos ecológicos y ambientales asociados con los aislados de nematodos silvestres para identificar ubicaciones y características de sustrato que tienen más probabilidades de albergar especies específicas de nematodos.

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