Name: Administración subconjuntival de vectores de virus adenoasociados en modelos de animales pequeños (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-16T14:15:00.000+00:00
Duration: 6 min 16 s
Description: Aprende a administrar vectores AAV por vía subconjuntival en modelos animales pequeños para terapia génica ocular. Este método mínimamente invasivo ofrece una entrega segura y efectiva para tratar enfermedades oculares.

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Los autores agradecen al Vector Core de la Universidad de Carolina del Norte por proporcionar los vectores scAAV8-GFP utilizados en este estudio, el CGIBD Histology Core y el laboratorio del Dr. Brian C. Gilger por su ayuda con los aspectos de evaluación clínica de este estudio. Este estudio fue apoyado por la Beca Postdoctoral Distinguida de Pfizer-NC Biotech y un Premio de Desarrollo Profesional de la Sociedad Americana de Terapia Génica y Celular y la Fundación de Fibrosis Quística. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente los puntos de vista oficiales de la Sociedad Americana de Terapia Génica y Celular o la Fundación de Fibrosis Quística.

Todos los procedimientos con animales se realizaron de acuerdo con las regulaciones del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Carolina del Norte en Chapel Hill. El uso de vectores AAV es un riesgo de riesgo biológico de nivel 1 de bioseguridad. Use el equipo de protección personal adecuado, incluida una bata de laboratorio, guantes y gafas protectoras cuando manipule AAV. Para el experimento descrito en la presente invención, se utilizó un vector AAV recombinante empaquetado con la cápside del serotipo 8 y que codifica un promotor genérico de citomegalovirus ubicuo (CMV) que controla la expresión de la proteína de fluorescencia verde (GFP).
1. Manipulación y almacenamiento de vectores AAV
<ol><li>Conservar el virus en un congelador a -80 °C en alícuotas de 100 μL en tubos de microcentrífuga siliconados o de baja retención.</li>
	<li>Descongele todas las soluciones madre vectoriales en hielo antes de usarlas. NOTA: Los colorantes como la solución de fluoresceína de sodio (a una concentración final de 0.1-2%) a menudo se mezclan con los vectores AAV para visualizar la solución inyectada. Además, la visualización de las soluciones inyectadas ayuda a detectar burbujas de aire y monitorear la distribución y / o fuga de AAV después de la inyección.</li>
</ol>2. Inyección subconjuntival (SCJ)
<ol><li>Montar el sistema de inyección.<ol><li>Para montar el sistema de inyección, coloque un estereomicroscopio y una bomba de jeringa en un gabinete de bioseguridad. NOTA: Se necesita una bomba de infusión para realizar inyecciones con alta precisión. En este documento, se utiliza una bomba de jeringa programable de infusión/extracción estándar (consulte la Tabla de materiales), que incluye un agarre hermético y una abrazadera de jeringa segura para jeringas que varían en volumen de 0.5 μL a 60 ml. Esta bomba también ofrece un rendimiento de flujo mejorado con alta precisión y caudales suaves de 1,28 pl/min a 88,28 ml/min.</li>
		<li>Corte el tubo de polietileno a una longitud de aproximadamente 50 cm (consulte la Tabla de materiales).</li>
		<li>Inserte el extremo del cubo de una aguja de 36 G en uno de los extremos del tubo. NOTA: Deslice el extremo del cubo de la aguja en el tubo durante ~ 3 mm para asegurarse de que no se produzcan fugas. La aguja de 36 G se utiliza para la inyección posterior de SCJ. Las agujas que oscilan entre 32 G y 36 G son los tamaños más utilizados para las inyecciones de SCJ. El uso de un hemostático para ayudar a este paso es muy recomendable para evitar el riesgo potencial de lesiones por objetos cortopunzantes.</li>
		<li>Llene una jeringa desechable de 3 ml con agua estéril; Inserte esta jeringa desechable en el lado del tubo opuesto a la aguja y enjuague el agua por todo el tubo/aguja. Repita este paso con alcohol al 70%.</li>
		<li>Repita el paso 2.1.4 tres veces más, alternando descargas con agua estéril y alcohol al 70%, para desinfectar la tubería y asegurarse de que no se observen fugas, obstrucciones o daños en toda la tubería.</li>
		<li>Use la jeringa desechable de 3 ml para llenar el tubo con agua estéril y deje el tubo conectado a la jeringa desechable.</li>
		<li>Coloque un trozo de parafilm en la superficie del banco y agréguele un charco de agua estéril (~ 1 ml). Sumerja la porción del tubo conectada a la aguja en el charco de agua estéril. Saque la jeringa desechable de la abertura del tubo en el extremo opuesto para evitar que entre aire en el sistema de tubos/agujas al retirar la jeringa. Deje la parte del tubo conectada a la aguja sumergida en el charco de agua. NOTA: Realice los procedimientos 2.1.4 a 2.1.7 en una campana laminar.</li>
		<li>Llene una jeringa/aguja Hamilton de 10 μL con agua estéril y evite la entrada de aire en la jeringa. Conecte la jeringa/aguja Hamilton al extremo abierto restante del tubo sumergiendo el tubo y la punta de la aguja de la jeringa Hamilton en el charco de agua estéril del parafilm.</li>
		<li>Pulse el botón de retroceso rápido en la pantalla de la bomba para mover el bloque del empujador a la longitud aproximada de la jeringa. Desenrosque las perillas de sujeción del soporte para aflojar los soportes de retención en el empujador y los bloques del soporte de la jeringa. Cargue la jeringa Hamilton en el bloque del soporte de la jeringa y asegúrela siguiendo las instrucciones del fabricante. NOTA: Para asegurar la jeringa, la abrazadera del cilindro de la jeringa debe estar apretada contra el cilindro de la jeringa; Sin embargo, no apriete demasiado, especialmente cuando use jeringas de vidrio. El émbolo de la jeringa debe estar asegurado por el soporte de retención del bloque del empujador.</li>
		<li>Ajuste los parámetros en la pantalla de configuración de la bomba.<ol><li>Presione el botón Force y establezca el nivel de fuerza en 30%. Acepte los cambios para volver a la pantalla de configuración .</li>
			<li>Presione el botón de inicio rápido y seleccione Método | Infundir/retirar.</li>
			<li>Para la jeringa, seleccione Hamilton 1700, vidrio, 10 μL. Seleccione la velocidad de perfusión y extracción y el volumen de inyección. NOTA: El nivel de fuerza se establece en función del tipo de jeringa/material/capacidad/fabricantes; Consulte las instrucciones del fabricante de fábrica para conocer la fuerza sugerida para cada jeringa. La velocidad de inyección utilizada en este experimento fue de 200 nL/s. Las inyecciones de SCJ son relativamente seguras, y hay menos preocupación por la inducción de presión intraocular elevada (PIO) resultante de la inyección. Una velocidad de inyección más lenta es a menudo deseable para ciertas aplicaciones para evitar el reflujo en la aguja y mantener la consistencia en las inyecciones entre los animales.</li>
		</ol></li>
		<li>Expulse el agua de la jeringa Hamilton, pero deje el tubo y la aguja de inyección llenos de agua. Tire ligeramente hacia atrás de la jeringa Hamilton presionando el botón Reverse para introducir una pequeña burbuja de aire en el tubo/aguja. NOTA: La burbuja de aire servirá como barrera entre el agua en el tubo y el fármaco terapéutico (en este caso, AAV), asegurando la precisión de la dosis administrada.</li>
		<li>Retirar el virus colocando la aguja de inyección en una alícuota de la cepa de virus. Asegúrese de que quede una burbuja de aire visible entre el virus y el agua en el tubo. NOTA: Los vectores AAV pueden unirse al tubo de plástico y a la aguja de metal, lo que lleva a una pérdida de virus y / o regímenes de dosificación inexactos. Por lo tanto, para garantizar el rigor, la reproducibilidad y una dosis precisa de AAV, se recomienda prerecubrir las superficies que posteriormente entran en contacto con el AAV. Para recubrir el sistema tubo/aguja con el virus, extraiga la solución de vector viral en el tubo/aguja e incubarla a temperatura ambiente durante 10 minutos para permitir la saturación del virus que se une a la pared de la aguja y/o tubo. Deseche el virus.</li>
	</ol></li>
	<li>Inyección de virus<ol><li>Anestesiar al ratón con anestesia inhalada (isoflurano) o inyección intraperitoneal de ketamina/xilazina/acepromazina. Confirme el plano quirúrgico de la anestesia por falta de respuesta a pellizcos firmes en los dedos del pie. NOTA: Use ratones hembra y/o macho C57BL/6J o BALB/c que tengan al menos 6 semanas de edad. Las dosis de ketamina/xilazina/acepromazina son las siguientes: ketamina a 70 mg/kg, xilazina a 7 mg/kg y acepromazina a 1,5 mg/kg.</li>
		<li>Aplique anestesia tópica en el ojo que recibirá la inyección. NOTA: Use clorhidrato de proparacaína al 0,1% y/o solución oftálmica de clorhidrato de tetracaína (0,5%) para anestesia tópica.</li>
		<li>Aplique ungüento tópico en el otro ojo que no recibirá una inyección para prevenir la sequedad y las lesiones.</li>
		<li>Coloque el ratón en el escenario microscópico y exponga el ojo del ratón bajo el microscopio estereoscópico.</li>
		<li>Coloque dos dedos en el párpado y aleje ligeramente el ojo del ratón para exponer la conjuntiva, que es la membrana interna que conecta el párpado con la esclerótica.</li>
		<li>Agarre la conjuntiva con fórceps.</li>
		<li>Suelte el párpado y sostenga la aguja con el bisel hacia arriba con la mano dominante.</li>
		<li>Inserte la aguja en la conjuntiva. Inserte la aguja hasta que el bisel esté completamente cubierto por la membrana conjuntival. Pon la aguja contra el globo. NOTA: Como la conjuntiva es una membrana transparente, la punta / bisel de la aguja es fácilmente visible.</li>
		<li>Inicie la inyección pulsando el botón Inicio con el pedal. NOTA: El movimiento del aire y el émbolo de Hamilton están sincronizados; Cualquier retraso indica exceso de aire en el sistema de inyección o posiblemente una conexión suelta entre los componentes del tubo, la aguja y/o la jeringa.</li>
		<li>Una vez finalizada la inyección, mantenga la aguja en su lugar durante 10 s antes de retirar la aguja de la conjuntiva para disminuir las posibilidades de reflujo. NOTA: Es común que aparezca una ampolla en el sitio de la inyección de SCJ. Tales ampollas normalmente se resuelven completamente dentro de unas pocas horas después de la inyección.</li>
		<li>Ponga una gota del gel lubricante tópico en los ojos del ratón para evitar la sequedad / lesión ocular, y luego coloque el mouse en una almohadilla térmica para recuperarse.</li>
		<li>Realice exámenes oculares como producción de lágrimas, PIO y examen con lámpara de hendidura junto con tinción de fluoresceína corneal para evaluar las anomalías oculares después de la inyección. NOTA: La producción de lágrimas se mide mediante una prueba de hilo rojo fenol, y a menudo se usa un tonómetro para examinar la PIO del ojo del ratón. Se informa que algunas inyecciones intraoculares, como las inyecciones intravítreas, podrían dar lugar a un aumento significativo de la PIO; sin embargo, los cambios en la PIO después de la inyección de SCJ no son evidentes 13,22,23,24.</li>
	</ol></li>
	<li>Examen de la biodistribución y la eficiencia de la transducción de AAV después de la inyección subconjuntival<ol><li>Para investigar la biodistribución del genoma viral y / o el perfil de transducción de los vectores AAV administrados a través de SCJ, eutanasia a los ratones por el método aprobado por AVMA. NOTA: En este experimento, los ratones fueron sacrificados 8 semanas después de la inyección.</li>
		<li>Para la biodistribución y la expresión transgénica en compartimentos oculares específicos, diseccionar el tejido relevante de interés, como los párpados, la córnea, la conjuntiva, el músculo ocular, la retina y el nervio óptico. Congelar rápidamente todos los tejidos y almacenar a -80 °C. Para examinar la biodistribución de AAV de cuerpo entero, recolecte órganos como los ganglios linfáticos submandibulares y el hígado, y congele rápidamente y guárdelos a -80 ° C.</li>
		<li>Usando un kit de extracción de ADN/ARN, recolecte ADNg y ARN de la misma muestra para examinar la expresión transgénica y la biodistribución de AAV, respectivamente. Si solo se desea la biodistribución del vector, use un kit de extracción de ADN para extraer el ADNg.</li>
		<li>Realizar qPCR y RT-qPCR estándar para determinar la biodistribución del vector AAV y la abundancia de ADNc utilizando cebadores/sondas específicos de transgenes vectoriales13,25.</li>
		<li>Para el análisis histológico, fije los ojos, insértelos en parafina y seccionarlos a un grosor de 5 μm. Realizar tinción estándar de inmunofluorescencia para revelar la expresión transgénica26.</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

La terapia génica mediada por AAV tiene un gran potencial para el tratamiento de enfermedades oculares. La terapia génica ocular actual se basa en dos vías principales de administración local, inyecciones intravítreas y subretinianas. Desafortunadamente, ambas rutas son invasivas y pueden causar complicaciones graves, como desprendimiento de retina, formación de cataratas y endoftalmitis. Por lo tanto, la investigación de rutas relativamente menos invasivas, como la inyección de SCJ, es de gran interés.
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Las enfermedades oculares abarcan una amplia gama de trastornos genéticos y adquiridos. En 2015, se estima que 36 millones de personas eran legalmente ciegas en todo el mundo, y más de 1.000 millones de personas sufren de al menos algún nivel de discapacidad visual, lo que destaca la necesidad de ampliar los esfuerzos de alivio en todos los niveles1. Los principales métodos para administrar medicamentos oculares incluyen la administración tópica y local, como gotas para los ojos o inyecciones subconjuntivales (SCJ), intracamerales, intravítreas y subretinianas. Aunque la terapia tópica no invasiva es el método de administración más común para los fármacos oftálmicos y se usa ampliamente para muchos trastornos del segmento anterior, la presencia de barreras anatómicas corneales presenta un desafío para la biodisponibilidad, biodistribución y eficacia de las sustancias administradas tópicamente, lo que sugiere que puede no ser la mejor ruta de tratamiento candidata para muchas enfermedades del ojo interno. Es probable que la inyección local en el compartimiento ocular específico afectado por la enfermedad sea un enfoque de administración de fármacos más eficaz y dirigido2. Sin embargo, los efectos adversos resultantes de las inyecciones repetidas pueden complicar las estrategias de administración. Idealmente, una terapia debe mantener la eficacia terapéutica a largo plazo después de una sola administración. Por lo tanto, la terapia génica es una opción prometedora para minimizar el número de inyecciones requeridas y proporcionar una expresión transgénica sostenida para el tratamiento de la enfermedad ocular 3,4.
Numerosos vectores virales y no virales están disponibles para la terapia génica; sin embargo, los vectores AAV son de gran interés debido a su excelente perfil de seguridad. AAV es un virus de ADN pequeño, monocatenario y sin envoltura que fue descubierto inicialmente como contaminante de una preparación de adenovirus en 1965 por Atchison et al.5,6 AAV fue posteriormente diseñado como un vector viral eficiente para la entrega de genes en la década de 1980 y se ha convertido en el vector de terapia génica de elección para muchas enfermedades, incluidos los trastornos oculares. en las últimas décadas. El más notable de ellos es el primer fármaco de terapia génica disponible comercialmente, voretigene neparvovec, que fue aprobado por la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos para tratar la amaurosis congénita de Leber, una rara enfermedad ocular posterior. Aunque voretigene neparvovec ha superado con éxito las barreras para el desarrollo clínico, sigue habiendo desafíos para la comercialización de terapias génicas oculares adicionales. Por ejemplo, voretigene neparvovec se administra a pacientes que retienen células retinianas viables mediante inyección subretiniana. Por lo tanto, los pacientes con formas más avanzadas de la enfermedad que carecen de células retinianas viables no son elegibles para el tratamiento, ya que no proporcionaría ningún beneficio clínico. Además, se observaron complicaciones conocidas asociadas con el procedimiento de inyección subretiniana, incluyendo inflamación ocular, cataratas, lagrimeo retiniano, maculopatía y dolor 7,8. Otras preocupaciones relacionadas con este procedimiento incluyen la posibilidad de hemorragia, desprendimiento de retina, endoftalmitis y revocación del estado inmune privilegiado ocular a través de la destrucción del tejido ocular 9,10,11,12. Por lo tanto, los esfuerzos para explorar rutas de administración de genes menos invasivas, como la inyección de SCJ, se han vuelto cada vez más importantes 13,14,15,16,17.
La conjuntiva es una membrana delgada que contiene 3-5 capas de células y conecta el ojo anterior con el párpado interior. Las inyecciones de SCJ se utilizan clínicamente para la administración de fármacos oftálmicos a los segmentos anterior y/o posterior del ojo para el tratamiento de enfermedades oculares como la degeneración macular asociada a la edad, glaucoma, retinitis y uveítis posterior18,19. Son relativamente simples de realizar, empleados rutinariamente para la administración de fármacos oftálmicos en un entorno ambulatorio20, algo indoloros, no comprometen el privilegio inmune ocular y permiten que los fármacos administrados se propaguen a través de una gran región periorbitaria que abarca el nervio óptico. Por lo tanto, las inyecciones de SCJ son una vía de administración atractiva para las aplicaciones de terapia génica AAV. Los serotipos naturales de AAV administrados mediante inyección de SCJ en ratones han sido previamente caracterizados por su seguridad, eficiencia de transducción, inmunogenicidad sérica, biodistribución y especificidad tisular13,16,21. Estos datos demostraron que la administración de genes a tejidos oculares individuales a través de la administración de SCJ es una posibilidad formal.
Este documento describe un protocolo simple y adaptable para la inyección de SCJ para entregar vectores AAV en un modelo de ratón. Para garantizar la reproducibilidad de este enfoque, se describe un sistema de inyección que consiste en un estereomicroscopio, una bomba de jeringa de infusión/extracción programable (que permite una velocidad y presión de inyección consistentes y precisas) y una jeringa extraíble hermética al gas junto con agujas de microinyección. Este sistema es adaptable para otras vías de administración intraocular como inyecciones intraestromales, intracamerales, intravítreas y subretinianas en animales pequeños. Además, a menudo se utiliza un tinte fluoresceína para permitir la visualización del sitio de inyección de AAV. Los pasos prácticos clave en la ruta de administración, la configuración de la plataforma de inyección, la preparación de la inyección y los consejos de la experiencia directa se discutirán en detalle. Finalmente, se discutirán brevemente las técnicas de validación comunes para la confirmación de la administración de AAV a los tejidos deseados.

<table><tbody><tr><td>36 G NanoFil Agujas World</td><td>Precision Instruments</td><td>NF36BV-2</td><td></td></tr><tr><td>AAV vector</td><td>&nbsp; Universidad de Carolina del Norte en Chapel Hill</td><td>&nbsp; /</td><td></td></tr><tr><td>Acepromazina</td><td>Henry Schein</td><td>NDC 11695-0079-8</td><td></td></tr><tr><td>anticuerpo anti-GFP</td><td>AVES labs Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cámara digital</td><td></td><td>Cannon Cannon EOS T5i</td><td></td></tr><tr><td>Kit de extracción de ADN/ARN</td><td>Qiagen</td><td>80204</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Pinzas</td><td>Fine Science Tools</td><td>F6521</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa Hamilton</td><td>Hamilton</td><td>7654-01</td><td></td></tr><tr><td>Tinta china</td><td>StatLab</td><td>NC9903975</td><td></td></tr><tr><td>solución inyectable de clorhidrato de ketamina</td><td>Henry Schein</td><td>NDC 0409-2051-05</td><td></td></tr><tr><td>Película resistente a la humedad</td><td>Parafilm</td><td>807-6</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de polietileno</td><td>Becton Dickinson y la empresa</td><td>427401</td><td></td></tr><tr><td>Proparacaína 0.1%</td><td>Bausch Health US</td><td>NDC 24208-730-06</td><td></td></tr><tr><td>Tonómetro de rebote</td><td>Tonovet</td>/Solución de fluoresceína sódica <td>Sigma-Aldich</td><td></td></tr> <tr><td></td><td></td><td>46960</td><td></td></tr><tr><td>Bomba estándar de infusión/extracción 11 Pico Plus Elite Bomba de jeringa programable</td><td>Harvard Bioscience</td><td>70-4504</td><td></td></tr><tr><td>Microscopía estereoscópica</td><td>Leica</td><td>Mz6</td><td></td></tr><tr><td>Solución oftálmica de clorhidrato de tetracaína al 0,5%</td><td>Solo Bausch y Lomb</td><td>Rx</td><td></td></tr><tr><td>Ungüento tópico</td><td>GenTeal</td><td>NDC 0078-0429-47</td><td></td></tr><tr><td>Xilacina</td><td>Akorn</td><td>NDC 59399-110-20</td><td></td></tr><tr><td>Zone-Quick Phenol Red Thread Box 100 hilos</td><td>ZONE-QUICK</td><td>PO6448</td><td></td></tr></tbody></table>

administración subconjuntival de vectores de virus adenoasociados en modelos de animales pequeños

Subconjunctival Administration of Adeno-associated Virus Vectors in Small Animal Models

Las enfermedades oculares incluyen una amplia gama de trastornos genéticos y adquiridos hereditarios que son objetivos atractivos para la administración local de fármacos debido a su relativa facilidad de acceso a través de múltiples vías de administración. Las inyecciones subconjuntivales (SCJ) ofrecen ventajas sobre otras vías de administración intraocular, ya que son simples, seguras y generalmente se realizan en un entorno ambulatorio. Las inyecciones de SCJ en animales pequeños generalmente requieren la asistencia de un microscopio quirúrgico debido al tamaño del ojo. Trabajos previos han demostrado que la inyección SCJ de serotipos específicos de virus adenoasociados (AAV) es una estrategia válida de administración de genes para la transducción dirigida de la superficie ocular, el músculo ocular, la córnea y el nervio óptico, proporcionando un enfoque potencial para el tratamiento de muchas enfermedades oculares.
En este documento, se presenta un protocolo detallado para las inyecciones de SCJ en un modelo de ratón utilizando un sistema de inyección que consiste en una bomba de jeringa de infusión/extracción programable (que permite una velocidad y presión de inyección consistentes y precisas) y una jeringa extraíble hermética al gas junto con agujas de microinyección. El sistema de inyección también es adaptable para otras vías de administración intraocular, como inyecciones intrastromales, intracamerales, intravítreas y subretinianas en animales pequeños. Aunque se describe la administración de vectores virales adenoasociados para estudios de terapia génica ocular, el protocolo aquí incluido también se puede adaptar para una variedad de soluciones oftálmicas en modelos de animales pequeños. Los pasos prácticos clave en la ruta de administración, la configuración de la plataforma de inyección, la preparación de la inyección y los consejos de la experiencia directa se discutirán en detalle. Además, también se discutirán brevemente las técnicas comunes de validación para la confirmación de la entrega de AAV a los tejidos deseados.

La solución inyectada en el espacio subconjuntival se presenta como una ampolla dependiendo del volumen de inyección. En este experimento, 7 μL de AAV (7 × 109 genomas virales (vg)/ojo) mezclados con fluoresceína a una concentración final de 0,1% se inyectaron con una aguja de 36 G bajo un microscopio estereoscópico, y la velocidad/presión de inyección se mantuvo constante utilizando una bomba de jeringa programable a 1 μL/s. Puede aparecer una ampolla al inyectarse (flecha). En la <strong ...

En este manuscrito, la inyección subconjuntival se demuestra como un método válido de administración de vectores para tejidos oculares en ratones utilizando un sistema de inyección que consiste en una bomba de jeringa de infusión/extracción y una jeringa extraíble hermética al gas acoplada con agujas de microinyección. Este sistema de inyección también es adaptable para otras vías de administración intraocular.

Administración subconjuntival de vectores de virus adenoasociados en modelos de animales pequeños

Ocular diseases include a wide range of inherited genetic and acquired disorders that are appealing targets for local drug delivery due to their relative ...

Este protocolo ofrece un método de administración de terapia génica a múltiples tejidos oculares de una manera segura, fácil y efectiva. También es adaptable para inyecciones intraestromales y subretinianas en animales pequeños. El uso de la vía subconjuntival de inyección es mínimamente invasivo.Presenta menos riesgos y es muy prometedor para la administración AV para tratar múltiples enfermedades oculares. Con más de 1.000 millones de personas en todo el mundo que sufren de discapacidad visual, el uso de un método seguro y fácil para la administración de medicamentos ofrece una amplia aplicabilidad para el tratamiento de muchas causas diferentes de ceguera. Los métodos de administración de genes descritos en este protocolo son de particular interés para aquellos que están desarrollando posibles estrategias de intervención y oftalmólogos en ejercicio, que eventualmente administrarán estos medicamentos a los pacientes.El mayor desafío para alguien que está realizando este protocolo por primera vez es probablemente la inserción de la aguja en el concepto de espacio conjuntival. Para comenzar, ensamble el sistema de inyección colocando un microscopio estereoscópico y una bomba de jeringa en un gabinete de bioseguridad. A continuación, corte el tubo de polietileno a una longitud de aproximadamente 50 centímetros.Inserte el extremo de una aguja de calibre 36 en un extremo del tubo. Luego llene una jeringa desechable de 3 mililitros con agua estéril e insértela en el lado del tubo opuesto a la aguja. Enjuague el tubo tres veces, alternando entre agua estéril y alcohol al 70% para desinfectar el tubo y asegurarse de que no haya fugas, obstrucciones o daños en todo el tubo.Usando la jeringa desechable de 3 mililitros, llene el tubo con agua estéril y deje el tubo conectado a la jeringa desechable. Luego coloque un trozo de espuma de paracho en la superficie del gabinete de bioseguridad y agréguele un charco de agua estéril. Sumerja la porción del tubo conectada a la aguja en el charco de agua estéril.A continuación, saque la jeringa desechable de la abertura del tubo para evitar que entre aire en el sistema de tubos al retirar la jeringa. Luego llene una jeringa Hamilton de 10 microlitros con agua estéril. A continuación, conecte la aguja de la jeringa Hamilton al extremo abierto del tubo sumergiendo la punta de la aguja de la jeringa Hamilton en el charco de agua estéril en la película para.Mantenga presionado el botón de retroceso rápido en la pantalla de la bomba para mover los bloques del empujador a la longitud aproximada de la jeringa. A continuación, desenrosque las perillas de sujeción del soporte para aflojar los soportes de retención en el empujador y los bloques del soporte de la jeringa. Posteriormente, cargue la jeringa Hamilton en el bloque del soporte de la jeringa y asegure la jeringa siguiendo las instrucciones del fabricante.Para ajustar los parámetros en la pantalla de configuración de la bomba, presione el botón "Forzar" y establezca el nivel de fuerza en 30%Luego acepte los cambios para volver a la pantalla de configuración. Presione el botón "Inicio rápido", seleccione Método y, a continuación, seleccione la opción Sólo infundir. Para la opción de jeringa, seleccione Hamilton 1700, luego haga clic en "Vidrio" y seleccione 10 microlitros.Más tarde, seleccione la velocidad de infusión y el volumen de inyección. Expulse el agua de la jeringa Hamilton mientras deja el tubo y la aguja de inyección llenos de agua presionando el botón Infuse". A continuación, retire el virus colocando la aguja de inyección en una alícuota de la cepa de virus.Luego, tire ligeramente hacia atrás de la jeringa Hamilton presionando el botón de retroceso para introducir una pequeña burbuja de aire en el tubo. Después de anestesiar al animal, agarre la conjuntiva con fórceps. Luego inserte la aguja en la conjuntiva hasta que el bisel esté completamente cubierto por la membrana conjuntival, y coloque la aguja contra el globo.Simultáneamente, inicie la inyección presionando el botón "Start" con el interruptor de pie. Para examinar la distribución del vector AAV, los tejidos oculares y circundantes se tiñeron con hematoxilina y eosina. Las secciones sagitales representativas demostraron que la dispersión de la tinta china se produjo principalmente adyacente a los músculos extraoculares en la superficie externa de la esclerótica en los tejidos conectivos sueltos perioculares.Para confirmar la transducción de AAV 8 autocomplementario a las ocho semanas después de la inyección, se examinó la abundancia de proteína de fluorescencia verde en las secciones transversales mediante tinción de inmunofluorescencia. Los resultados revelaron que los vectores AAV 8 transducieron eficientemente los músculos perioculares posteriores al ojo y la córnea. Para analizar la biodistribución del vector, se examinaron los números de copias del genoma del vector y los distintos compartimentos oculares en otros órganos, incluidos el hígado y el corazón, mediante la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa utilizando cebadores y sondas específicas para el transgén.La expresión del transgén se confirmó mediante la reacción cuantitativa en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa, que sugirió que la inyección subconjuntival de AAV 8 da como resultado la expresión transgénica en el párpado, la conjuntiva, la córnea y el nervio óptico. La burbuja de aire servirá como una barrera entre el agua en el tubo y el medicamento terapéutico. Esta técnica permite a otros investigadores explorar el uso de la vía de administración subconjuntival tanto para soluciones oftálmicas como para terapias génicas oculares para múltiples enfermedades.

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Investigación

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Medicine

Medicina

Aquí presentamos la inyección intracraneal de vectores AAV de marcaje fluorescente de las neuronas y la glía en la corteza visual.

Inyección intracraneal de adeno-asociado vectores virales

En este video, demostramos la entrega de genes basados en virus adenoasociados recombinantes en la cría de ratón. Este método ayuda a estudiar la expresión génica en las células objetivo.

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 Administración intravenosa de vectores de virus adenoasociados recombinantes en un modelo de rata 

Para investigar la permeabilidad de la barrera hematorretiniana y la integridad de la membrana limitante interna en modelos animales de enfermedad de la retina, utilizamos varias variantes de virus adenoasociados (AAV) como herramientas para etiquetar las neuronas de la retina y la glía. La expresión génica reportera mediada por virus se utiliza como indicador de la permeabilidad de la barrera retiniana.

Utilizando adeno-asociado virus como una herramienta para estudiar las barreras de retina en la enfermedad

La inyección subretiniana es una técnica quirúrgica para la entrega efectiva de genes al epitelio pigmentario de la retina en el ojo del ratón.  Aquí describimos un método fácil y replicable para la inyección subretiniana de vectores virales al epitelio pigmentario de la retina en ratones experimentales.

Limbal Inyección-Enfoque Subretinal de vectores virales para terapia génica en ratones epitelio pigmentario de la retina

Se cubren métodos para una entrega de genes de gran escala del sistema nervioso central en la rata. En este ejemplo, el propósito es imitar una enfermedad que afecta a la médula espinal entera. La transducción generalizada se puede utilizar para proporcionar una proteína terapéutica al SNC de una administración periférica, una sola vez.

Métodos y consejos para la administración intravenosa del Virus Adeno-asociado a las ratas y la evaluación de la transducción de señales del sistema nervioso Central

Aquí presentamos una técnica de inyección directa intratecal con clorhidrato de lidocaína 1% en una solución viral para asegurar la entrega eficiente de virus adeno-asociado a pequeños animales y establecer un sistema de puntuación para predecir la eficiencia de la transducción de señales en la central sistema nervioso según el grado de debilidad transitoria inducida por la lidocaína.

Directa de la inyección intratecal de virus Adeno-asociado recombinantes en ratones adultos

Este protocolo presenta cómo cuantificar la eficiencia de la transducción de AAV en la retina del ratón mediante PCR digital por gotas (dd-PCR) junto con la producción de AAV a pequeña escala, la inyección intravítrea, las imágenes de la retina y el aislamiento del ADN genómico de la retina.

Método de PCR de gotas digitales para la cuantificación de la eficiencia de la transducción AAV en la retina murina

Aquí detallamos un protocolo optimizado para la inyección de venas laterales de cola en ratones para administrar sistémicamente virus adenoasociados (AAV) en ratones adultos. Además, describimos los protocolos de los ensayos comúnmente utilizados para evaluar la transducción de AAV.

Liberación consistente de virus adenoasociados a través de la inyección lateral de la vena de la cola en ratones adultos

Aprende a administrar vectores AAV por vía subconjuntival en modelos animales pequeños para terapia génica ocular. Este método mínimamente invasivo ofrece una entrega segura y efectiva para tratar enfermedades oculares.

Administración subconjuntival de vectores de virus adenoasociados en modelos de animales pequeños

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