Name: Métodos electrofisiológicos para medir los niveles de fotopigmento en fotorreceptores de Drosophila (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-02T12:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Aprende métodos electrofisiológicos para medir niveles de fotopigmento en fotorreceptores de Drosophila. Esta técnica permite detectar pequeñas anomalías en la fototransducción y realizar cribados genéticos de mutantes visuales.

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Esta investigación fue apoyada por subvenciones de la Fundación de Ciencias de Israel (ISF) y la Fundación Binacional de Ciencias de Estados Unidos e Israel (BSF). Agradecemos al Sr. Anatoly Shapochnikov por la construcción del calentador de filamento de cera.

1. Medición de la relación de respuesta de intensidad, postpotencial de despolarización prolongada (PDA) y el potencial receptor temprano (ERP) utilizando el electrorretinograma
<ol><li>Condiciones de cría adecuadas para la preparación de D. melanogaster<ol>
<li>Criar moscas D. melanogaster en botellas que contengan alimentos que contengan maíz amarillo estándar en una incubadora mantenida a una temperatura de 24 °C y en un ciclo oscuro/claro de 12 h</li>
		<li>Mantenga las botellas de mosca en la oscuridad al menos 24 horas antes del experimento.</li>
	</ol></li>
	<li>Configuración general<ol>
<li>Prepare pipetas de grabación tirando de capilares de vidrio llenos de fibra de 1 mm x 0,58 mm (O.D x I.D) llenos de fibra (Figura 6L, O). La resistencia de las pipetas debe ser de 5-10 MΩ; se puede utilizar cualquier tirador adecuado.</li>
		<li>Cubra dos cables de plata con AgCl2, insertando alambre de plata de 0,25 mm en una solución KCl de 3 M conectada a una fuente de alimentación de 5 V hecha a medida.</li>
		<li>Inserte cada alambre de plata recubierto en los soportes de los electrodos (Figura 6N).</li>
		<li>Llene el capilar de vidrio con la solución filtrada de Ringer (ver Tabla 1) usando una jeringa de punta alargada (Figura 6M).</li>
		<li>Inserte el electrodo de alambre en el capilar de vidrio. Asegúrese de que la solución dentro del capilar esté en contacto con el alambre de plata.</li>
		<li>Inserte los soportes de electrodos (Figura 7P, N) en los dos micromanipuladores de electrodos (Figura 7G).</li>
	</ol></li>
	<li>Procedimiento de preparación de la mosca para grabaciones eléctricas NOTA: Para mantener la mosca en condiciones adaptadas a la oscuridad, use solo iluminación de luz roja tenue durante los siguientes pasos.<ol>
<li>Anestesiar las moscas en la botella con gas CO2 utilizando el sistema fly sleeper (Figura 6A, B) y verterlas en el recipiente de la traviesa.</li>
		<li>Elija una mosca y sosténgala cuidadosamente por su ala con una pinza afilada. Cubre el resto de las moscas con una placa de Petri.</li>
		<li>Coloque la mosca en el soporte de la mosca en la orientación adecuada, acostada de lado, con la espalda hacia la mano (Figura 6P).</li>
		<li>Encienda la fuente de alimentación del soldador. Establezca la corriente en ~2.25 A. Esta corriente debe calentar el filamento de platino-iridio de 0,25 mm a ~55-56 °C (consulte el archivo complementario).</li>
		<li>Coloque una gota de cera con una temperatura de fusión baja (~ 55-56 ° C) en el soldador (Figura 6F).</li>
		<li>Usando pinzas, levante la mosca de sus alas y fije sus alas al soporte de la mosca (Figura 6I) usando el soldador.</li>
		<li>Usando el soldador, conecte la espalda de la mosca a la superficie del soporte con cera (Figura 6P).</li>
		<li>Baje la punta del soldador sobre el punto de unión de las patas y derrita la cera para cubrir todas las patas juntas (Figura 6P).</li>
		<li>Coloque una pequeña gota de cera entre la cabeza y la espalda en el área del cuello (Figura 6P). NOTA: Tenga especial cuidado para evitar el sobrecalentamiento de la cabeza de la mosca. Asegúrese de que la mosca esté correctamente fijada y no pueda moverse durante el experimento; movimientos menores pueden crear artefactos en las grabaciones. Asegúrese de que las aberturas de la tráquea (entradas de respiración) en el tórax y el abdomen no estén cubiertas con cera.</li>
		<li>Coloque el soporte para moscas (Figura 7Q) en una jaula oscura de Faraday en un bloque magnético (Figura 7I) y asegúrese de que la mosca esté a ~ 5 mm del final de la guía de luz (Figura 7L).</li>
		<li>Coloque el electrodo de grabación (Figura 7P) sobre el ojo de la mosca y el electrodo de tierra (Figura 7N) sobre la parte superior de la espalda de la mosca utilizando los micromanipuladores.</li>
		<li>Inserte el electrodo de tierra en la parte posterior de la mosca utilizando los micromanipuladores.</li>
		<li>Inserte el electrodo de grabación en la periferia externa del ojo de la mosca, preferiblemente, utilizando los micromanipuladores. NOTA: Después de insertar el electrodo en el ojo, se observará un pequeño hoyuelo; tire del electrodo hacia arriba sin retirarlo del ojo hasta que el hoyuelo desaparezca. Los electrodos también se pueden sumergir en pequeñas gotas de gelatina de electrodo aplicadas en el torso y el ojo.</li>
	</ol></li>
	<li>Protocolo de intensidad-respuesta<ol>
<li>Coloque un filtro naranja (filtro de borde 590) delante de la lámpara de xenón de alta presión. Utilice un filtro de densidad neutra atenuante (ND) grande (seis órdenes de magnitud).</li>
		<li>Espere 60 s en la oscuridad y dé un pulso de luz de 5 s.</li>
		<li>Reemplace el filtro ND por un filtro ND menos atenuante en incrementos de un orden de magnitud.</li>
		<li>Espere 60 s en la oscuridad y dé un segundo pulso de luz de 5 s.</li>
		<li>Repita los pasos 1.4.1.-1.4.4, aumentando gradualmente la intensidad de la luz utilizando filtros ND menos atenuantes (el último pulso debe generarse sin ningún filtro ND). Asegúrese de utilizar la serie de filtros ND en la dirección adecuada, comenzando por una gran atenuación y alcanzando una atenuación baja.</li>
	</ol></li>
	<li>Protocolo PDA (este protocolo solo se puede realizar en moscas de ojos blancos)<ol>
<li>Dar un pulso de luz de 5 s de máxima intensidad usando un filtro naranja (filtro de borde 590, para convertir el fotopigmento máximo al estado R).</li>
		<li>Reemplace el filtro naranja por un filtro azul de banda ancha (BP450/40 nm) y dé tres pulsos de luz de 5 s a la máxima intensidad. NOTA: También es posible dar un pulso de luz azul de intensidad máxima continua y larga hasta que se alcance una respuesta de voltaje de estado estacionario.</li>
		<li>Espere 60 s en la oscuridad, reemplace el filtro azul con el filtro naranja anterior y dé dos pulsos de luz de 5 s con intervalos de 60 s.</li>
	</ol></li>
	<li>Protocolo ERP/M-potential para medir el espectro de fotoequilibrio de M (este protocolo solo se puede realizar en moscas de ojos blancos10,25)<ol>
<li>Dé un pulso de luz azul continuo (paso de banda (BP) 450/40 nm) hasta alcanzar una respuesta de voltaje de estado estacionario, que convierte la cantidad máxima de fotopigmento del estado R al estado M de las celdas R1-6.</li>
		<li>Dé un breve destello de luz intensa (<3 ms) de una longitud de onda entre 350-700 nm (el espectro de absorción conocido del fotopigmento de las células R1-6) utilizando filtros de paso de banda estrechos (~ 20 nm) y mida la amplitud máxima de la fase M1 de la respuesta potencial M (que refleja la absorción de metarhodopsina en esta longitud de onda específica en el fotoequilibrio10,25). NOTA: Para la activación síncrona de un gran grupo de moléculas de fotopigmento, se requiere un breve e intenso destello de luz para que el contenido de fotones se empaquete en una corta duración. El potencial M está compuesto por dos componentes: M1 (fase negativa corneal), que refleja el desplazamiento de carga de la metarhodopsina en el fotorreceptor, y M2 (fase11,33 positiva corneal), que refleja la respuesta M1 amplificada de los fotorreceptores en la lámina 9,10,11 . Cada uno de estos componentes puede ser identificado y medido. Sin embargo, es preferible medir el potencial M1 ya que es una manifestación lineal directa de los niveles M. Si se utiliza M2, asegúrese de que su amplitud esté en el rango lineal mediante el uso de privación leve de carotenoides24,25.</li>
		<li>Vuelva a dar un pulso de luz azul continuo (BP450/40 nm), seguido de un breve destello de luz intensa (<1 ms) de una longitud de onda diferente.</li>
		<li>Repita este protocolo hasta que se cubra todo el espectro de absorción de M en el equilibrio fotográfico.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Protocolo ERC para medir el espectro de acción de los estados R y M de las celdas R1-6 utilizando registros de pinzas de voltaje de celda entera
NOTA: Para obtener un protocolo detallado para el uso de grabaciones de pinzas de voltaje de celda entera, véase Katz et al.34. El potencial M utiliza el ERG para medir la activación del estado M solo porque la contribución del estado R es suprimida por la capacitancia de la membrana. Por el contrario, el ERC mide la activación de los estados R (ERC positivo) y M (ERC negativo) porque los registros de pinza de voltaje eliminan el efecto de la capacitancia de la membrana (ver introducción).
<ol><li>Convierta el fotopigmento al estado deseado (R o M). Para la conversión de R a M, primero, adapte las moscas mediante un breve (<1 ms) flash azul adaptativo (BP450/40 nm). Para la conversión de M a R, proporcione un flash naranja adaptativo corto (filtro de borde OG590).</li>
	<li>Dé un breve destello de luz (<1 ms) de una longitud de onda entre 350-700 nm y mida la amplitud máxima negativa o positiva de la respuesta ERC, que refleja la absorción M / R en esta longitud de onda específica. NOTA: Para la activación síncrona de un gran grupo de moléculas de fotopigmento, se requiere un breve e intenso destello de luz para empacar el contenido de fotones en una corta duración. La conversión máxima de fotopigmento de R a M por flash azul puede alcanzar ~ 80% del total de moléculas de fotopigmento debido a la superposición en el espectro de absorción de R y M (Figura 3A). Por lo tanto, en longitudes de onda inferiores a ~ 550 nm, el ERC tiene dos componentes: una fase negativa que refleja la respuesta de la metarhodopsina y una fase positiva que refleja la respuesta de la rodopsina restante. El ERC depende linealmente de la intensidad de la luz (Figura 5D). En consecuencia, para derivar la sensibilidad espectral de los estados R y M, cada fase del ERC necesita ser normalizada en las diversas longitudes de onda para una energía igual29.</li>
	<li>Repita los pasos 2.1.-2.2. utilizando destellos de diferentes longitudes de onda.</li>
	<li>Trazar el ERC positivo y negativo normalizado en función de la longitud de onda. NOTA: El fuerte destello de luz induce una corriente masiva a través de los canales sensibles a la luz que conduce a un estrés metabólico en el fotorreceptor, que, a su vez, causa la apertura del canal independiente de la luz. El ERC se superpone a esta corriente constitutiva.</li>
</ol>

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<li>Satoh, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arrestin+translocation+is+stoichiometric+to+rhodopsin+isomerization+and+accelerated+by+phototransduction+in+Drosophila+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Arrestin translocation is stoichiometric to rhodopsin isomerization and accelerated by phototransduction in Drosophila photoreceptors.</a> Neuron. 67 (6), 997-1008 (2010).</li>
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<li>Pak, W. L., Lidington, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+electrical+potential+from+a+long-lived%2C+long-wavelength+photoproduct+of+fly+visual+pigment%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">Fast electrical potential from a long-lived, long-wavelength photoproduct of fly visual pigment.</a> The Journal of General Physiology. 63 (6), 740-756 (1974).</li>
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</ol>

Los autores declaran no tener conflicto de intereses.

La principal ventaja de usar la preparación de fotorreceptores Drosophila es su accesibilidad, la facilidad y precisión de la estimulación de la luz y, lo más importante, la capacidad de aplicar el poder de la genética molecular7. Extensos estudios genéticos han establecido Drosophila como un sistema modelo extremadamente útil para la disección genética de procesos biológicos complejos7. La estructura relativamente simple del genoma de Drosophila ...

La rodopsina activada por la luz (R), que es un receptor acoplado a la proteína G (GPCR), está compuesta por una proteína transmembrana 7 (opsina) y un cromóforo. En Drosophila melanogaster (mosca de la fruta), la absorción de fotones induce la isomerización del cromóforo 11-cis-3-OH-retinal a all-trans-3-OH-retinal1, promoviendo el cambio conformacional de la rodopsina a metarhodopsina (M, Figura 1A). A diferencia de la rodopsina de vertebrados, la fracción predominante del cromóforo de invertebrados no se disocia de la opsina, lo que resulta en el estado de pigmento fisiológicamente activo oscuro-estable M. A su vez, la absorción adicional de fotones por el cromóforo all-trans-3-OH-retinal induce la isomerización del cromóforo 2,3, generando el estado pigmentario R con el cromóforo 11-cis-3-OH-retinal. El estado R es un fotopigmento oscuro, estable y fisiológicamente no activo. Además de la ruta de regeneración de fotones extremadamente rápida del cromóforo4, al igual que los fotopigmentos de vertebrados, existe una ruta lenta enzimática alternativa para la regeneración de cromóforos en los invertebrados, en la que algunas de las etapas se realizan en las células de la retina que rodean las células fotorreceptoras 5,6.
Drosophila conlleva grandes ventajas como organismo modelo para el estudio de fotorreceptores de invertebrados. En particular, la accesibilidad de la preparación y la capacidad de aplicar la genética molecular han hecho de Drosophila un poderoso sistema modelo7. Por lo tanto, se han establecido varios métodos experimentales in vivo y ex vivo para estudiar la fototransducción en general y los niveles de fotopigmento, en particular. El método in vivo más simple explota la respuesta de voltaje extracelularmente registrada relativamente grande a la luz del ojo de Drosophila. En consecuencia, la estimulación de la luz evoca una respuesta de voltaje eléctrico en todo el ojo que se puede medir utilizando el registro de electrorretinograma extracelular (ERG), que es ~ 3 órdenes de magnitud mayor que la respuesta ERG a la luz de los ojos de los vertebrados 8,9. La respuesta ERG de Drosophila es robusta y fácil de obtener, lo que la convierte en un método conveniente para identificar anomalías en la respuesta a la luz debido a mutaciones. La respuesta del ERG a la luz surge principalmente de los fotorreceptores, las células pigmentarias (glía) y las neuronas secundarias de la lámina (ver Figura 1B). Los componentes principales del ERG son (i) la respuesta de voltaje extracelular de los fotorreceptores, (ii) los transitorios "on" y "off" al principio y al final del estímulo de luz que surgen de las neuronas de la lámina (Figura 2A, recuadro, ON, OFF), (iii) la respuesta lenta de las células gliales (Figura 2A, recuadro, flechas), y (iv) la respuesta breve y transitoria, resultante del desplazamiento de la carga durante la activación del fotopigmento que precede al transitorioON 10 (Figura 2C [recuadro], D, E). Esta breve respuesta se compone de dos fases (M1 y M2, Figura 2C [recuadro]) y solo puede ser inducida por una estimulación de luz extremadamente fuerte, que activa simultáneamente millones de moléculas de fotopigmento. No se observa bajo estimulación azul (Figura 2D, traza azul) ni en mutantes con niveles de fotopigmento muy reducidos (Figura 2E, traza roja), pero su amplitud se mejora ligeramente en un mutante que abole la actividad plc (Figura 2E, traza naranja). La fase M1 es un ERP típico de la mosca que surge de la activación de M en los fotorreceptores. La fase M1, que tiene una polaridad positiva (intracelularmente), libera un neurotransmisor de forma normal en una sinapsis inversora de signos y activa las neuronas de la lámina, que responden a la despolarización del fotorreceptor generando la fase M2 amplificada sinápticamente. Así, tanto las fases M1 como M2 reflejan la activación M10,11.
La despolarización del fotorreceptor genera el transitorio "on" corneal-positivo, que surge de la sinapsis inversora de signos entre el axón fotorreceptor y las neuronas monopolares de la lámina10,11 (Figura 1B). El lento ascenso y decaimiento del ERG surgen de la despolarización de las células pigmentarias (Figura 2A, recuadro, flechas) debido principalmente al eflujo K+ de las células fotorreceptoras12 a través de los canales de potencial receptor transitorio (TRP) y TRP-like (TRPL) 13,14,15. Estos componentes cinéticos lentos enmascaran y distorsionan en gran medida la forma de onda de la respuesta del fotorreceptor en comparación con los registros intracelulares o de células enteras de la respuesta del fotorreceptor a la luz 9,10. Además, a iluminaciones muy fuertes, se puede observar una respuesta transitoria adicional, que precede y se fusiona parcialmente con el transitorio "encendido" (Figura 2C [recuadro],D,E). Esta señal se origina directamente a partir de la activación masiva del fotopigmento10.
Se han desarrollado varios protocolos de régimen de luz que utilizan filtros de densidad neutra (ND) y de color, así como fuertes destellos de iluminación, para investigar el ojo en general y la cascada de fototransducción en particular. Estos protocolos también se han utilizado para investigar las propiedades del fotopigmento.
El protocolo de intensidad-respuesta mide la amplitud máxima de la respuesta de voltaje ERG de todo el ojo al aumento de las intensidades de luz (Figura 2A, B). Este protocolo ayuda a detectar cambios en la sensibilidad de las células fotorreceptoras a la luz9.
El protocolo postpotencial de despolarización prolongada (PDA) explota las diferencias en los espectros de absorción de rodopsina y metarhodopsina que permite, en Drosophila, una conversión fotopigmentada masiva de R a su estado intermedio M fisiológicamente activo y oscuro-estable2. En la respuesta de voltaje ERG, se da un pulso relativamente corto de luz saturada, y se registra la respuesta de voltaje resultante. Bajo esta condición, la señal de despolarización alcanza un techo (potencial de inversión) porque la activación de una fracción de un porcentaje de la enorme cantidad de moléculas de rodopsina (~ 1 x 108) es suficiente para alcanzar el techo. La presencia de los componentes de fototransducción en gran abundancia asegura que este techo se alcanzará incluso en mutantes con una reducción significativa en la concentración o un mal funcionamiento sutil de los componentes de fototransducción. Esta situación impide el aislamiento de estos mutantes. Pak et al. introdujeron el PDA screening7 buscando una prueba confiable y reveladora para aislar mutantes visuales. En Drosophila, la respuesta PDA se produce mediante la eliminación genética del pigmento rojo de cribado, que permite la conversión de fotopigmentos, y la aplicación de luz azul, que es absorbida preferentemente por la rodopsina (Figura 3A) y, por lo tanto, da como resultado una gran conversión neta de la R al estado de fotopigmento M. La terminación de la fototransducción se interrumpe a nivel del fotopigmento por una gran conversión neta de R a M, lo que, a su vez, da como resultado una excitación sostenida mucho después de que se apaga la luz (Figura 2C, Figura 4A [arriba]). Durante el período de PDA, los fotorreceptores son menos sensibles a las luces de prueba posteriores y están parcialmente insensibilizados (inactivados). El PDA detecta incluso defectos menores en la biogénesis de rodopsina y prueba la capacidad máxima de la célula fotorreceptora para mantener la excitación durante un período prolongado. Dado que depende estrictamente de la presencia de altas concentraciones de rodopsina, califica fácilmente para la reposición deficiente de los componentes de fototransducción. Sorprendentemente, la pantalla PDA ha producido muchos mutantes visuales nuevos y muy importantes (revisados en Pak et al.7). Por lo tanto, los mutantes PDA aislados por Pak et al.7 siguen siendo extremadamente útiles para analizar el sistema visual de Drosophila .
El PDA es inducido en Drosophila por la saturación de luz azul, lo que resulta en una despolarización continua mucho después del desplazamiento de la luz (Figura 4A [arriba]). Después de saturar la luz azul inductora de PDA, los fotorreceptores periféricos (R1-6) permanecen continuamente activos en la oscuridad a su capacidad máxima, alcanzando la saturación. Las luces azules saturadas adicionales durante el PDA no producen ninguna respuesta adicional en las células R1-6 durante muchos segundos, sino que inducen una respuesta en las células R7-8 que se superpone a la PDA. Las respuestas superpuestas se explican por los diferentes espectros de absorción de los fotopigmentos expresados en estas células (R7-8)16. El PDA puede ser suprimido por la fotoconversión de M de vuelta a R con luz naranja saturada (Figura 4A [arriba]). La capacidad del PDA para llevar a las células fotorreceptoras a su capacidad activa máxima, una situación que no se puede lograr con luz blanca intensa, explica por qué ha sido una herramienta importante para detectar mutantes visuales de Drosophila. Esto se debe a que permite la detección de incluso defectos menores en proteínas implicadas en la biogénesis de niveles normales de fotopigmento17,18. Se han aislado dos grupos de mutantes defectuosos de PDA: ni mutantes de inactivación ni después de potenciales (nina) e inactivación, pero no mutantes postpotenciales (ina). El fenotipo del primero es la falta de un CAP y la inactivación asociada que surge de una gran reducción en los niveles de fotopigmento (Figura 4A [medio]). El fenotipo de este último muestra inactivación pero no despolarización oscura después de la luz azul debido a un mecanismo aún desconocido en el mutante con niveles normales de rodopsina pero carente de proteínas que interactúan con los canales TRP (Figura 4A [abajo]).
El PDA surge de la diferencia en la cantidad de fotopigmento en relación con la arrestina (ARR2), que une y termina la actividad M 19,20,21 (Figura 1A). En los fotorreceptores de Drosophila, la cantidad del fotopigmento es aproximadamente cinco veces mayor que la cantidad de ARR219. Así, los niveles de ARR2 son insuficientes para inactivar todas las moléculas M generadas por una gran fotoconversión neta de R a M, dejando un exceso de M constantemente activo en la oscuridad 17,19,20,22,23. Este mecanismo explica la eliminación de la respuesta del CAP por mutaciones o por privación de carotenoides24,25, provocando una reducción del nivel de fotopigmento, pero no afecta a los niveles de arrestina. Además, esta explicación también explica los fenotipos del alelo21 mutante nulo ARR2 (arr2 3), en el que se podría lograr PDA a intensidades de luz azul más tenues ~ 10 veces 19,20,21 (Figura 4B, C). El PDA no es una característica única de los fotorreceptores de mosca, y aparece en todas las especies probadas que tiene M estable oscuro con un espectro de absorción diferente al del estado R, lo que permite una fotoconversión suficiente del fotopigmento del estado R al estado M. Una especie investigada a fondo en la que se descubrió la fenomenología PDA es el fotorreceptor percebe (Balanus), en el que el espectro de absorción del estado R está en una longitud de onda más larga que el estado M2 (Figura 3B). En consecuencia, a diferencia de la situación en la mosca, en el percebe, la luz naranja-roja induce un PDA, mientras que la luz azul suprime el PDA2.
El protocolo de potencial del receptor temprano (ERP) explota el desplazamiento de carga que ocurre durante la activación de R o M. El pigmento visual es una parte integral de la membrana superficial del compartimento de señalización de las membranas de vertebrados e invertebrados3. En consecuencia, el proceso de activación en el que las moléculas de fotopigmento cambian de un estado intermedio a otro se acompaña de un desplazamiento de carga 4,26. Como las moléculas de fotopigmento se alinean eléctricamente en paralelo con la capacitanciade membrana 4, un cambio conformacional sincronizado rápido genera un cambio de polarización rápido de la membrana superficial, que, en las moscas, ocurre en el compartimiento de señalización compuesto por una pila de ~ 30,000-50,000 microvellosidades llamada rabdomere. Esta polarización luego se descarga pasivamente a través de la capacitancia de membrana del cuerpo celular hasta que la membrana celular está igualmente polarizada. El ERP es el registro extracelular del desplazamiento de carga. El ERP registrado intracelularmente manifiesta el ERP extracelular integrado por la constante de tiempo de la membrana celular 4,27,28. La corriente activada por el desplazamiento de la carga visual del pigmento también podría medirse en registros de pinzas de voltaje de celda entera29,30 (Figura 5A-D), con la gran ventaja (en registros de corriente de receptor temprano (ERC)) de minimizar el efecto de la capacitancia de membrana en la cinética de la señal.
La sección de protocolo describe cómo realizar mediciones de ERG a partir de Drosophila eye9 y mediciones de ERC mediante registros de células enteras de ommatidia aislada de Drosophila 31,32. También describimos protocolos específicos que se utilizan para investigar la fototransducción en general y los fotopigmentos en particular.

<table><tbody><tr><td>Jeringa de 1 mL con punta</td><td></td><td></td> alargada <td>Figura 6M</td></tr><tr><td>1 pinza</td><td></td> rugosa <td>Dumont #5, estándar</td><td>0,1 mm x 0,06 mm, longitud 110 mm, acero inoxidable (figura 6H)</td></tr><tr><td>2 lentes de condensador convertidor</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A/D</td><td>Dispositivo molecular</td><td>Digidata 1200</td><td>Posible sustitución: cualquier digidata de dispositivos moleculares (p. ej. 1440A) -Figura 7C</td></tr><tr><td>Amplificador</td><td>Electrónica casi perfecta</td><td>Posible reemplazo: Instrumentos Warner- IE251A o IE-210 (viene con cabeza)- Figura 7D</td>Mesa antivibratoria Newport VW-3036-OPT-01 Figura 7H Capilares Aparato Harvard Capilares de vidrio de borosilicato 1 mm x 0,58 mm (Figura 6O)Software de dispositivo molecular Clampex CO2 </<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> subtanque</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fuente > luz fría</td><td>Schott</td><td>KL1500 LCD</td><td>Figura 6C</td></tr><tr><td>Limpiaparabrisas delicados</td><td>Kimtech</td><td></td><td>Kimwipes (Figura 6K)</td></tr><tr><td>Portaelectrodos</td><td></td><td></td><td>Adecuado para diámetro exterior capilar de 1 mm (Figura 6N, Figura 7N y Figura 7P)</td></tr><tr><td>Jaula de Faraday</td> Blindaje electromagnético <td>casero</td><td></td><td>y cortina frontal negra (Figura 7K)</td></tr><tr><td>Filtro (Color)</td><td>Schott</td><td>OG590, Filtro de borde</td><td>Figura 7S</td></tr><tr><td>Filtro (Color)</td><td>Schott</td><td>BP450/40 nm</td><td>Figura 7S</td></tr><tr><td>Filtro (Color)</td><td>Blazers</td><td>550 nm</td><td>Figura 7S</td></tr><tr><td>Filtro (Color) para fuente de luz fría</td><td>Schott</td><td>RG630</td><td>Figura 6C</td></tr><tr><td>Filtro (Calor)</td><td>Schott</td><td>KG3</td><td>Figura 7S</td></tr><tr><td>Filtros (Neutro filtro de densidad)</td><td>Chroma</td><td>6,5,4,3,2,1,0.5,0.3</td><td>Figura 7S Sistema de</td></tr><tr><td>lámpara de flash</td><td>Honeywell</td><td></td><td>Figura 7U</td></tr><tr><td>Sistema de traviesas de mosca con inyector</td><td>Inyectar + matic</td><td></td><td>Figura 6A-B</td></tr><tr><td>Fuente de alimentación de la lámpara</td><td>PTI</td><td>LPS-220</td><td>Figura 7W</td></tr><tr><td>Detector de luz</td><td>Fototransistor casero</td><td></td><td></td> (Figura 7O)</tr><tr><td>Guía de luz</td><td></td><td></td><td>3 mm de diámetro, 1,3 m de largo (Figura 7L,M)Fuente</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> de luz <td>Lámpara de xenón de 75 W libre de ozono de alta presión (que funciona a 50 W), posible reemplazo: Cairn research- OptoLED (Figura 7R)</td></tr><tr><td>Cera de fusión a baja temperatura</td><td>Hecho en</td><td></td> casa <td>Compuesto de mezcla de cera de abejas (Tm&asymp; 62 y s&deg; C) y parafina a ~3:1 para alcanzar una temperatura de fusión de ~55&ndash; 56 &deg; C (Figura 6J)</td></tr><tr><td>Soporte magnético para moscas Hecho</td><td>en</td><td></td> casa <td>Figura 6I y Figura 7Q</td></tr><tr><td>Sistema de preamplificador de microelectrodos con etapa de cabeza</td><td>Electrónica</td><td></td> casi perfecta <td>Probador de impedancia (Figura 7G)</td></tr><tr><td>Micromanipulador (mecánico grueso)</td><td>Tritech Research, Narishige</td><td>M-2</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulador (mecánico fino)</td><td>Leitz Microsystems</td><td>Leitz Micromanipulador mecánico</td><td>Figura 7F</td></tr><tr><td>pCLAMP</td><td>Software de dispositivo</td><td></td><td></td>molecular</tr><tr><td>Placa</td><td></td><td></td> de Petri <td>60 mm</td></tr><tr><td>Generador de impulsos</td><td>AMPI</td><td>Master 8</td><td>Figura 7A</td></tr><tr><td>Crema Redux para electrocardiografía</td><td>Parker Laboratories</td><td>Redux Electrolyte Cr&egrave; me</td><td></td></tr><tr><td>Controlador de obturador</td><td>Uniblitz, Vincent Associates</td><td>VCM-D1 Monocanal Uni-estable</td><td>Figura 7V</td></tr><tr><td>Sistema de obturador</td><td>Uniblitz, Vincent Associates</td><td>LS2 2 mm Uni-estable Obturadores</td><td>Figura 7V</td></tr><tr><td>Alambre de plata</td><td>Warner Instruments</td><td></td><td>0.25&ndash; 1 mm de diámetro, necesita ser cloruro</td></tr><tr><td>Soldador compuesto por un filamento</td><td></td><td></td> de platino-iridio de <td>0,25 mm de diámetro (Figura 6F)</td></tr><tr><td>Microscopio con zoom estereoscópico</td><td>Nikon</td><td>SMZ-2B</td><td>Figura 6D</td></tr><tr><td>Zoom estereoscópico Microscopio</td><td>Wild</td><td>Wild M5</td><td>Con ajustes de aumento de 6, 12, 25 y 50 (Figura 7E)</td></tr><tr><td>Filtros de jeringa</td><td>Millex</td><td></td><td>22 y micro; m Filtro de PVDF</td></tr><tr><td>Extractor de pipeta vertical</td><td>Sutter/ Narishige</td><td>Modelo P-97/PP-830</td><td>Utilice un extractor vertical u horizontal, según prefiera (Figura 6L)</td></tr><tr><td>Calentador de filamento de cera</td><td>Hecho en</td><td></td> casa <td>Ver figura S1 (Figura 6E-G)</td></tr><tr><td>Sistema de lámpara de destello de xenón</td><td>Dr. Rapp OptoElectronic</td><td>JML-C2</td><td>Figura 7X</td></tr></tbody></table>

métodos electrofisiológicos para medir los niveles de fotopigmento en fotorreceptores de drosophila

Electrophysiological Methods for Measuring Photopigment Levels in Drosophila Photoreceptors

El fotopigmento acoplado a la proteína G de Drosophila rodopsina (R) está compuesto por una proteína (opsina) y un cromóforo. El proceso de activación de la rodopsina se inicia mediante la isomerización inductora de absorción de fotones del cromóforo, promoviendo cambios conformacionales de la opsina y dando como resultado un segundo estado de fotopigmento oscuro-estable (metarhodopsina, M). La investigación de este fotopigmento biestable utilizando mutagénesis aleatoria requiere métodos simples y robustos para detectar moscas mutantes. Por lo tanto, se han diseñado varios métodos para medir las reducciones en los niveles de fotopigmento funcional. Uno de estos métodos explota los desplazamientos de carga dentro del fotopigmento después de la absorción de fotones y las enormes cantidades de moléculas de fotopigmento expresadas en los fotorreceptores. Esta señal eléctrica, llamada potencial del receptor temprano (o corriente temprana del receptor), se mide mediante una variedad de métodos electrofisiológicos (por ejemplo, electrorretinograma y registros de células enteras) y es linealmente proporcional a los niveles de fotopigmento funcional. Las ventajas de este método son la alta relación señal-ruido, la medición lineal directa de los niveles de fotopigmento y la independencia de los mecanismos de fototransducción aguas abajo de la activación de rodopsina o metarhodopsina. Un método electrofisiológico adicional llamado postpotencial de despolarización prolongada (PDA) explota la biestabilidad del fotopigmento de Drosophila y las diferencias espectrales de absorción de los estados de pigmento R y M de la mosca. El PDA es inducido por la luz azul intensa, convirtiendo cantidades saturadas de rodopsina en metarhodopsina, lo que resulta en la falla de la terminación de la respuesta a la luz durante un tiempo prolongado en la oscuridad, pero puede ser terminado por la conversión de metarhodopsina a rodopsina utilizando luz naranja intensa. Dado que el PDA es una señal robusta que requiere una conversión masiva de fotopigmentos, incluso pequeños defectos en la biogénesis del fotopigmento conducen a un PDA anormal fácilmente detectado. De hecho, los mutantes PDA defectuosos condujeron a la identificación de nuevas proteínas de señalización importantes para la fototransducción.

La Figura 2 ejemplifica la robustez y facilidad de uso de la técnica ERG. Es robusto porque se registra en la mosca prácticamente intacta mediante una técnica simple de registros de voltaje extracelular que requieren una configuración electrofisiológica simple. La robustez se manifiesta mediante la obtención de registros de respuestas de luz con amplitudes relativamente grandes (en el rango de milivoltios) incluso cuando las mutaciones reducen o distorsionan fuertemente la respuesta de la lu...

Presentamos un protocolo para caracterizar electrofisiológicamente los fotopigmentos biestables: (i) explotar los desplazamientos de carga dentro de las moléculas de fotopigmento después de la absorción de fotones y su enorme cantidad en los fotorreceptores, y (ii) explotar las diferencias de espectros de absorción de los estados de fotopigmento de rodopsina y metarhodopsina. Estos protocolos son útiles para detectar mutaciones que afectan a los sistemas de fotopigmento biestables.

Métodos electrofisiológicos para medir los niveles de fotopigmento en fotorreceptores de Drosophila

The Drosophila G-protein-coupled photopigment rhodopsin (R) is composed of a protein (opsin) and a chromophore. The activation process of rhodopsin is ...

Este protocolo es particularmente adecuado para la detección genética de mutantes de Drosophila visualmente defectuosos. Esto se debe a que permiten la detección de incluso pequeñas anomalías en la fototransducción de Drosophila, particularmente en los niveles de fotopigmento y las funciones relacionadas con los pares de nivel. Esta técnica es profunda in vivo, es fácil de ejecutar y altamente robusta, permitiendo la detección de pequeños cambios en la actividad de las proteínas de fototransducción.En mi opinión, arreglar las moscas mientras se mantiene la viabilidad es probablemente la parte crítica de este método. Encienda el ordenador y abra el software Clampex. Encienda el amplificador y el generador de pulsos Master-8 y, a continuación, encienda la lámpara de xenón y el controlador del obturador.Encienda el extractor y coloque un capilar de vidrio en el extractor y tire de él. Retire el capilar de vidrio del extractor. Llene el capilar de vidrio con una solución de ringer filtrada usando una jeringa de punta alargada.Inserte el electrodo de alambre en el capilar de vidrio. Asegúrese de que la solución dentro del capilar esté en contacto con el alambre de plata. Inserte los soportes de electrodos en los dos micromanipuladores de electrodos.Encienda la fuente de alimentación del soldador. Ajuste la corriente a aproximadamente 2,25 amperios. Esta corriente debería calentar el filamento de platino-iridio de 0,25 milímetros a aproximadamente 55 a 56 grados centígrados.Coloque una gota de cera con una temperatura de fusión baja en el soldador. Anestesia las moscas dentro de la botella. Vierta las moscas anestesiadas en el recipiente para dormir, elija una mosca y cubra el resto de las moscas con una placa de Petri.Sostenga cuidadosamente la mosca por sus alas con una pinza afilada y colóquela en el portamoscas. En el portamoscas, coloque la mosca acostada de lado con la espalda hacia la mano. Usando pinzas, levante la mosca de sus alas y fije sus alas al portamoscas usando el soldador.Conecte la espalda de la mosca a la superficie del soporte con cera utilizando el soldador. Baje la punta del soldador hasta el punto de unión de las patas, luego derrita la cera para cubrir todas las piernas juntas. Coloque una pequeña gota de cera entre la cabeza y el cuello en el área del cuello.Coloque el portamoscas en una jaula de Faraday oscura sobre un bloque magnético y asegúrese de que la mosca esté aproximadamente a cinco milímetros del final de la guía de luz. Coloque el electrodo de grabación sobre el ojo de la mosca y el electrodo de tierra sobre la parte superior de la espalda de la mosca utilizando los micromanipuladores. Luego inserte el electrodo de tierra en la parte posterior de la mosca usando los micromanipuladores.Inserte el electrodo de grabación en la periferia exterior del ojo de la mosca, preferiblemente utilizando los micromanipuladores. Cierre la jaula de Faraday y apague las luces de la habitación para permitir la adaptación a la oscuridad durante cinco minutos. Introduzca los parámetros a partir de una duración de pulso de 500 metros por segundo, un intervalo de pulso de 60 segundos y el número de pulsos establecido en seis.Para medir el PDA, ajuste el generador de impulsos Master-8 en modo TRAIN, luego dé un pulso de luz de cinco segundos de intensidad máxima usando un filtro naranja. Compruebe la respuesta de voltaje. Reemplace el filtro naranja con un filtro azul de banda ancha y dé tres pulsos de luz de 5 segundos a la intensidad máxima.Compruebe la respuesta de voltaje. Espere al menos 60 segundos en la oscuridad. Reemplace el filtro azul con el filtro naranja anterior.Luego dé dos pulsos de luz de 5 segundos con intervalos de 60 segundos. Compruebe la respuesta de voltaje. Para medir el potencial M de ERP, proporcione un pulso de luz azul continuo hasta que se alcance una respuesta de voltaje de estado estacionario.Dé un breve destello de luz intensa de una longitud de onda entre 350 y 700 nanómetros utilizando un filtro de paso de banda de 20 nanómetros. Luego mida la amplitud máxima de la fase M1 de la respuesta del potencial M, que refleja la absorción de metarodopsina en esta longitud de onda específica en el fotoequilibrio. Las respuestas PDA se evaluaron para diferentes moscas mutantes.Las moscas de tipo salvaje mostraron una despolarización saturada en la oscuridad que apareció como ERG corneal negativo prolongado, después de una intensa estimulación de la luz azul. Las siguientes luces azules produjeron pequeñas respuestas superpuestas en el PDA, careciendo de los transitorios de encendido y apagado. En moscas mutantes con biogénesis fotopigmentaria anormal como ninaE, la respuesta de voltaje volvió a la línea de base después de una intensa estimulación de luz azul, y la respuesta a una luz azul adicional no se suprimió y mostró transitorios normales de encendido y apagado.El ERP de tipo salvaje de la mosca se obtiene por el mismo protocolo, pero se aplica un destello verde intenso durante la PDA. Este destello verde provoca el ERP y suprime el PDA. El potencial M se obtuvo por el destello verde después de la iluminación azul, pero no por un destello azul después de la iluminación azul en la mosca de tipo salvaje.Este protocolo se repitió en tipo salvaje, en ninaE mutante hipomorfo fotopigmentario y en mutante deficiente en fototransducción con niveles normales de fotopigmento norpA. Los espectros de absorción relativa de rodopsina mosca y metarodopsina se calcularon a partir de mediciones fotométricas del espectro diferente y el espectro de fotoequilibrio. Es importante para la supervivencia de las moscas prestar atención a la viscosidad de la cera absteniéndose de sobrecalentarse.Este procedimiento es adecuado para la genética y a través de la detección de mutantes visuales defectuosos. Los métodos que aíslan e identifican mutaciones visuales al azar pueden facilitar el descubrimiento de nuevas proteínas y mecanismos implicados en la fototransducción de Drosophila. El protocolo PDA permitió el aislamiento de mecanismos visuales importantes y novedosos.La participación probablemente no habría sido descubierta o incluso anticipada de otra manera.

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Research

Investigación

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Neuroscience

Neurociencia

Este video describe el protocolo para el registro electrofisiológico de la actividad de los fotorreceptores en el ojo de una Drosophila inmovilizada, lo que permite una medición precisa de los cambios de voltaje en respuesta a estímulos luminosos.

Registro electrofisiológico de las respuestas de voltaje de los fotorreceptores de la retina de Drosophila a los estímulos luminosos

El video muestra el registro de la actividad eléctrica en las neuronas fotorreceptoras del omatridio de Drosophila mediante el establecimiento de una configuración de célula completa. Destaca la activación de los canales de potencial receptor transitorio por pulsos de luz, lo que da lugar a protuberancias cuánticas medibles.

Grabaciones de pinzas de voltaje de celda completa de fotorreceptores de Drosophila

Este video muestra un protocolo experimental para investigar el potencial de residuo despolarizante prolongado (PDA) en Drosophila de ojos blancos. El ojo de la mosca se expone a pulsos de luz azul intensos para convertir el fotopigmento rodopsina en metarodopsina, iniciando una cascada de señalización que abre canales iónicos positivos y provoca la despolarización de la membrana. Debido a que la luz azul impide la reconversión de la metarodopsina en rodopsina, la afluencia continua de iones...

Investigación del potencial de residuo despolarizante prolongado (PDA) en fotorreceptores de Drosophila

Fuente: Wagner, K. et al., Estudio del tráfico de proteínas de membrana en células fotorreceptoras de Drosophila utilizando proteínas marcadas con eGFP. J. Vis. Exp. (2022). Este video muestra la visualización del tráfico de proteínas de membrana en células fotorreceptoras de Drosophila utilizando proteínas TRPL marcadas con eGFP. En él se detalla la preparación de moscas transgénicas para la obtención de imágenes, la captura de imágenes de fluorescencia de células fotorreceptoras y la...

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La técnica electrofisiológica de registro intracelular se demuestra y se utiliza para determinar las sensibilidades espectrales de las células fotorreceptoras individuales en el ojo compuesto de una mariposa.

Determinación de los fotorreceptores de la célula de sensibilidad espectral en un modelo de insectos<em&gt; En Vivo</em&gt; registros intracelulares

Los microelectrodos afilados permiten una caracterización electrofisiológica precisa de la salida de fotorreceptores e interneuronas visuales en Drosophila viva. Aquí mostramos cómo usar este método para registrar respuestas de voltaje de alta calidad de células individuales a la estimulación de luz controlada. Este método es ideal para estudiar el procesamiento de la información neuronal en ojos compuestos de insectos.

Método electrofisiológico para registrar las respuestas de voltaje intracelular<em&gt; Drosophila</em&gt; Los fotorreceptores y interneuronas a la luz Estímulos<em&gt; En Vivo</em

Aquí mostramos cómo cuantificar el número y la distribución espacial de las zonas activas sinápticas en los fotorreceptores de Drosophila melanogaster, resaltada con un marcador molecular codificada genéticamente, y su modulación después de la exposición prolongada a la luz.

Analizando Synaptic Modulación de<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Los fotorreceptores después de la exposición prolongada a la luz

Las grabaciones de células enteras de los fotorreceptores de Drosophila melanogaster permiten medir las colisiones oscuras espontáneas, los baches cuánticos, las respuestas macroscópicas a la luz y las relaciones tensión-corriente bajo diversas condiciones. En combinación con las herramientas de manipulación genética de D. melanogaster , este método permite el estudio de la vía omnipresente de señalización de los inositol-lípidos y su objetivo, el canal TRP.

Método electrofisiológico para grabaciones de abrazadera de voltaje de células enteras<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotorreceptores

Este trabajo presenta un método para cuantificar de forma rápida y precisa la pigmentación abdominal de Drosophila melanogaster mediante el análisis de imágenes digitales . Este método agiliza los procedimientos entre la adquisición del fenotipo y el análisis de los datos e incluye el montaje de las muestras, la adquisición de imágenes, la extracción de valores de píxeles y la medición de rasgos.

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Aquí, se describen métodos no invasivos para la localización de proteínas de membrana fotorreceptoras y la evaluación de la degeneración retiniana en el ojo compuesto de Drosophila utilizando fluorescencia eGFP.

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Aprende métodos electrofisiológicos para medir niveles de fotopigmento en fotorreceptores de Drosophila. Esta técnica permite detectar pequeñas anomalías en la fototransducción y realizar cribados genéticos de mutantes visuales.

Métodos electrofisiológicos para medir los niveles de fotopigmento en fotorreceptores de Drosophila

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