Aislamiento y caracterización de las células inmunes de plexos coroideos de ratón microdisecados

Este protocolo puede ser útil para abordar preguntas sobre el papel de los plexos coroideos y las células inmunes periféricas en la regulación del cerebro en diversos contextos en modelos de ratón. Este protocolo permite un análisis cuantitativo y cualitativo en profundidad de las poblaciones únicas de células inmunes en los plexos coroideos de ratones. La disección de los plexos coroideos puede ser difícil al principio debido a su pequeño tamaño y color transparente.

Recomendamos practicar primero en animales no perfundidos. Para empezar, coloca el cerebro diseccionado de un C57 negro de seis ratones dorsales hacia arriba en una placa de Petri y coloca el plato debajo de los objetivos de los bucles binoculares. Mientras mantiene el cerebro en su lugar usando fórceps, inserte los dos extremos de otro par de fórceps hacia abajo a través de la línea media entre los hemisferios.

Usando los fórceps, tire de la corteza con el calloso y el hipocampo lejos del tabique, exponiendo el ventrículo lateral y una parte del tercer ventrículo. Identifique el plexo coroideo lateral como un velo largo que recubre el ventrículo lateral y se quema en ambos extremos. Luego, usando dos extremos de fórceps delgados, recoja el plexo coroideo lateral.

Tenga cuidado de recoger la parte posterior triangular oculta por el pliegue posterior del hipocampo. A continuación, tire de la corteza con el cuerpo calloso y el hipocampo del hemisferio contralateral lejos del tabique para exponer todo el tercer ventrículo y el ventrículo lateral opuesto. Usando fórceps finos, recoja el tercer plexo coroideo identificado como una estructura corta con un aspecto de superficie granular.

Luego recoja el otro plexo coroideo lateral. A continuación, inserte los dos extremos de los fórceps hacia abajo entre el cerebelo y el mesencéfalo y separe el cerebelo de la protuberancia y la médula para exponer el cuarto ventrículo. Luego identifique el cuarto plexo coroideo como una estructura globular larga con un aspecto superficial granular que recubre el cuarto ventrículo desde el extremo lateral derecho hasta el extremo izquierdo entre el cerebelo y la médula.

Usando fórceps finos, recoja el cuarto plexo coroideo. Después de incubar todos los plexos coroideos recolectados con colagenasa IV, pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo alrededor de 10 veces para finalizar la disociación. Luego llene el tubo a 1.5 mililitros con tampón MACS para detener la actividad de la colagenasa IV.

A continuación, centrifugue las células y deseche el sobrenadante antes de lavar las células con 1,5 mililitros de tampón MACS. Después de agregar las perlas de compensación apropiadas y las soluciones de anticuerpos, incube las muestras en hielo durante 30 a 45 minutos, protegiéndolas de la exposición a la luz. A continuación, llene los tubos con 1,5 mililitros de tampón MACS y centrífugue las células y las perlas de compensación.

Después de resuspender las células y las perlas de compensación en 500 microlitros de tampón MACS, filtre las células a través de un colador de 70 micras. Después de encender el citómetro de flujo y el software, seleccione el área de dispersión hacia adelante frente al área de dispersión lateral y la puerta para las células según el tamaño. A continuación, cree una puerta hija para celdas individuales con área de dispersión hacia adelante frente a altura de dispersión hacia adelante.

A continuación, cree una puerta hija para células vivas con DAPI versus área de dispersión hacia adelante para excluir las celdas positivas de DAPI. Luego cree una puerta hija para las células inmunes CD45 positivas con CD45 versus área de dispersión hacia adelante. Ahora, cree una puerta hija a partir de las células CD45 positivas y seleccione F480 versus CD11b para identificar las poblaciones CD11b positivas F480 positivas y CD11b positivas F480.

A continuación, cree una puerta hija para las células F480 positivas CD11b y seleccione CX3CR1 versus IA-IE para identificar tanto los macrófagos asociados al borde IA-IE positivos CX3CR1 positivos como los macrófagos IA-IE negativos positivos CX3CR1. A continuación, cree una puerta hija para los macrófagos CD11b positivos F480 positivos CX3CR1 positivos IA-IE negativos y seleccione F480 versus CD11b para identificar tanto los macrófagos del epiplexo de Kolmer CD11b altos F480 intermedios F480 altos F480 intermedios CX3CR1 positivos IA-IE positivos IA-IE negativos. Luego, de la población CD11b positiva F480 negativa, puerta para Ly6C versus IA-IE.

Seleccionar tanto la población Ly6C positiva IA-IE como las células Ly6C positivas IA-IE negativas que corresponden principalmente a monocitos o neutrófilos. Finalmente, cree una puerta hija para CD11b positivo F480 negativo IA-IE positivo Ly6C población negativa y seleccione CD11b versus CX3CR1. A continuación, identifique las poblaciones CD11b alta CX3CR1 baja y CD11b positiva CX3CR1 negativa.

Para la activación de células T, después de excluir las células positivas DAPI como se describió anteriormente, cree una puerta hija para las células inmunes CD45 positivas con CD45 versus FSC-A, luego cree una puerta hija a partir de las células CD45 positivas y seleccione TCR beta versus CD11b. Excluya las células mieloides CD11b positivas y seleccione la población de células T CD11b positivas cd11b negativas. Finalmente, cree una puerta hija para la población CD11b negativa beta positiva de TCR y seleccione CD4 versus CD8a.

Identificar tanto las células T CD8 negativas como las CD4 positivas y las células T CD4 negativas CD8 positivas. Los análisis de citometría de flujo demostrados aquí revelaron con éxito subconjuntos importantes de células mieloides y T y su número total relativo por ratón de una manera altamente reproducible. El análisis de citometría de flujo de las células mieloides muestra que el plexo coroideo está poblado por macrófagos CD11b positivos CX3CR1 positivos F480 asociados al borde alto, que representan el 80% de las células inmunes CD45 positivas en el plexo coroideo.

También se identificó la población CD11b alta F480 intermedia CX3CR1 positiva IA-IE negativa de los macrófagos epiplexus de Kolmer. Entre las células inmunes F480 positivas CD11b positivas, se caracterizaron dos poblaciones diferentes de células IA-IE positivas Ly6C negativas y probablemente corresponden a células dendríticas. La estrategia de análisis y gating de las células T destacó la presencia de la población menor de células CD45 positivas CD11b negativas TCR beta positivas.

Entre ellos, alrededor de 30-50 linfocitos T CD4 negativos CD8 positivos y CD4 negativo CD8 positivos por ratón poblaron el plexo coroideo en condiciones fisiológicas. Es importante controlar la calidad de la perfusión, ya que cualquier contaminación de la sangre puede difuminar la composición inmune del plexo coroideo. Este método puede ser seguido por la clasificación de poblaciones celulares seleccionadas para su posterior análisis, como la secuenciación de ARN a granel o unicelular.