Name: Un ensayo basado en fluorescencia del potencial de membrana para el estudio funcional de alto rendimiento de dos canales iónicos endógenos en dos líneas celulares epiteliales (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 59 s
Description: Aprende a evaluar canales iónicos endógenos mediante un ensayo de fluorescencia del potencial de membrana en líneas celulares epiteliales Calu-3 y Caco-2. Este método de alto rendimiento permite estudiar la función del CFTR para avanzar en terapias contra la fibrosis quística.

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Los autores desean agradecer a Christopher Fladd y SPARC BioCentre en el Hospital para Niños Enfermos por su ayuda en la realización de los ensayos de potencial de membrana que miden CFTR y ENaC. Este trabajo fue apoyado por el Programa CFIT con fondos proporcionados por CF Canadá y la Fundación Sick Kids. Este trabajo fue financiado por el Gobierno de Canadá a través de Genome Canada y el Instituto de Genómica de Ontario (OGI-148). Este estudio fue financiado por el Gobierno de Ontario. S.X. fue apoyado por la Asociación Canadiense de Gastroenterología (CAG) Ph.D. beca.

1. Recubrimiento celular y diferenciación
<ol><li>Cultive células Calu-3 y Caco-2 en EMEM que contengan un 20% de suero fetal bovino (FBS) y un 1% de penicilina-estreptomicina (pluma/estreptococo) en un matraz T-75.</li>
	<li>Una vez que las células alcancen el 80-100% de confluencia, aspirar el medio del matraz T-75.</li>
	<li>Lave suavemente las células una vez con 10 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS).</li>
	<li>Añadir 2 ml de tripsina al 0,25%/EDTA al 0,1% precalentado a la monocapa celular y colocar el matraz T-75 a 37 °C durante aproximadamente 5 minutos para permitir que las células se levanten de la superficie del matraz de cultivo y se disocien en una suspensión unicelular.</li>
	<li>Una vez que las células se levantan de la superficie del matraz, neutralizar la reacción con 8 ml de medio de cultivo (paso 1.1) para un total de 10 ml de suspensión celular. NOTA: Disociar mecánicamente los grupos celulares en una suspensión unicelular con una pipeta serológica de 10 ml.</li>
	<li>Coloque las células en una placa de 96 pocillos (~140,000-150,000 células / pocillo) o una placa de 384 pocillos (~ 45,000-50,000 células / pocillo) en una confluencia del 30-40%.<ol><li>Para colocar una placa completa de 96 pocillos, agregue 1,5 ml de la suspensión celular a 18,5 ml del medio de cultivo en un tubo cónico de 50 ml. Después de mezclar, agregue 200 μL de la suspensión celular a cada pocillo.</li>
		<li>Para colocar una placa completa de 384 pocillos, agregue 1 ml de la suspensión celular a 17 ml del medio de cultivo en un tubo cónico de 50 ml. Después de mezclar, agregue 50 μL de la suspensión celular a cada pocillo. NOTA: Asegúrese de que no haya grupos de células, y las células individuales se distribuyen uniformemente en cada pocillo.</li>
	</ol></li>
	<li>Cambie el medio cada 2 días después del emplatado. Si las células no alcanzan la confluencia al mismo tiempo entre diferentes pocillos, deseche la placa y repita el paso 1.5.</li>
	<li>Una vez sembradas, espere a que las células alcancen el 100% de confluencia dentro de 3-5 días. Cambiar el medio 24 h antes de los estudios funcionales.</li>
</ol>2. Preparación de la solución tampón del ensayo funcional CFTR
<ol><li>Prepare la solución tampón libre de sodio y cloruro con los reactivos enumerados en la Tabla 1.</li>
	<li>Agregue los reactivos al grado de cultivo de tejidos, doble destilación deH2O(ddH2O). Permita que los reactivos se disuelvan (en un recipiente cerrado para evitar la evaporación) agitando durante la noche a temperatura ambiente.</li>
	<li>Una vez que la solución esté estable, mida el pH. Si el pH de la solución supera 7,4, añadir 1 M de solución de N-metil-D-glucamina (NMDG) gota a gota para ajustar el pH a 7,4. NOTA: No ajuste el pH de la solución con HCl porque la solución debe permanecer libre de cloruro.</li>
	<li>Deje que la solución se mezcle durante otros 30 minutos y mida la osmolaridad de la solución.<ol><li>Reducir la osmolaridad de la solución tampón a un rango fisiológico de 300 ± 5 mOsm/kg.</li>
	</ol></li>
	<li>Filtrar y almacenar la solución tampón en frascos estériles. NOTA: La solución puede conservarse a 4 °C durante un máximo de 6 meses. Si se almacena durante más de 6 meses, compruebe el pH y la osmolaridad a temperatura ambiente antes de usarlo.</li>
</ol>3. Ensayo funcional CFTR
<ol><li>Disuelva el colorante de potencial de membrana en la solución tampón libre de sodio y cloruro (0,5 mg de colorante/1 ml de solución tampón) y caliéntela a 37 °C. NOTA: Evite exponer el polvo de colorante potencial de membrana a la luz.</li>
	<li>Retire el medio de cultivo de las monocapas celulares de Calu-3 o Caco-2 y agregue la solución que contiene colorante a cada pocillo (195 μL por pocillo para una placa de 96 pocillos, 95 μL por pocillo para una placa de 384 pocillos). NOTA: Se pueden agregar hasta 112 μL por pocillo de placas de 384 pocillos.</li>
	<li>Deje que las células carguen el tinte durante 35 min a 37 °C y 5% deCO2.</li>
	<li>Mueva las células, cargadas con solución de colorante, al lector de placas de fluorescencia. Tome medidas de fluorescencia desde la parte inferior de la placa, con excitación = 530 ± 5 nm, emisión = 560 ± 5 nm</li>
	<li>Comience tomando lecturas de referencia continuas durante 5 minutos a intervalos de 30 s.</li>
	<li>Añadir 5 μL de una solución de baja concentración de forskoline o DMSO a cada pocillo para obtener una concentración final de 1 μM de forskoline (1x). Tome una lectura de estimulación durante 20 minutos con mediciones a intervalos de 15 s.<ol><li>Para el formato de placa de 96 pocillos, prepare la solución de forskoline de baja concentración (40 μM de forskoline (dilución 1:25)) de forskolina diluyendo 2 μL de solución madre de forskoline (1,000x) de 1 mM o DMSO en 48 μL de solución tampón sin sodio y sin cloruro. NOTA: La forskoline de baja concentración de 40 μM es seguida por una segunda dilución (dilución 1:40) en el siguiente paso para una concentración final de 1 μM de forskolina.</li>
		<li>Para el formato de placa de 384 pocillos, prepare la solución de baja concentración (20 μM de forskoline (dilución 1:50)) diluyendo 1 μL de solución madre de forskoline de 1 mM (1,000x) o DMSO en 49 μL de solución tampón sin sodio y sin cloruro. NOTA: La forskoline de baja concentración de 20 μM es seguida por una segunda dilución (dilución 1:20) en el siguiente paso para una concentración final de 1 μM de forskolina.</li>
	</ol></li>
	<li>Añadir 5 μL de solución de baja concentración de CFTRInh172 para obtener una concentración final de 10 μM de CFTRInh172. Tome una lectura de inhibición durante 15 min con mediciones a intervalos de 30 s.<ol><li>Para el formato de placa de 96 pocillos, prepare la solución CFTRInh172 de baja concentración (400 μM CFTRInh172 (dilución 1:25)) diluyendo 2 μL de una solución madre de CFTRInh172 (1,000x) de 10 mM en 48 μL de solución tampón libre de sodio y cloruro. NOTA: El CFTRInh172 de 400 μM de baja concentración es seguido por una segunda dilución (dilución 1:40) en el siguiente paso para una concentración final de 10 μM CFTRInh172.</li>
		<li>Para el formato de placa de 384 pocillos, preparar la solución CFTRInh172 de baja concentración (200 μM CFTRInh172 (dilución 1:50)) diluyendo 1 μL de solución madre de CFTRInh172 (1.000x) de 10 mM en 49 μL de solución tampón sin cloruro y sin sodio. NOTA: El CFTRInh172 de 200 μM de baja concentración es seguido por una segunda dilución (dilución 1:20) en el siguiente paso para una concentración final de 10 μM CFTRInh172.</li>
	</ol></li>
	<li>Cuantifique las mediciones de intensidad de fluorescencia de cada pozo y exporte los valores como una hoja de cálculo en formato de columna que contenga pozos individuales. Para calcular los cambios inducidos por la forskolina, divida las mediciones de RFU (unidades de fluorescencia relativa) de cada pocillo de la placa de 96 o 384 pocillos por la última medición de intensidad de fluorescencia de la lectura de referencia y grafiquelas.<ol><li>Alternativamente, cuantifique la respuesta de inhibición mediada por CFTRInh172 para confirmar mejor la especificidad de la función CFTR 12, ya que el tratamiento agudo con forskoline puede resultar en la despolarización de la membrana a través de la actividad de otros canales de cloruro, como SLC26A912.</li>
	</ol></li>
	<li>Mida las respuestas máximas como la medida máxima de intensidad de fluorescencia desde el inicio durante la estimulación con forskolina. Utilice esta medida o área bajo la curva para cuantificar la respuesta CFTR.</li>
</ol>4. Preparación de la solución tampón del ensayo funcional ENaC
<ol><li>Prepare la solución tampón sin cloruro con alto contenido de sodio con los reactivos enumerados en la Tabla 2.</li>
	<li>Una vez que la solución esté estable, mida el pH. Si el pH de la solución es inferior a 7,4, añadir 1 N solución de NaOH gota a gota para ajustar el pH a 7,4. NOTA: No ajuste el pH de la solución con HCl porque la solución debe permanecer libre de cloruro.</li>
	<li>Reducir la osmolaridad de la solución tampón a un rango fisiológico de 300 ± 5 mOsm/kg.</li>
	<li>Filtrar y conservar la solución tampón en frascos estériles a 4 °C durante un máximo de 6 meses. NOTA: Si el almacenamiento es más largo que 6 meses, verifique el pH y la osmolaridad a temperatura ambiente antes de usar.</li>
</ol>5. Ensayo funcional ENaC
<ol><li>Disuelva el colorante de potencial de membrana en la solución tampón sin cloruro con alto contenido de sodio (0,5 mg de colorante/1 ml de solución tampón) y caliéntela a 37 °C. NOTA: Evite exponer el polvo de colorante potencial de membrana a la luz.</li>
	<li>Retire el medio de cultivo de las monocapas celulares de Calu-3 o Caco-2 y agregue la solución que contiene colorante a cada pocillo (195 μL por pocillo para placas de 96 pocillos, 95 μL por pocillo para placas de 384 pocillos). NOTA: Evite exponer la solución de colorante a la luz.</li>
	<li>Deje que las células carguen el colorante durante 35 min a 37 °C y 5% deCO2.</li>
	<li>Mueva las células, cargadas con solución de colorante, al lector de placas de fluorescencia. Lea las mediciones de fluorescencia desde la parte inferior de la placa, con excitación = 530 ± 5 nm, emisión = 560 ± 5 nm.</li>
	<li>Comience tomando lecturas de referencia continuas durante 5 minutos a intervalos de 30 s.</li>
	<li>Para inhibir la función de ENaC, añadir 5 μL de solución de baja concentración amilorida o solución de baja concentración DMSO disuelta en la solución tampón de cloruro cero sodio para una concentración final de 10 μM amilorida.<ol><li>Para el formato de placa de 96 pocillos, preparar la solución de amilorida de baja concentración (400 μM amilorida (dilución 1:25)) diluyendo 2 μL de solución madre de amilorida (1.000x) de 10 mM en 48 μL de solución tampón sin cloruro con alto contenido de sodio. NOTA: La amilorida de baja concentración de 400 μM es seguida por una segunda dilución (dilución 1:40) en el siguiente paso para una concentración final de 10 μM de amilorida.</li>
		<li>Para el formato de placa de 384 pocillos, preparar la solución de amilorida de baja concentración (200 μM de amilorida (dilución 1:50)) añadiendo 1 μL de solución madre de amilorida (1.000x) de 10 mM en 49 μL de solución tampón sin cloruro con alto contenido de sodio. NOTA: La amilorida de baja concentración de 200 μM es seguida por una segunda dilución (dilución 1:20) en el siguiente paso para una concentración final de 10 μM de amilorida.</li>
	</ol></li>
	<li>Tome una lectura de inhibición durante 60 min con mediciones a intervalos de 45 s.</li>
	<li>Repita el paso 3.7 para el análisis de datos.</li>
	<li>Mida la respuesta de amilorida como el porcentaje de inhibición desde el inicio hasta el punto de meseta, aproximadamente 15-20 minutos después de la adición de amilorida. Utilice esta diferencia para cuantificar la respuesta ENaC.</li>
</ol>

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<li>Lu, C., Pribanic, S., Debonneville, A., Jiang, C., Rotin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+PY+motif+of+ENaC%2C+mutated+in+Liddle+syndrome%2C+regulates+channel+internalization%2C+sorting+and+mobilization+from+subapical+pool%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">The PY motif of ENaC, mutated in Liddle syndrome, regulates channel internalization, sorting and mobilization from subapical pool.</a> Traffic. 8 (9), 1246-1264 (2007).</li>
</ol>

Los autores declaran que no hay intereses contrapuestos.

Aquí, hemos descrito métodos basados en fluorescencia para medir la actividad de CFTR y ENaC en la línea celular de cáncer colorrectal epitelial, Caco-2, y la línea celular de cáncer de pulmón epitelial humano, Calu-3. Estos ensayos de potencial de membrana en líneas celulares epiteliales se pueden utilizar para confirmar la eficacia de compuestos moduladores de moléculas pequeñas, previamente identificados en sistemas de expresión heterólogos, antes de la validación final in vitro en cultivos epiteliales primarios derivados de pacientes. 
Es imperativo confirmar que las mediciones anteriores se atribuyen adecuadamente al canal de interés. Por ejemplo, la medición atribuida a CFTR debe mostrar dependencia de la expresión de la proteína CFTR y la fuerza impulsora electroquímica del cloruro, que es modulada por forskoline y el inhibidor CFTRInh-172. Del mismo modo, los cambios potenciales de membrana causados por amilorida de 10 μM pueden atribuirse a ENaC, si dependen de la expresión de proteínas ENaC y de una fuerza impulsora de sodio hacia adentro. Aunque hemos confirmado estas propiedades de ENaC en células MDCK después de la transfección con las tres subunidades de ENaC 2, aún no hemos confirmado formalmente que la respuesta de amilorida medida en célulasCaco-2 y Calu-3 sea conferida por ENaC. Esto es particularmente importante, ya que la amilorida puede modular la función del intercambiador de sodio-protones NHE3 además de ENaC13. Posiblemente, la hiperpolarización inducida por amilorida observada en este ensayo podría reflejar parcialmente los efectos indirectos de la acidificación intracelular en otros canales. Para confirmar que la hiperpolarización inducida por amilorida medida con este colorante sensible al potencial de membrana es conferida por ENaC en las líneas celulares anteriores y sistemas celulares más complejos, como los tejidos derivados de iPSC, estamos confirmando que esta actividad se pierde al eliminar una subunidad ENaC obligada (beta) en estas líneas. 
El éxito de estos ensayos requiere atención a varios factores. En primer lugar, los cultivos epiteliales deben ser confluentes y bien diferenciados. Para la medición de la función CFTR y ENaC, se deben colocar aproximadamente 145,000 celdas por pocillo en placas de 96 pocillos o 45,000 celdas por pocillo en placas de 384 pocillos. Una vez que las células epiteliales alcanzan la confluencia (dentro de los 3-4 días posteriores a la placa), permita 2-5 días de diferenciación. Este momento se determinó previamente en función de la expresión máxima de la proteína CFTR mediante inmunotransferencia14. Del mismo modo, se determinó el momento óptimo para la expresión funcional de ENaC en ambas líneas celulares, Calu-3 y Caco-2. 
Las monocapas no confluentes o el sobrecrecimiento celular conducen a una baja reproducibilidad entre réplicas técnicas. En los casos en que las células en pocillos individuales no alcanzan la confluencia al mismo tiempo, estas placas deben descartarse. Además, las lecturas basales inestables o la falta de respuestas de estimulación pueden ser una indicación de mala calidad celular, que debe excluirse del análisis. La reducción de las respuestas al activador de CFTR, forskolina, o al inhibidor de ENaC, amilorida, podría reflejar potencialmente el uso de células excesivamente transitadas15. Aunque no es un problema para las células Calu-3 y Caco-2, otras células o tejidos pueden no adherirse bien a las placas y pueden requerir un recubrimiento previo de los pocillos. Por ejemplo, en estudios previos, los cultivos de colangiocitos 2D se unieron a las placas utilizando recubrimiento de colágeno16. Alternativamente, la adherencia de los tejidos intestinales 2D se incrementó utilizando Poly-L-Lisina2. 
Además, al probar la modulación de los canales iónicos por moléculas pequeñas utilizando un ensayo basado en fluorescencia, es fundamental que se aborden los artefactos potenciales conferidos por las propiedades fluorescentes de las moléculas pequeñas. Para confirmar la especificidad de las respuestas funcionales, los ensayos de potencial de membrana pueden validarse aún más utilizando métodos electrofisiológicos convencionales, como los estudios de Ussing17. 
Después de confirmar que la respuesta detectada por los colorantes sensibles al potencial de membrana es conferida específicamente por el canal de interés, estos ensayos tienen un enorme potencial para validar moduladores prometedores de canales iónicos epiteliales en su contexto celular relevante. Esta plataforma puede cerrar la brecha entre las pantallas moduladoras de alto rendimiento en sistemas de expresión heteróloga y las mediciones bioeléctricas que requieren mucho tiempo en tejidos primarios de difícil acceso.

Los ensayos de actividad de alto rendimiento basados en fluorescencia de proteínas de canales recombinantes han sido altamente efectivos en la identificación de moduladores de moléculas pequeñas que tienen el potencial de convertirse en terapias futuras 1,2,3,4. Un método común para examinar bibliotecas de moléculas pequeñas en busca de moduladores de canales iónicos es medir los cambios en el potencial de membrana. Típicamente, estos cribados se realizan utilizando canales recombinantes expresados heterólogamente en líneas celulares como las células HEK-293 5,6,7.
Sin embargo, existe la necesidad de validar los "hits" en los tipos de células relevantes. Proponemos que es deseable un cribado secundario en líneas celulares relevantes que expresen endógenamente los canales de interés. Dicha pantalla secundaria identificará aquellos moduladores con mayor probabilidad de ser efectivos en los ensayos de validación final que dependen de tejidos humanos primarios menos accesibles.
También existe la necesidad de sistemas de ensayo que tengan la flexibilidad de informar la actividad de múltiples objetivos de canales iónicos en el mismo tipo de tejido. Por ejemplo, existe una literatura publicada sustancial que apoya el concepto de que CFTR y ENaC interactúan funcionalmente 8,9,10. Aunque se sabe que varias líneas celulares epiteliales bien estudiadas expresan tanto CFTR como ENaC, hasta la fecha, no se han descrito las condiciones de ensayo para estudiar ambos de una manera de alto rendimiento.
Este ensayo de potencial de membrana basado en fluorescencia es versátil, ya que emplea una sonda química exógena para medir la función de CFTR y ENaC, evitando la necesidad de sondas codificadas genéticamente11. Como prueba de principio, se estudian dos líneas celulares epiteliales de uso común como ejemplos para resaltar los pasos críticos necesarios para medir la actividad del canal tanto de CFTR como de ENaC.

<table><tbody><tr><td>Amilorida</td><td>Spectrum Chemical</td><td>TCI-A2599-5G</td><td>Disuelto en DMSO y almacenado a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>CFTRInh-172</td><td>CF Foundation Therapeutics</td><td></td><td>Disuelto en DMSO y almacenado a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>EMEM, 1xs</td><td>Wisent</td><td>320-005-CL</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>Wisent</td><td>080-450</td><td></td></tr><tr><td>FLIPR Dispositivo molecular de colorante de potencial de membrana</td><td></td><td>R8042</td><td>almacenado a 4 & grados; C</td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3917</td><td>Disuelto en DMSO y almacenado a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Ácido glucónico lactona o (D-(+)-ácido glucónico &delta;-lactona)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4750</td><td>Almacenado a temperatura ambiente</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Bioshop</td><td>HEP001.5</td><td>Almacenado a temperatura ambiente</td></tr><tr><td>Línea celular de adenocarcinoma bronquial humano (Calu-3)</td><td>ATCC</td><td>HTB-55</td><td></td></tr><tr><td>Línea celular de adenocarcinoma colorrectal epitelial humano (Caco-2)</td><td>ATCC</td><td>HTB-37</td><td></td></tr><tr><td>N-metil-D-glucamina (NMDG</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2004</td><td>Almacenado a temperatura ambiente</td></tr><tr><td>Solución de penicilina-estreptomicina</td><td>Wisent</td><td>450-200-EL</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>Wisent</td><td>311-010-CL</td><td></td></tr><tr><td>Gluconato de potasio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1847</td><td>Almacenado a temperatura ambiente</td></tr><tr><td>Gluconato de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9005</td><td>Almacenado a temperatura ambiente</td></tr></tbody></table>

un ensayo basado en fluorescencia del potencial de membrana para el estudio funcional de alto rendimiento de dos canales iónicos endógenos en dos líneas celulares epiteliales

A Fluorescence-Based Assay of Membrane Potential for High-Throughput Functional Study of Two Endogenous Ion Channels in Two Epithelial Cell Lines

Los estudios basados en fluorescencia son adecuados para ensayos de lectores de placas de alto rendimiento de células en cultivo. Se han empleado comúnmente para campañas de descubrimiento de fármacos dirigidas a proteínas recombinantes del canal iónico sobreexpresadas en células como las células HEK-293. Sin embargo, hay un énfasis creciente en el uso de líneas celulares relevantes para el tejido para estudiar los efectos de las intervenciones de moléculas pequeñas. El siguiente protocolo describe la adaptación de un ensayo de potencial de membrana basado en fluorescencia para el estudio de canales iónicos expresados endógenamente en líneas celulares epiteliales. El ensayo de potencial de membrana detalla un ensayo de alto rendimiento para la actividad del canal de cloruro del regulador de conductancia transmembrana de fibrosis quística (CFTR) en dos líneas celulares epiteliales comúnmente estudiadas, Caco-2 y Calu-3. Además, este documento describe una aplicación novedosa de este sistema para medir la actividad del canal epitelial de sodio (ENaC) en un formato de alto rendimiento en las mismas líneas celulares epiteliales. Juntos, estos ensayos basados en fluorescencia proporcionan una plataforma robusta y flexible para estudiar moduladores de moléculas pequeñas, dirigidos a dos canales epiteliales en un contexto celular relevante.

Para medir la actividad del canal CFTR, se incuban células adheridas bien diferenciadas en una solución extracelular de cloruro cero que contiene el colorante sensible al potencial de membrana. La función CFTR se detecta consistentemente como despolarización de la membrana después de la estimulación con forskolina. El flujo de salida de cloruro se detecta como un fuerte aumento de la fluorescencia en comparación con el control del vehículo. La señal de fluorescencia se mantiene hasta la adición del inhibidor CFTR (CFTRInh172), lo que lleva a una rápida disminución en la intensidad de fluorescencia, como se ve en las células Caco-2 (Figura 1A), y es reproducible tanto en células Caco-2 como en células Calu-3 (Figura 1B). La evaluación de la actividad CFTR como la diferencia en el cambio máximo en la fluorescencia después de forskoline o el DMSO (vehículo). Los puntos individuales variaron entre ± 3 desviaciones estándar de la estimulación media de forskoline (puntos negros) o el control DMSO (puntos grises), que correspondieron a un factor Z' de 0,586. Esta excelente puntuación indicó la reproducibilidad de este ensayo (Figura 1C). En caso de que haya una deriva menor en la línea de base, el impacto de la deriva se puede minimizar extrapolando la línea de base a lo largo de la traza después de la activación hasta el punto de adición del inhibidor. La respuesta se puede cuantificar como el área bajo la curva, con el límite inferior definido por la línea extrapolada.
La actividad de ENaC también se puede medir en las vías respiratorias confluentes y las células epiteliales colónicas cultivadas en placas de 96 pocillos. En contraste con el ensayo para la actividad del canal CFTR, estas células se sumergen en una solución con alto contenido de sodio, lo que permite la absorción de sodio a través de ENaC. Con la adición aguda de amilorida, la absorción de sodio se bloquea y las células experimentan hiperpolarización relativa de la membrana. Esto se muestra en células Caco-2 tanto en concentraciones bajas (10 μM) (Figura 2A) como altas (50 μM) de amilorida (Figura 2A, B) y en células Calu-3 con una alta concentración de amilorida (50 μM) (Figura 2B). El ensayo ENaC se amplió a un formato de placa de 384 pocillos y demostró una gran reproducibilidad en la inhibición de ENaC. Del mismo modo, los puntos individuales variaron entre ± 3 desviaciones estándar de la inhibición media de amilorida (puntos negros) o el control de DMSO (puntos grises). La respuesta ENaC en células Calu-3 reportó un factor Z' de 0.629 con tratamiento agudo usando amilorida (50 μM) (Figura 2C), lo que indica que estos parámetros apoyan el cribado de alto rendimiento.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63528/63528fig01.jpg"> Figura 1: Medición del canal CFTR como cambios en la despolarización de membrana en células Caco-2 y Calu-3. (A) Traza representativa de estimulación CFTR con forskoline (1 μM) y control DMSO en células Caco-2. (B) Diagrama de caja y bigotes de estimulación con forskoline en células Caco-2 y Calu-3 (**** P &lt; 0.0001, n &gt; 3 réplicas biológicas, n &gt; 3 réplicas técnicas). Las réplicas biológicas son pasajes independientes de la línea celular; Las réplicas técnicas se refieren a pozos independientes de las placas de pocillos múltiples. El diagrama de caja representa el valor medio; los límites representan IQR, con los bigotes definiendo los valores mínimos y máximos. (C) Diagrama de Bland-Altman de la respuesta CFTR reproducible con estimulación de forskoline en comparación con el control de DMSO en células Caco-2. Los puntos negros representan cambios absolutos máximos en la fluorescencia en respuesta a la estimulación de forskolina. Los puntos grises representan cambios en la fluorescencia en respuesta al control DMSO. Abreviaturas: CFTR = Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator; DMSO = dimetilsulfóxido; IQR = rango intercuartílico; Fsk = forskolina; ΔF/F0 = cambio en la fluorescencia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63528/63528fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63528/63528fig02.jpg"> Figura 2: Mediciones de inhibición de ENaC a través de hiperpolarización de membrana en células Caco-2 y Calu-3. (A) Traza representativa de inhibición de ENaC con amilorida (10 μM) en relación con el control de DMSO en células Caco-2. (B) Diagrama de caja y bigotes de inhibición de amilorida en células Caco-2 y Calu-3 (**** P &lt; 0.0001, n &gt; 3 réplicas biológicas, n &gt; 3 réplicas técnicas). (C) Diagrama de Bland-Altman de la respuesta ENaC reproducible con inhibición de amilorida en comparación con el control de DMSO en células Calu-3. Los puntos negros representan los cambios absolutos máximos en la fluorescencia en respuesta a la inhibición de amilorida. Los puntos grises representan cambios en la fluorescencia en respuesta al control DMSO. Abreviaturas: ENaC = canal epitelial de sodio; DMSO = dimetilsulfóxido; Amil. = amilorida; ΔF/F0 = cambio en la fluorescencia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63528/63528fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Nombre</td>
			<td>Concentración</td>
		</tr><tr><td>NMDG (N-metil-D-glucamina)</td>
			<td>150 mM</td>
		</tr><tr><td>Ácido glucónico lactona</td>
			<td>150 mM</td>
		</tr><tr><td>Gluconato de potasio</td>
			<td>3 mM</td>
		</tr><tr><td>HEPES</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 1: Reactivos y sus correspondientes concentraciones para el ensayo funcional CFTR con cero sodio y cloruro. Abreviatura: CFTR = Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Nombre</td>
			<td>Concentración</td>
		</tr><tr><td>Gluconato de sodio</td>
			<td>150 mM</td>
		</tr><tr><td>Gluconato de potasio</td>
			<td>3 mM</td>
		</tr><tr><td>HEPES</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 2: Reactivos y sus correspondientes concentraciones para tampón de ensayo funcional ENaC con alto contenido de sodio, cloruro cero. Abreviatura: ENaC = Canal epitelial de sodio (Na).

Este protocolo describe un método para el estudio de proteínas de membrana electrogénicas midiendo los cambios en el potencial de membrana. Este ensayo proporciona una plataforma para la lectura funcional de múltiples canales iónicos expresados endógenamente en líneas celulares epiteliales.

Un ensayo basado en fluorescencia del potencial de membrana para el estudio funcional de alto rendimiento de dos canales iónicos endógenos en dos líneas celulares epiteliales

Fluorescence-based studies are suitable for high-throughput plate reader assays of cells in culture. They have been commonly employed for drug discovery ...

Los ensayos de potencial de membrana basados en fluorescencia proporcionan métodos robustos para estudiar los efectos de los moduladores en los canales iónicos que se expresan endógenamente en las células epiteliales. Como prueba de concepto, estamos midiendo la función de dos canales iónicos en líneas celulares epiteliales bien conocidas. Este ensayo es versátil, ya que utiliza una sonda química exógena para medir la función del canal iónico, evitando así la necesidad de sondas codificadas genéticamente.Estos ensayos de alto rendimiento pueden identificar y caracterizar los efectos de los moduladores de moléculas pequeñas en los canales iónicos, que tienen el potencial de avanzar en las terapias para la fibrosis quística. Para empezar, cultivar células Calu-3 y Caco-2 en un matraz T75 que contenga EMEM con 20% de suero bovino fetal y estreptomicina al 1% de penicilina. Aspirar el medio del matraz T75 después de que las células alcancen 80 a 100% de confluencia.Lave suavemente las células con 10 mililitros de solución salina tamponada con fosfato. Luego, agregue 2 mililitros de tripsina al 0,25% precalentada, con 0,1% de EDTA, a la monocapa celular. Colocar el matraz a 37 grados centígrados durante aproximadamente cinco minutos.En este paso, asegúrese de que las células se levanten de la superficie del matraz y se disocien en la suspensión de una sola célula. Agregue 8 mililitros de medio de cultivo para neutralizar la reacción. Cuando las células alcancen 30 a 40% de confluencia, agregue 1.5 mililitros de la suspensión celular a 18.5 mililitros de medio de cultivo en un tubo cónico y mezcle.Agregue 200 microlitros de esta suspensión celular a cada pocillo de una placa de 96 pocillos para obtener aproximadamente 140, 000 células por pozo. Para colocar una placa completa de 384 pocillos, agregue 1 mililitro de la suspensión celular a 17 mililitros del medio de cultivo en un tubo cónico para obtener aproximadamente 50, 000 células por pocillo. Después de mezclar, agregue 50 microlitros de la suspensión celular a cada pocillo.Cambie el medio cada dos días y asegúrese de que las células alcancen el 100% de confluencia dentro de tres a cinco días en todos los pocillos simultáneamente. Cambiar el medio 24 horas previas a los estudios funcionales. Primero, prepare la solución tampón libre de sodio y cloruro con los reactivos enumerados en el protocolo de texto.Agregue los reactivos al agua de doble destilación de grado de cultivo de tejidos. Deje que los reactivos se disuelvan agitando durante la noche a temperatura ambiente. Después de que la solución esté estable, ajuste el pH a 7.4 agregando 1 solución NMDG molar gota a gota.Mezcle durante 30 minutos y ajuste la osmolaridad de la solución a un rango de 300 más o menos 5 milimoles por kilogramo. Filtrar y almacenar la solución tampón en frascos estériles. Luego, disuelva 0.5 miligramos del colorante de potencial de membrana en 1 mililitro de tampón libre de sodio y cloruro y caliente la solución a 37 grados centígrados.Retire el medio de cultivo de las monocapas celulares Calu-3 y Caco-2. Agregue 195 microlitros de la solución de colorante por pocillo para la placa de 96 pocillos y 95 microlitros por pocillo para una placa de 384 pocillos. Permita que las células carguen el tinte durante 35 minutos a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono.Luego, tome medidas de fluorescencia con excitación a 530 nanómetros y emisión a 560 nanómetros. Inicialmente, tome lecturas de referencia continuas durante cinco minutos a intervalos de 30 segundos. Luego, agregue 5 microlitros de solución de forskoline de 400 micromoles a cada pocillo de la placa de 96 pocillos, para obtener una concentración final de forskoline de un micromolar.Para la placa de 384 pocillos, agregue cinco microlitros de solución de forskolina de 20 micromoles. Tome una calificación de estimulación durante 20 minutos con mediciones a intervalos de 15 segundos. A continuación, agregue 5 microlitros de una solución de 400 micromolares de inhibidor de CFTR a la placa de 96 pocillos, para obtener una concentración final de 10 micromolares.A la placa de 384 pocillos, agregue 5 microlitros de inhibidor de CFTR micromolar 200. Tome una lectura de inhibición durante 15 minutos con mediciones a intervalos de 30 segundos. Cuantifique las mediciones de intensidad de fluorescencia de cada pozo y exporte los valores como una hoja de cálculo.en formato de columna, que contiene pozos individuales. Para calcular los cambios inducidos por forskolina, divida las medidas de la unidad de fluorescencia relativa de cada pocillo de la placa de 96 pocillos por la última medición de intensidad de fluorescencia de la lectura de referencia y tráquelas. Mida las respuestas máximas como la intensidad máxima de fluorescencia medida desde el inicio durante la estimulación de forskolina.Utilice esta medición, o área bajo la curva, para cuantificar la respuesta CFTR. La función CFTR se detectó como despolarización de membrana después de la estimulación de forskoline en células Caco-2. El flujo de fluoruro se detectó como un fuerte aumento de la fluorescencia en comparación con el DMSO como control del vehículo.Después de la estimulación con forskolina, la señal fluorescente se mantuvo hasta la adición del inhibidor de CFTR, después de lo cual hubo una rápida disminución en la intensidad de la fluorescencia. Este fenómeno fue reproducible tanto en células Caco-2 como en células Calu-3. La actividad de CFTR se calculó como la diferencia en el cambio máximo en la fluorescencia después de la estimulación con forskoline o DMSO.Los puntos individuales variaron entre más o menos 3 desviaciones estándar de la media en el caso de la estimulación con forskoline y el control DMSO, lo que indica la reproducibilidad del ensayo. Para confirmar la especificidad de las respuestas funcionales, estos ensayos de potencial de membrana pueden validarse aún más utilizando métodos electrofisiológicos convencionales, como la cámara de Ussing. Esta plataforma es capaz de cerrar la brecha entre las pantallas moduladoras de alto rendimiento y los sistemas de expresión heterólogos y las mediciones bioeléctricas que consumen mucho tiempo en tejidos primarios de difícil acceso.

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Un ensayo basado en fluorescencia del potencial de membrana para el estudio funcional de alto rendimiento de dos canales iónicos endógenos en dos líneas celulares epiteliales (Video) | JoVE Journal

Un ensayo basado en fluorescencia del potencial de membrana para el estudio funcional de alto rendimiento de dos canales iónicos endógenos en dos líneas celulares epiteliales

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