Name: Caracterización ecocardiográfica de la estructura, función y flujo coronario del ventrículo izquierdo en ratones neonatos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: Aprenda a evaluar la función cardíaca y el flujo coronario en ratones neonatos mediante ecocardiografía. Este protocolo permite el seguimiento longitudinal de la morfología ventricular izquierda y el desarrollo de intervenciones terapéuticas.

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Los autores agradecen a Chad M. Warren, MS (Universidad de Illinois en Chicago), por editar este manuscrito. Este trabajo fue apoyado por las subvenciones K01HL155241 de NIH / NHLBI y AHA CDA849387 a PCR.

Todos los experimentos fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Illinois en Chicago. Para los experimentos, se utilizaron ratones FVB / N de 7 días de edad. El protocolo se divide en preparación del ratón, adquisición de imágenes de ecocardiografía y cuidado de animales después de la obtención de imágenes.
1. Preparación del ratón
<ol><li>Obtenga los ratones de 7 días de edad de la jaula de cría. NOTA: A esta edad temprana, es difícil determinar el sexo del animal mediante un examen físico.</li>
	<li>Coloque el gel de ECG (consulte la Tabla de materiales) en las almohadillas de electrodos de la plataforma calentada. Coloque tiras de papel de aluminio (~ 1.5 in x 0.25 in) en la parte superior de las almohadillas de electrodos para extender el rango de electrodos y asegurar con cinta adhesiva (Figura 1A). Posteriormente, coloque el gel de ECG encima de las tiras de papel de aluminio. NOTA: Asegúrese de que el gel debajo de las tiras de papel de aluminio no se seque durante el procedimiento. Si eso ocurre, agregue más gel para mantener la conductividad.</li>
	<li>Corte un dedo de un guante de nitrilo y colóquelo para cubrir tanto el cono nasal de isoflurano/oxígeno en un lado como la nariz del ratón en el otro lado (Figura 1B).</li>
	<li>Coloque la cría de ratón en la cámara de inducción de isoflurano y comience la administración de isoflurano a una concentración del 2,5% impulsada por el oxígeno al 100% (Figura 1C).</li>
	<li>Coloque al cachorro anestesiado en posición supina en la plataforma de imágenes con las patas en la parte superior de las almohadillas de papel de aluminio y asegúrelo con cinta adhesiva. Asegúrese de que el circuito eléctrico esté completo y que el ECG esté grabando.</li>
	<li>Disminuya el suministro de isoflurano a 1.5% impulsado por 100% de oxígeno. Asegure el dedo recortado del guante alrededor de la nariz del cachorro con cinta adhesiva. Confirme la profundidad de la anestesia pellizcando las patas del cachorro.</li>
	<li>Coloque una capa gruesa de gel de ultrasonido precalentado en la parte superior del cuerpo del cachorro. Use dos rollos de gasa para mantener el gel de ultrasonido en su lugar (Figura 1D).</li>
	<li>Use una lámpara de calentamiento para mantener la temperatura corporal normal del cachorro (Figura 1E). NOTA: No se utilizó una sonda rectal para controlar la temperatura corporal en el estudio actual debido al pequeño tamaño del cachorro.</li>
</ol>2. Adquisición y análisis de imágenes ecocardiográficas
<ol><li>Realizar ecocardiografía transtorácica utilizando un instrumento de ecocardiografía equipado con un transductor de matriz lineal a 40 MHz para el modo B y a 32 MHz para Doppler (velocidad de fotogramas 233) (ver Tabla de materiales), siguiendo los protocolos de ecocardiografía de ratones adultos7,8,9.</li>
	<li>Evite ejercer una presión excesiva sobre la cavidad torácica del cachorro al colocar el transductor de eco durante la adquisición de imágenes ecocardiográficas. NOTA: Debido al pequeño tamaño del cachorro, el peso del transductor en sí puede resultar en una función cardíaca alterada o la muerte.</li>
	<li>Capture la vista PLAX del tracto de salida del ventrículo izquierdo y la aurícula izquierda.<ol><li>Coloque el transductor en el soporte, con la marca de índice hacia el hombro derecho del cachorro.</li>
		<li>Baje el transductor hasta que esté en contacto con el gel y visualice el tracto de salida del ventrículo izquierdo en modo B (Figura 2A).</li>
		<li>Utilice el modo M en las valvas aórticas para medir el diámetro máximo de la aurícula izquierda (LA) en la sístole terminal (Figura 2B, Tabla 1). Pulse el botón Cine Store para registrar los datos.</li>
	</ol></li>
	<li>Capture la vista PSAX del ventrículo izquierdo para medir las dimensiones de la cámara, el grosor de la pared, el flujo aórtico y el flujo pulmonar.<ol><li>Gire el transductor ~90° en el sentido de las agujas del reloj del PLAX para obtener la vista PSAX.</li>
		<li>Coloque la sonda al nivel de los músculos papilares y use el modo M para medir los diámetros internos del ventrículo izquierdo (LVID), el grosor del tabique interventricular (IVS) y la PW durante la sístole y la diástole (Figura 3A, Tabla 1). Pulse el botón Cine Store para registrar los datos.</li>
		<li>Calcule el RWT, un índice de hipertrofia, utilizando las dimensiones de la cámara diastólica de la siguiente manera 3,10: (PW + IVS al final de la diástole) / (LVID al final de la diástole)</li>
		<li>Mueva el transductor hacia la base del corazón y use el Doppler color para visualizar la arteria pulmonar. Presione PW Doppler para cuantificar la velocidad del flujo máximo pulmonar, los perfiles de flujo pulmonar, el tiempo de eyección pulmonar (PET) y el tiempo de aceleración pulmonar (PAT)11,12 (Figura 3B). Pulse el botón Cine Store para registrar los datos.</li>
		<li>Mueva el transductor más hacia la base y use Doppler color para visualizar el flujo aórtico (Figura 3C). Use PW Doppler para visualizar el flujo sanguíneo y medir el tiempo de eyección aórtica (AET). Pulse el botón Cine Store para registrar los datos.</li>
		<li>Calcular el Vcf (circ/seg)13,14, un indicador del rendimiento miocárdico, utilizando la diástole final de LVID (LVIDd), la sístole final de LVID (LVID) y AET de la siguiente manera (Tabla 1): (LVIDd - LVID) / (LVIDd x AET)</li>
	</ol></li>
	<li>Captura la vista apical de cuatro cámaras.<ol><li>Coloque la plataforma en la posición de Trendelenburg, inclínela hacia la izquierda y ajuste la sonda para visualizar las cuatro cámaras (Figura 4A).</li>
		<li>Use Doppler color para visualizar el flujo sanguíneo y Doppler PW en la punta de las valvas de la válvula mitral en el centro del orificio de la válvula mitral para registrar el flujo mitral. Pulse Cine Store para registrar los datos.</li>
		<li>En esta vista, calcule los siguientes parámetros 2,3,10 (Figura 4B y Tabla 1):<ol><li>Calcule la relación E / A, que es la velocidad máxima del flujo sanguíneo en la fase temprana de la diástole (E) sobre la velocidad máxima del flujo sanguíneo en la fase tardía de la diástole (A).</li>
			<li>Determine el tiempo de desaceleración de la onda E (DT), que es el tiempo desde el pico E hasta el final de la diástole temprana.</li>
			<li>Calcule el tiempo de relajación isovolumétrica del VI (IVRT), que es el tiempo desde el cierre de la válvula aórtica hasta la apertura de la válvula mitral.</li>
			<li>Calcule el tiempo de contracción isovolumétrica del VI (IVCT), que es el tiempo desde el cierre de la válvula mitral hasta la apertura de la válvula aórtica.</li>
		</ol></li>
		<li>Utilice Doppler tisular en el lado septal del anillo de la válvula mitral en una vista de cuatro cámaras para medir la velocidad máxima de relajación miocárdica en el llenado diastólico temprano (e') y el llenado diastólico tardío (a'), así como la velocidad máxima de contracción miocárdica sistólica (s') (Figura 4C y Tabla 1). Pulse el botón Cine Store para registrar los datos.</li>
	</ol></li>
	<li>Capture la vista PLAX modificada para examinar la arteria coronaria descendente anterior izquierda.<ol><li>Utilice una vista PLAX modificada15, moviendo el transductor lateralmente e inclinando el haz hacia la parte anterior (Figura 5A).</li>
		<li>Mueva la sonda y use Doppler color para visualizar el origen de la arteria coronaria principal izquierda (LCA) que se genera a partir de la aorta. Identificar la arteria LAD que se genera a partir del ACV y corre entre la pared anterior del ventrículo izquierdo y el tracto de salida del ventrículo derecho16,17. En esta posición, aplique PW Doppler para medir el flujo de LAD (Figura 5B). Pulse el botón Cine Store para registrar los datos.</li>
		<li>Calcule los siguientes parámetros de flujo de la arteria coronaria LAD (Figura 5C y Tabla 2): velocidad máxima del flujo coronario (CFV), CFV media e integral velocidad-tiempo (VTI). NOTA: Todos estos parámetros se miden a una concentración basal de isoflurano del 1,5% (línea de base).</li>
		<li>Aumente la concentración de isoflurano al 2,5% y espere 5 minutos para alcanzar el flujo máximo (Figura 5C). Pulse el botón Cine Store para registrar los datos. Calcule la CFR como la relación entre la CFV pico diastólica en el flujo máximo y la CFV pico diastólica al inicio del estudio 18,19,20 (Tabla 2): CFR = CFV pico diastólico (2,5%) / CFV pico diastólico (1,5%)</li>
	</ol></li>
</ol>3. Monitoreo y cuidado de animales después de la obtención de imágenes
<ol><li>Después de completar la imagen ecocardiográfica, limpie cuidadosamente el cachorro y deje que se recupere de la anestesia durante aproximadamente 2 minutos.</li>
	<li>Antes de devolver al cachorro a su jaula, unte al cachorro con la ropa de cama de la madre de la jaula para evitar el rechazo o la canibalización.</li>
	<li>Observe el comportamiento de la madre durante unos 30 minutos después del procedimiento. Si se observa un comportamiento agresivo, eutanasia al cachorro siguiendo las pautas de procedimiento animal.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

En la era de la medicina preventiva, se requiere una evaluación temprana de las alteraciones en la función cardiovascular para establecer el inicio de la enfermedad y diseñar terapias intervencionistas adecuadas. Los ratones se utilizan cada vez más como modelos preclínicos en la investigación cardíaca, y los estudios ecocardiográficos se realizan típicamente con ratones adultos jóvenes. Sin embargo, para estudiar el papel de las alteraciones genéticas o las intervenciones farmacológicas en las primeras etapas de las enf...

El objetivo general de este protocolo es examinar la morfología cardíaca, la función y el flujo de la arteria coronaria en crías de ratón neonatal de 7 días de edad mediante ecocardiografía. La razón detrás del desarrollo de esta técnica es determinar cambios tempranos en el flujo coronario y la función cardíaca en modelos de ratón de enfermedad cardíaca1. La naturaleza no invasiva de la ecocardiografía es ventajosa porque permite evaluar la función cardiovascular en condiciones fisiológicas y proporciona a los investigadores una herramienta de detección para el estudio de terapias dirigidas para tratar enfermedades cardiovasculares 2,3. Tradicionalmente, los estudios ecocardiográficos se realizan con ratones adultos jóvenes (4-6 semanas); Sin embargo, algunos modelos de ratones (es decir, modelos modificados genéticamente) ya exhiben cambios patológicos y disfunción cardíaca a esta edad. Por lo tanto, la investigación cardíaca utilizando modelos animales se ha centrado principalmente en agentes terapéuticos que mejoran o tratan la disfunción cardíaca. En contraste, más recientemente, los esfuerzos de investigación han sido redirigidos para centrarse en medidas preventivas e intervenciones tempranas en enfermedades cardíacas4.
Estudios previos han descrito el uso de la ecocardiografía para medir la función cardíaca en modelos de infarto de miocardio en ratones neonatos 5,6; sin embargo, estos estudios no lograron medir el flujo coronario y, lo que es más importante, no lograron registrar un electrocardiograma (ECG) y datos de frecuencia cardíaca (FC) durante el procedimiento, muy probablemente debido al pequeño tamaño de las extremidades de los cachorros, que no pudieron alcanzar las almohadillas de los electrodos. Superamos este problema en este protocolo conectando papel de aluminio a las extremidades para permitirles llegar a las almohadillas de electrodos y crear un circuito de ECG. Además, este protocolo describe y caracteriza el flujo de la arteria coronaria en ratones neonatos.
Este estudio obtuvo imágenes en modo B y modo M en vistas paraesternales de eje largo y corto para medir parámetros estructurales y funcionales 2,3. Los parámetros morfológicos incluyeron dimensiones de la aurícula izquierda, dimensiones del ventrículo izquierdo (VI), espesor de la pared del VI, masa del VI y espesor relativo de la pared (TRD). Los parámetros funcionales incluyeron fracción de eyección (FE), acortamiento fraccional (FS), gasto cardíaco (CO) y velocidad de acortamiento de la fibra circunferencial (Vcf). El Doppler de onda de pulso (PW) se utilizó para medir el flujo aórtico en la vista paraesternal de eje corto (PSAX) y para medir el flujo sanguíneo mitral en la vista apical de cuatro cámaras. La vista apical de cuatro cámaras también se utilizó para realizar Doppler tisular en la parte septal del anillo de la válvula mitral. El flujo coronario en la arteria coronaria descendente anterior izquierda (LAD) también se examinó mediante una vista de eje largo paraesternal modificado (PLAX). La reserva de flujo coronario (CFR) se calculó después de un desafío de estrés inducido por el aumento de la concentración de isoflurano.
El presente protocolo demuestra que los estudios ecocardiográficos pueden realizarse a una edad muy temprana en ratones neonatos, lo que permite el reconocimiento temprano de patologías cardíacas y estudios de seguimiento longitudinal de la hemodinámica del VI y los parámetros de flujo coronario en diferentes modelos de ratones. Esta técnica se puede utilizar para estudiar el papel de las alteraciones genéticas o las intervenciones farmacológicas en la función cardíaca en edades postnatales tempranas. Además, el protocolo proporciona una herramienta valiosa para determinar la aparición de enfermedades cardíacas tempranas en la vida, lo que permite a los investigadores desbloquear los mecanismos moleculares subyacentes a las etapas iniciales de las enfermedades cardíacas en diferentes modelos de ratón.

<table><tbody><tr><td>Agente depilante</td><td>Nair Hair Remover</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Electrode gel</td><td>Parker Laboratories</td><td>15-60</td><td></td></tr><tr><td>Ultrasonido de alta frecuencia</td><td>FUJIFILM VisualSonics, Inc.</td><td>Vevo 2100</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>MedVet</td><td>RXISO-250</td><td></td></tr><tr><td>Transductor de alta frecuencia de matriz lineal</td><td>FUJIFILM VisualSonics, Inc.</td><td>MS550D Pareja reproductora</td><td></td></tr> de <tr><td>ratones</td><td>Charles River Laboratories</td><td>FVB/N</td><td>Código de cepa 207</td></tr><tr><td>Gel de ultrasonido</td><td>Parker Laboratories</td><td>11-08</td><td></td></tr><tr><td>Vevo Lab Software</td><td>FUJIFILM VisualSonics, Inc.</td><td></td><td>Versión 5.5.1</td></tr></tbody></table>

caracterización ecocardiográfica de la estructura, función y flujo coronario del ventrículo izquierdo en ratones neonatos

Echocardiographic Characterization of Left Ventricular Structure, Function, and Coronary Flow in Neonate Mice

La ecocardiografía es un procedimiento no invasivo que permite la evaluación de parámetros estructurales y funcionales en modelos animales de enfermedad cardiovascular y se utiliza para evaluar el impacto de posibles tratamientos en estudios preclínicos. Los estudios ecocardiográficos generalmente se realizan en ratones adultos jóvenes (es decir, de 4 a 6 semanas de edad). La evaluación de la función cardiovascular neonatal temprana generalmente no se realiza debido al pequeño tamaño de las crías de ratón y las dificultades técnicas asociadas. Uno de los desafíos más importantes es que la corta longitud de las extremidades de los cachorros les impide alcanzar los electrodos en la plataforma de ecocardiografía. La temperatura corporal es el otro desafío, ya que los cachorros son muy susceptibles a los cambios de temperatura. Por lo tanto, es importante establecer una guía práctica para realizar estudios ecocardiográficos en crías de ratón pequeñas para ayudar a los investigadores a detectar cambios patológicos tempranos y estudiar la progresión de la enfermedad cardiovascular a lo largo del tiempo. El trabajo actual describe un protocolo para realizar ecocardiografía en cachorros de ratón a la temprana edad de 7 días de edad. También se describe la caracterización ecocardiográfica de la morfología cardíaca, la función y el flujo coronario en ratones neonatos.

Este estudio utilizó cachorros de ratón de 7 días de edad para caracterizar la morfología cardíaca, la función y el flujo de la arteria coronaria. El manejo del ratón debe hacerse con cuidado, y la plataforma del ratón debe adaptarse al pequeño tamaño de los cachorros, como se describe en la Figura 1. Una imagen representativa de la vista PLAX se muestra en la Figura 2A y el Video Suplementario 1. En esta vista, se utilizó el modo M para medir e...

El presente protocolo describe la evaluación ecocardiográfica de la morfología, función y flujo sanguíneo coronario del ventrículo izquierdo en ratones neonatos de 7 días de edad.

Caracterización ecocardiográfica de la estructura, función y flujo coronario del ventrículo izquierdo en ratones neonatos

Echocardiography is a non-invasive procedure that enables the evaluation of structural and functional parameters in animal models of cardiovascular ...

Este protocolo se puede utilizar para estudiar el papel de las alteraciones genéticas o las intervenciones farmacológicas en la función cardíaca y el flujo coronario en edades postnatales tempranas. La principal ventaja de esta técnica es el reconocimiento precoz de cardiopatologías y estudios de seguimiento longitudinal en hemodinámica ventricular izquierda y parámetros de flujo coronario en diferentes modelos de ratones. Los estudios ecocardiográficos en ratones neonatos son técnicamente desafiantes.Este protocolo está diseñado para estudiar la aparición temprana de enfermedades cardiovasculares en ratones neonatos que pueden permitir a los investigadores diseñar las medidas terapéuticas adecuadas. Comience colocando el gel de ECG en las almohadillas de electrodos de la plataforma calentada. Coloque tiras de papel de aluminio en la parte superior de las almohadillas de electrodos para ampliar el rango de electrodos y asegúrelas con cinta adhesiva.Posteriormente, coloque el gel de ECG encima de las tiras de aluminio. Asegúrese de que el gel debajo de las tiras de papel de aluminio no se seque durante el procedimiento. Si eso ocurre, agregue más gel para mantener la conductividad.Coloque al cachorro anestesiado en posición supina en la plataforma de imágenes y asegure el dedo del guante recortado alrededor de la nariz del cachorro. Coloque las patas encima de las almohadillas de papel de aluminio y asegúrelas con cinta adhesiva. Asegúrese de que el circuito eléctrico esté completo y que el ECG esté grabando.Use dos rollos de gasa para mantener el gel de ultrasonido en su lugar. Coloque una capa gruesa de gel de ultrasonido precalentado en la parte superior del cuerpo del cachorro. Use una lámpara de calefacción para mantener la temperatura corporal normal del cachorro.Realizar ecocardiografía transtorácica utilizando un instrumento de ecocardiografía equipado con un transductor de matriz lineal a 40 megahercios para el modo B y a 32 megahercios para Doppler siguiendo los protocolos de ecocardiografía de ratones adultos. Coloque el transductor en el soporte con la marca de índice hacia el hombro derecho del cachorro. Baje el transductor hasta que esté en contacto con el gel y visualice el tracto de salida del ventrículo izquierdo en modo B.Evite ejercer una presión excesiva sobre la cavidad torácica del cachorro al colocar el ecotransductor durante la adquisición de imágenes ecocardiográficas. Capture la vista del eje largo paraesternal del ventrículo izquierdo, el tracto de salida del ventrículo izquierdo y la aurícula izquierda. Use M-Mode en las valvas aórticas para medir el diámetro máximo de la aurícula izquierda en N-sístole.Grabe los datos pulsando el botón Cine Store. Gire el transductor alrededor de 90 grados en el sentido de las agujas del reloj del eje largo paraesternal para obtener la vista del eje corto paraesternal. Capture la vista paraesternal de eje corto del ventrículo izquierdo para medir las dimensiones de la cámara, el grosor de la pared, el flujo aórtico y el flujo pulmonar.Coloque la sonda al nivel de los músculos papilares y use el modo M para medir los diámetros internos del ventrículo izquierdo y el grosor de la pared durante la sístole y la diástole. Grabe los datos pulsando el botón Cine Store. Mueva el transductor hacia la base del corazón y use el Doppler color para visualizar la arteria pulmonar.Presione Pulse Wave Doppler para cuantificar la velocidad del flujo máximo pulmonar, los perfiles de flujo pulmonar, el tiempo de eyección pulmonar y el tiempo de aceleración pulmonar. Grabe los datos pulsando el botón Cine Store. Mueva el transductor más hacia la base y use Doppler color para visualizar el flujo aórtico.Utilice el Doppler de ondas de pulso para visualizar el flujo sanguíneo y medir el tiempo de eyección aórtica. Grabe los datos pulsando el botón Cine Store. Para capturar la vista apical de cuatro cámaras, coloque la plataforma en la posición de Trendelenburg, inclínela hacia la izquierda y ajuste la sonda para visualizar las cuatro cámaras.Use Doppler color para visualizar el flujo sanguíneo y Doppler de onda de pulso en la punta de las valvas de la válvula mitral en el centro del orificio de la válvula mitral para registrar el flujo mitral. Grabe los datos pulsando el botón Cine Store. Use Doppler tisular en el lado septal del anillo de la válvula mitral en una vista de cuatro cámaras para medir la velocidad máxima de relajación miocárdica en el llenado diastólico temprano y el llenado diastólico tardío, así como la velocidad máxima de contracción miocárdica sistólica.Grabe los datos pulsando el botón Cine Store. Capture la vista modificada del eje largo paraesternal para examinar la arteria coronaria descendente anterior izquierda. Utilice una vista de eje largo paraesternal modificada, moviendo el transductor lateralmente.Mueva la sonda y use Doppler color para visualizar el origen de la arteria coronaria principal izquierda que se genera a partir de la aorta. Identificar la arteria descendente anterior izquierda que se genera desde la arteria coronaria principal izquierda y corre entre la pared anterior del ventrículo izquierdo y el tracto de salida del ventrículo derecho. En esta posición, mida el flujo de la arteria coronaria descendente anterior izquierda presionando Doppler de onda de pulso.Grabe los datos pulsando el botón Cine Store. Aumente la concentración de isoflurano al 2,5% y espere cinco minutos para lograr el flujo máximo. Grabe los datos pulsando el botón Cine Store.En la vista del eje largo paraesternal, se utilizó el modo M para medir el diámetro de la aurícula izquierda. La vista paraesternal de eje corto se utilizó para medir las dimensiones de la cámara ventricular izquierda y el grosor de la pared, el flujo pulmonar y el flujo aórtico. La vista apical de cuatro cámaras se utilizó para examinar las velocidades de flujo sanguíneo a través de la válvula mitral, así como las velocidades de relajación y contracción miocárdica en el anillo de la válvula mitral.La vista de eje largo paraesternal modificada se utilizó para examinar los parámetros de flujo de la arteria coronaria descendente anterior izquierda. Los valores aumentados de la velocidad máxima del flujo coronario, la velocidad media del flujo coronario y la integralidad velocidad/tiempo cinco minutos después del incremento del isoflurano confirmaron la respuesta esperada a la hiperemia en los ratones neonatos. Debido al pequeño tamaño de los cachorros, es importante mantener su temperatura corporal normal y colocar tiras de papel de aluminio en sus extremidades para llegar a las electroalmohadillas y crear un circuito de ECG.

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