Entrevista: Presentación antígeno Glicolípido por CD1d y el potencial terapéutico de la activación de las células NKT

Hola, mi nombre es Mitchell Cronenberg y estoy en el Instituto La Jolla para Alergia e Inmunología. En realidad soy el presidente y director científico, pero tengo un laboratorio de investigación muy activo y de eso es de lo que vamos a hablar, por supuesto, de una de nuestras tecnologías, los tetrámeros CD1D. La mayor parte del trabajo en mi laboratorio se centra en las células T reactivas a CD1D.

Y estas células son únicas porque reconocen glicolípidos en lugar de péptidos. Y otra rama de mi laboratorio se ocupa de un tema completamente diferente, el sistema inmunitario mucosal y su regulación. Las moléculas CD1 son moléculas presentadoras de antígenos, lo que significa que se unen a antígenos o fragmentos de proteínas u otras moléculas y los exponen para el reconocimiento por parte de los linfocitos T.

Ahora existen realmente dos tipos diferentes de moléculas presentadoras de antígenos. Hay unas que retienen o presentan péptidos, y otras que retienen lípidos y glicolípidos. Y las moléculas CD1 retienen lípidos y glicolípidos.

Esa es su función: mantener y presentar estos lípidos y glicolípidos a las células T. De hecho, existen cuatro tipos diferentes de moléculas CD1: CD1A, CD1B, CD1C y CD1D. En realidad, nos centramos en CD1D, que probablemente sea la mejor estudiada, en parte porque existen modelos de ratón. CD1D presenta glicolípidos a un tipo particular de célula T denominada célula T asesina natural, un tipo inusual de glóbulo blanco que posee características de la respuesta inmunitaria innata y adaptativa.

Los glicolípidos que se presentan pueden ser glicolípidos propios, aunque estos aún no están muy bien caracterizados en este momento, o pueden ser glicolípidos microbianos. Y los glicolípidos que sabemos que se presentan provienen de dos fuentes. Una son las bacterias llamadas FMS, que probablemente sean las bacterias más abundantes en la biosfera.

Viven en el océano, viven en las plantas, viven en el suelo. Sin embargo, no enferman a muchas personas. Supongo que estamos muy acostumbrados a vivir con estas bacterias.

Y la segunda categoría que conocemos, un tipo diferente de glicolípido denominado glicerol dial que contiene glicolípidos. Estos se encuentran en Borrelia burgdorferi, que causa la enfermedad de Lyme, y probablemente en muchos otros patógenos. Y ahora mismo estamos descubriendo qué tipos diferentes de bacterias poseen estos glicolípidos.

Entonces, tenemos lo que se denominan lípidos señal glicolíticos de SMS y lípidos diglicéridos del Borrelia, y probablemente muchos otros que son verdaderamente patógenos. Estos lípidos se cargan principalmente sobre moléculas CD1d en células dendríticas, aunque también podrían ser en linfocitos B, células ER del hígado y quizás otros tipos celulares. Estas moléculas CD1d pasan por lisosomas y endosomas, donde probablemente se unen a estos lípidos, y luego transportan el lípido hacia la superficie celular para su reconocimiento por parte de linfocitos T, incluidas las células T asesinas naturales que mencioné anteriormente.

Una de las cosas que ocurre si se expone a una bacteria que tiene glicolípidos es que las células T NK se activan muy rápidamente. Las células T convencionales, en otras palabras, las células T reactivas a péptidos, normalmente tardan tres o cuatro días en generar una respuesta inmunitaria adecuada, especialmente si no tienen experiencia previa con el antígeno.

En otras palabras, si ellos, son ingenuos. En contraste, las células T NK pueden activarse en cuestión de horas y comenzarán a producir citoquinas como el interferón gamma, importante para la eliminación bacteriana en un período de tiempo muy, muy corto. Y de esa manera, ellas presentan aspectos de la respuesta inmune innata del modelo.

Al estudiar antígenos modelo, sabemos que CD1D ingresa a los endosomas tardíos y lisosomas, compartimentos intracelulares muy ácidos donde los antígenos glicolípidos se cargan en CD1, y de hecho existen proteínas de transferencia especiales dentro de las células presentadoras de antígenos, como las células dendríticas, que ayudan a cargar los lípidos en la molécula CD1D. Con estas bacterias fona, bacterias borre y otras con las que estamos tratando, se trata de bacterias extracelulares. Por lo tanto, los antígenos lipídicos deben ser transportados de alguna manera hacia el interior de la célula, probablemente hacia un lisosoma, para cargarse en la molécula CD1.

Y luego hay una activación inmediata de la célula NKT, y todo esto debe ocurrir dentro de unas pocas horas en los sinusoides, en el hígado, en el bazo, tal vez en la médula ósea y en otros sitios donde se encuentran las células NKT. La estructura tetramérica es realmente fundamental para definir sin ambigüedades estas células T asesinas naturales, que poseen estas propiedades innatas que las distinguen de otras células T. Los otros marcadores disponibles son realmente demasiado ambiguos, pero estos tetrámeros permiten identificar las células según la especificidad de su receptor de antígenos, que es el hecho clave que las define en cierto modo. La elaboración de tetrámeros tiene una larga historia.

Fue inventado por Mark Davis y John Alman, y la idea era que el receptor de células T tiene baja afinidad, y si se desea definir o identificar células según su especificidad, los péptidos que reconocen o los complejos de péptidos y moléculas presentadoras de antígenos no tienen suficiente afinidad, suficiente fuerza de unión para permitir la identificación de la célula. Por lo tanto, lo que Mark Davis y John Allman inventaron fue esta tecnología de tetrámeros, un método para crear tetrámeros en algunos casos OCRs de la molécula presentadora de antígenos más la molécula que presentan, lo cual básicamente aumenta la afinidad o la fuerza de la interacción. Así, se puede visualizar la célula específica para un péptido de la gripe y una molécula presentadora de antígenos particular, o cualquier antígeno que sea de interés.

Tecnología muy importante porque le permite, por ejemplo, observar qué tan efectivo podría ser un esquema de vacunación. Lo que hicimos, comenzando a finales de los años noventa, originalmente publiqué un artículo en el año 2000 que hasta ahora ha sido citado aproximadamente 500 veces. Lo que hicimos fue simplemente adoptar esa tecnología para los lípidos.

Así que generamos moléculas solubles de CD1 y, mediante métodos que describiré brevemente, fuimos capaces de multimerizarlas, es decir, agruparlas y combinarlas con glicolípidos específicos, y de esta manera pudimos utilizarlas como reactivos para detectar receptores específicos de células T. En otras palabras, aquellos que reconocerían el glicolípido de interés junto con CD1D. Los tetrámeros pueden utilizarse en cualquier situación en la que se desee analizar el número de células T NK, su estado de activación y su función.

Y en nuestro laboratorio, podría provenir de cualquiera de varios proyectos diferentes. Por ejemplo, si se desea preguntar si un mutante particular y una vía de señalización afectan el desarrollo de las células T NK, podemos hacerlo con nuestros tetrámeros, investigando la cantidad de células T NK. Y luego existen otros marcadores, otras proteínas de superficie celular que podemos analizar para evaluar si las células T NK están maduras o si están activadas; utilizando los tetrámeros, tras una estimulación antigénica, también podemos determinar no solo si están activadas, sino qué citocinas están produciendo.

Por lo tanto, podemos combinar la tinción con tetrámeros con, por ejemplo, la tinción intracelular de citoquinas y preguntarnos qué porcentaje de las células NKT produce interferón gamma, qué porcentaje produce IL-4, qué porcentaje produce ambas, utilizando citometría de flujo de múltiples parámetros; de este modo, podemos plantear diversas preguntas sobre la producción de citoquinas directamente ex vivo por parte de estas células. También podemos realizar experimentos adicionales. Por ejemplo, podemos usar los tetrámeros para purificar células T NK y cultivarlas in vitro, con el fin de estudiar cómo interactúan con otros tipos celulares, o incluso transferirlas a un animal receptor, por ejemplo, que carezca de células T NK por razones genéticas.

Queremos restaurar esa función. Podemos hacerlo y preguntar y analizar dónde se localizan las células y cómo funcionan. Finalmente, sé que, en el caso de las células NKT humanas, las personas han utilizado en realidad los tetrámeros para expandir líneas celulares in vitro con el fin de cultivar células para fines analíticos y potencialmente incluso para fines terapéuticos.

Bueno, utilizamos un sistema de expresión con virus Bao para generar tetrámeros de CD1D. Así, el proceso comienza con un constructo de ADN común que contiene el promotor y la expresión de la microglobulina BID y la cadena pesada de CD1D. Por lo tanto, esta molécula de CD1 es un heterodímero de dos polipéptidos.

Entonces, tenemos este sistema de expresión con dos promotores, e infectamos células de cultivo de tejido de insecto con los virus vao, titulados cuidadosamente como explicó nuestro canal. Luego infectamos las células y cosechamos del medio de cultivo celular la proteína que es expresada por las células. La cadena pesada CD1D está diseñada especialmente para la producción de tetrámeros.

Hay dos cosas, o más bien tres cosas, debería decir, que hacemos. Una es que eliminamos la porción transmembranal. Así que, tenemos, estamos expresando una proteína soluble.

En segundo lugar, hemos añadido una etiqueta hexa-his para que la proteína pueda purificarse mediante cromatografía de afinidad por iones metálicos. Y en tercer lugar, tenemos lo que se denomina un sitio BirA para biotinilación enzimática. Esto constituye la innovación.

Fue muy importante cuando Davis y Alman inventaron por primera vez la tecnología de producción de tetrámeros. Entonces, después de cosechar la proteína, se purifica mediante cromatografía en columna de níquel en el compuesto de níquel. A veces realizamos cromatografía de exclusión por tamaño después de eso.

Luego, la proteína puede ser biotinilada enzimáticamente e incubada, y una vez que ha sido biotinilada enzimáticamente, al incubarse con strep ab, formará tetrámeros. Pero la proteína soluble de CD1 que se tiene puede incubarse básicamente durante toda la noche en una solución de un glicolípido de interés. Es muy importante que el glicolípido no se disuelva en DMSO, ya que es común usar DMSO como diluyente o disolvente para glicolípidos, porque CD1 es muy sensible a esto.

Por lo tanto, normalmente utilizamos un tampón que contiene una pequeña cantidad de tween y PBS. Y ese tampón es muy eficaz para disolver la mayoría de nuestros glicolípidos. Y para la carga en CD1D, que parece ocurrir espontáneamente, utilizamos estreptavidina de cualquiera de varios fabricantes.

Y se acopla a los colorantes PE, FITC, Eritrina o PC ficocianina, cualquiera de ellos funciona muy bien y nos proporciona una tinción muy buena. En general, el procedimiento en realidad no es muy diferente de los procedimientos bien caracterizados para la elaboración de tetrámeros de MHC clase I, excepto que no utilizamos expresión bacteriana, sino expresión mediante virus bacterianos, y por supuesto empleamos antígenos lipídicos en lugar de péptidos. Un punto que debo destacar es que los humanos poseen células T NK y tienen la misma especificidad que las células T NK del ratón.

Por lo tanto, la especificidad ha existido durante al menos 60 millones de años desde que divergimos de los roedores, y de hecho, producimos tetrámeros humanos de CD1D mediante las mismas técnicas que usted, puede ver en el video que se ha realizado aquí. Y, sin embargo, las células T NK humanas funcionan muy bien con tetrámeros de ratón y viceversa. Por eso no producimos los tetrámeros humanos tan frecuentemente, simplemente porque podemos usar nuestros tetrámeros de ratón para trabajos con humanos.

Por lo tanto, existen muchos modelos de ratón en los que se ha demostrado que las células T NK son determinantes críticos del resultado de la respuesta inmunitaria. Esto abarca desde la respuesta contra el cáncer y la regulación de enfermedades autoinmunes, hasta la eliminación de agentes infecciosos e incluso el desarrollo de placas ateroscleróticas, un proceso inflamatorio crónico que ocurre en las arterias.

Hay cierta, cierta duda sobre la importancia de estas células en humanos, donde son menos abundantes; ha habido muchos informes que indican que están alteradas en estados autoinmunes, y también existen informes que señalan que están muy enriquecidas en los pulmones de pacientes con asma. Aunque estos informes incluyen un informe publicado en el New England Journal of Medicine, existe cierta controversia al respecto. No obstante, hay varios estudios en humanos que sugieren que estas células podrían ser importantes.

En cuanto a los ensayos clínicos, la estimulación de las células T NK ha sido evaluada en cuatro ensayos de fase uno para pacientes con cáncer avanzado. Y existe alguna evidencia de eficacia; por supuesto, estas personas están muy enfermas y los estudios están en curso en varios tipos diferentes de cáncer. Asimismo, hay investigadores interesados en utilizar la terapia con células T NK también en enfermedades autoinmunes, aunque esto aún no ha comenzado.

Los tetrámeros pueden desempeñar un papel en estos estudios principalmente en términos de analizar qué sucedió con las células NKT después de la terapia con agonistas. Así, la idea típica consiste en utilizar agonistas de glicolípidos o, en algunos casos, incluso antagonistas de glicolípidos, que otros grupos están desarrollando, dependiendo de la respuesta y la condición. Y luego evaluar qué ocurrió con las células T NK, lo cual normalmente se haría con tetrámeros.

Otro uso potencial sería en la expansión in vitro de células NKT humanas. Es bastante factible y perfectamente posible cultivar un gran número de células NKT humanas in vitro mediante, por ejemplo, estimulación antigénica, que podría realizarse con tetrámeros o con células que expresen los glicolípidos adecuados. Además del uso de tetrámeros o células, es necesario añadir citocinas.

Pero bajo esas condiciones, se pueden expandir grandes cantidades de células T NK humanas. Y otro aspecto es que al menos un grupo en Boston está interesado en ese tipo de terapia, a diferencia de la terapia basada en glicolípidos. Otra parte de mi laboratorio participa en el estudio de la inmunidad mucosal.

La mayoría de los inmunólogos se han centrado en los linfocitos o glóbulos blancos del ganglio linfático y del bazo. Sin embargo, quizás la mayor parte de los linfocitos que se encuentran en nuestros cuerpos están en realidad en la mucosa intestinal, un sitio en el que también tenemos probablemente entre 10¹⁴ y 10¹⁵ bacterias. Por tanto, desde un punto de vista microbiano, somos en su mayor parte estériles, pero no en nuestro intestino.

Y también en el intestino tenemos una gran cantidad de glóbulos blancos. Estas células poseen propiedades únicas y, de hecho, están algo poco estudiadas. Por lo tanto, realizamos algunas investigaciones de ciencia básica sobre estas células.

Pero también estudiamos un proceso al que llamaría desregulación inmunitaria, a nivel intestinal, que conduce a la enfermedad inflamatoria intestinal, la cual, en esencia, comprende enfermedades mediadas por el sistema inmunitario del intestino delgado o del intestino grueso, y que reciben los nombres de enfermedad de Crohn o colitis ulcerosa. Aunque realizamos algunos estudios en humanos, la mayor parte de nuestro trabajo se lleva a cabo en modelos murinos. Contamos con lo que considero modelos murinos muy adecuados para estudiar la desregulación del sistema inmunitario mucosal que conduce a síntomas similares a los de la enfermedad de Crohn.

Estamos estudiando ese proceso y también formas de interferir con él, con la esperanza final de desarrollar mejores terapias para los pacientes que padecen estas enfermedades inmuno-mediadas. Por tanto, en conclusión, podríamos reflexionar un poco sobre hacia dónde se dirige la inmunología en los próximos 10 años más o menos, y en realidad es muy difícil prever lo que sucederá dentro de una década. Por sorprendente que eso pueda sonar.

Yo, yo sí creo que el sistema inmunitario mucosal es una de las principales áreas inexploradas de la inmunología en realidad. Aunque cada vez más personas y más grupos destacados están mostrando interés en los estudios de inmunología mucosal. Creo que otra área que tendrá un impacto enorme es la genética, y particularmente la genética humana, conforme avancemos, o debería decir, progresemos hacia el secuenciamiento de 1.000 genomas humanos; realmente será posible realizar estudios en individuos y evaluar cómo la variabilidad del ADN afecta la respuesta inmunitaria.

En la actualidad, la mayoría de las mejores investigaciones sobre vías básicas implican roedores. Los roedores, particularmente los ratones, son realmente fundamentales para nuestros estudios. Pero creo que en el futuro, cuando consideremos fenómenos autoinmunes complejos u otras condiciones que podrían estar ocurriendo en los individuos, podremos hacerlo basándonos en polimorfismos genéticos humanos.

Podremos evaluar los polimorfismos y luego utilizar esa información para intentar predecir cómo afectarán las respuestas inmunitarias y, finalmente, avanzar hacia lo que yo llamaría, y lo que otros denominan, terapias inmunitarias personalizadas o, en un sentido más amplio, medicina personalizada. Por lo tanto, la genética tendrá un impacto enorme. Ya contamos con excelentes herramientas en genética de ratón.

Podemos eliminar cualquier gen que deseemos. Podemos interrumpir la expresión de genes en tipos celulares específicos. Podemos hacer cosas asombrosas.

Pero creo que en el futuro estaremos enfocándonos en comprender la respuesta inmunitaria e inmunidad desde el punto de vista de las respuestas humanas.