Explorando la interacción biomolecular entre la chaperona molecular Hsp90 y su proteína quinasa cliente Cdc37 utilizando tecnología de biodetección de efecto de campo

FEB es una plataforma de detección de interacción ______ ________ sin etiquetas y rentable que ofrece mediciones rápidas y precisas. Este método ofrece validación de interacciones conocidas o desconocidas y una manera fácil de probar posibles inhibidores de las interacciones biomoleculares. La principal ventaja de FEB es su software automatizado y fácil de usar que guía al usuario durante todo el experimento con una plataforma de pipeteo abierta y manual, lo que permite a los usuarios trabajar con poca o incluso ninguna capacitación.

La tecnología FEB también ofrece aplicaciones en diversos campos de productos farmacéuticos, análisis biomolecular de moléculas pequeñas, péptidos y proteínas, validación de medicamentos al traducir fácilmente la actividad biológica in vitro en eficacia in vivo. Al ser un principiante, puede enfrentar desafíos al elegir las concentraciones de analitos correctas para optimizar el experimento y obtener un valor de KD confiable. Aconsejamos prestar atención al proceso de funcionalización del chip y al intercambio de búfer adecuado.

Comience mezclando volúmenes iguales de EDC y solución sulfo-NHS mediante el pipeteo hacia arriba y hacia abajo. Coloque el chip biosensor suministrado por la empresa en una placa de Petri de vidrio con una tapa ajustada. Se sugiere que todos los pasos de funcionalización involucrados en la activación del chip se realicen dentro de la placa de Petri.

Aplique 50 microlitros de tampón MES de un molar al chip biosensor. Incubar durante un minuto a temperatura ambiente. Luego, aspire el búfer y aplique 50 microlitros de solución EDC sulfo-NHS inmediatamente al chip del sensor.

Cubra la placa de Petri e incube durante 15 minutos a temperatura ambiente. Aspire la solución EDC sulfo-NHS del chip y aplique 50 microlitros de tampón MES de un molar. Aspire el tampón MES y enjuague el chip dos veces con 50 microlitros de 1X PBS.

Aspire el PBS del chip y agregue la molécula objetivo Hsp90. Cubra la placa de Petri de vidrio e incube durante 30 minutos a temperatura ambiente. Luego, aspire la solución que contiene la molécula objetivo y enjuague tres veces con 50 microlitros de 1X PBS.

Aspire la solución 1X PBS del chip y agregue 50 microlitros de la solución de enfriamiento. Cubra la placa de Petri de vidrio e incube durante 15 minutos a temperatura ambiente. Aspire la solución de enfriamiento de una solución del chip y agregue 50 microlitros de la solución de enfriamiento de dos.

Cubra la placa de Petri de vidrio e incube durante 15 minutos a temperatura ambiente. Después de eso, aspire la solución de enfriamiento dos del chip y enjuague el chip cinco veces usando 50 microlitros de 1X PBS dejando la última gota de PBS en el sensor. Prepare la serie de dilución de analitos para Cdc37 en el rango de concentración deseado.

Diseñe el experimento para incluir al menos ocho concentraciones diferentes de analitos para obtener una constante de disociación confiable, o valor KD, y prepare estas diferentes diluciones en el mismo tampón utilizado para la calibración y la proteína objetivo. Coloque el chip con cuidado en el instrumento. Asegúrese de que el software esté encendido y que la luz LED se vuelva verde.

A continuación, presione el módulo Ejecutar experimento en el software automatizado y elija 10 puntos con regeneración o cualquier otro protocolo deseado. Complete los detalles como el nombre del operador, el nombre del experimento, la fecha, el búfer de regeneración, el objetivo inmovilizado y el analito en solución. Presione el botón Iniciar experimento que se muestra en el software y siga las instrucciones que muestra el software automatizado.

Para realizar la calibración del instrumento, aspire la solución PBS restante del chip y aplique 50 microlitros del búfer de calibración. Pulse el botón Continuar y espere cinco minutos hasta que finalice el paso de calibración. El software muestra el punto final determinado para el paso de calibración con una alarma de advertencia para hacer un seguimiento.

A continuación, realice una asociación de analitos aspirando el tampón de calibración del chip y aplicando 50 microlitros de la concentración de analito más baja. Pulse el botón Continuar y espere cinco minutos hasta que finalice el paso de asociación. El software muestra el punto final para el paso de asociación con una alarma de advertencia para continuar.

Para realizar una disociación de analito, aspire la solución de analito del chip y aplique 50 microlitros del tampón de disociación. Pulse el botón continuar. Después de la duración del paso de disociación, el software muestra el punto final para el paso de disociación con una alarma de advertencia.

A continuación, realice la regeneración del chip aspirando la solución de disociación del chip y aplicando 50 microlitros del tampón de regeneración. Luego, presione el botón Continuar. El paso de regeneración suele tardar aproximadamente 30 segundos en finalizar.

Después de eso, el software muestra el punto final para el paso de regeneración con una alarma de advertencia para hacer un seguimiento. Finalmente, para lavar el chip, aspire la solución de regeneración del chip y aplique 50 microlitros del tampón de lavado. Aspire la solución del chip y repita esto cinco veces.

Deje la última gota del tampón de lavado en el chip. Luego, presione el botón Continuar y espere 30 segundos hasta que finalice la duración del paso de lavado en la pantalla del software. Repita los pasos para cada concentración de analito utilizada.

Los cinco pasos de la calibración, la asociación del analito, la disociación, la regeneración y el lavado cinco veces constituyen un ciclo. Pulse el botón Análisis en el software de análisis automatizado al final del experimento. Aparecerá una ventana de visualización que contiene todos los puntos experimentales.

Asegúrese de que las concentraciones de analito utilizadas para el protocolo prescrito sean correctas. Pulse el botón Ejecutar análisis para generar el valor KD automáticamente. El software genera una gráfica de ajuste de colinas trazando las concentraciones de analitos contra las respuestas I correspondientes a partir de las cuales se calcula la constante de disociación en equilibrio.

La proteína diana Hsp90 se inmovilizó al chip, y para el primer experimento, se prepararon 10 concentraciones de la proteína de analito Cdc37 que van desde 25 nanomolares hasta 5.000 nanomolares. Los archivos de datos generados a partir del experimento uno se han mostrado aquí. Los datos experimentales monitoreados en tiempo real se muestran aquí.

El eje Y corresponde a la respuesta I en las unidades biosensoras, y el eje X corresponde a los diferentes puntos de tiempo y concentraciones del analito en el experimento. La imagen gráfica que se muestra aquí representa la gráfica de ajuste de colina generada a partir del software de análisis automatizado. El eje Y corresponde a la respuesta I en las unidades biosensoras, y el eje X corresponde a las diferentes concentraciones de analitos en el experimento.

La imagen gráfica que se muestra aquí representa la gráfica de asociación generada utilizando el software de análisis estadístico. El eje Y corresponde a la respuesta I al final de la fase de asociación, y el eje X corresponde a las diferentes concentraciones del analito Cdc37. En el experimento dos, se utilizó un conjunto diferente de concentraciones que van desde 0,4 nanomolares hasta 200 nanomolares, y los archivos de datos generados se muestran aquí.

Las imágenes gráficas representan el termograma ITC de la interacción Hsp90 y Cdc37. Aquí se muestran las curvas correspondientes de evolución del calor obtenidas debido a las inyecciones consecutivas de Cdc37 en Hsp90 a 298.15 Kelvin. La potencia diferencial utilizada aquí es una función del tiempo.

Los puntos de datos integrados en esta gráfica designan el calor normalizado correspondiente frente a la relación de Mueller de Hsp90 a Cdc37. El enfoque de pipeteo abierto utilizado aquí requiere que el usuario tenga un dominio básico del pipeteo manual, asegurándose de no tocar el biosensor con la punta. La reproducibilidad del tiempo de paso depende completamente del usuario.

Una vez que el investigador caracteriza una interacción entre dos biomoléculas, podemos realizar un experimento de cribado mediante el diseño de inhibidores o moduladores potenciales dirigidos a la interacción biomolecular específica utilizando el sistema FEB. Este procedimiento se puede utilizar para identificar, verificar y cuantificar la interacción conocida y novedosa entre proteínas, así como moléculas pequeñas, incluidos medicamentos y péptidos.