Un enfoque de ensayo cometario de alto rendimiento para evaluar el daño del ADN celular
May 10th, 2022
El ensayo del cometa es un medio popular para detectar daños en el ADN. Este estudio describe un enfoque para ejecutar diapositivas en variantes representativas del ensayo de cometas. Este enfoque aumentó significativamente el número de muestras al tiempo que disminuyó el tiempo de ejecución del ensayo, el número de manipulaciones de portaobjetos y el riesgo de daño a los geles.
El ensayo cometa es ampliamente utilizado para evaluar la genotoxicidad. Nuestro protocolo ofrece una serie de ventajas metodológicas sobre el ensayo estándar de cometas. Nuestra tecnología se centra en sostener las diapositivas estándar de cometas verticalmente y procesarlas en lotes de 25 en un bastidor especialmente diseñado.
Esto incluye electroforesis, por lo que el tanque es más pequeño, usa menos amortiguador y tiene enfriamiento integrado. Al mantenerse en un estante, los delicados geles de las guías están más protegidos y pasan de una solución a otra en 25 segundos. Usando nuestro protocolo de cometas de sangre, los investigadores pueden usar un pinchazo de sangre para estudiar el daño del ADN en humanos, otras especies y una amplia variedad de exposiciones ambientales potencialmente genotóxicas.
Cualquiera de los diferentes formatos para el ensayo de cometas que utilizan portaobjetos de microscopio como soporte sólido para los geles de cometa son susceptibles a nuestro enfoque. La parte crucial de esta técnica es cargar muestras después de mezclarlas con agarosa LMP. Las muestras deben cargarse rápidamente sin hacer burbujas y cubrirse con un cubreobjetos de inmediato antes de solidificarse.
Para comenzar, prepare agarosa de bajo punto de fusión al 0.6% en PBS y colóquela en un baño de agua a 37 grados centígrados. Etiquete el extremo esmerilado de las diapositivas prerecubiertas con el nombre, la fecha y la información del tratamiento con un marcador o lápiz permanente. Coloque una placa de enfriamiento en un banco plano e inserte dos paquetes de enfriamiento congelados en el cajón deslizante debajo de la superficie metálica.
Luego, coloque las diapositivas en la placa de enfriamiento para enfriar previamente durante uno o dos minutos. Centrifugar y retirar el sobrenadante de los tubos de muestra y colocarlos inmediatamente de nuevo en hielo. Resuspender el pellet celular con 200 microlitros de agarosa de bajo punto de fusión al 0,6% y mezclar por pipeteo.
A continuación, agregue 80 microlitros de células que contienen agarosa en un portaobjetos refrigerado y coloque rápidamente un cubreobjetos sobre el gel. Deje que el gel se asiente en la placa de enfriamiento durante uno o dos minutos. Mientras tanto, prepare 500 mililitros de solución de trabajo de tampón de lisis y viértala en el plato de lisis.
Después de que los geles se hayan fraguado, retire los deslizamientos de la cubierta rápidamente sosteniendo suavemente el portaobjetos entre el pulgar y el índice y deslizando el deslizamiento de la cubierta fuera del gel. Luego, coloque las diapositivas dentro de un portador de diapositivas con todas las marcas de puntos negros en las diapositivas orientadas en la misma dirección. Coloque el portaportaobjetos dentro del plato de lisis.
Cierre la tapa del plato de lisis y póngalo para la incubación. Retire con cuidado el portaportaobjetos de la placa de lisis sin alterar los geles. Coloque suavemente el portaportaobjetos en un plato de lavado precargado con agua doble destilada helada.
Asegúrese de que las diapositivas estén completamente sumergidas y deje la configuración durante 30 minutos. Coloque un paquete de enfriamiento congelado debajo del tanque de electroforesis para mantener una temperatura de amortiguación óptima. Luego, agregue una solución de trabajo de electroforesis helada al tanque y transfiera el portador de la corredera a él.
Oriente los portaobjetos de tal manera que los geles que contienen células apunten hacia el cátodo. Incubar los portaobjetos en el tanque de electroforesis durante 20 minutos para permitir que el ADN se desenrolle. Luego, encienda la fuente de alimentación para realizar la electroforesis durante 20 minutos a 1.19 voltios por centímetro.
Una vez completada la electroforesis, apague la fuente de alimentación y retire el portaobjetos del tanque de electroforesis. Deje que el portaportadiapositivas drene sobre papel de seda durante 30 segundos. A continuación, coloque el portaportaobjetos en un plato que contenga tampón de neutralización y déjelo durante 20 minutos.
Después de esto, colóquelo en un plato de lavado que contenga agua doble destilada helada y déjelo durante 20 minutos. Después del lavado, retire el portaportaobjetos del agua y deje que los portaobjetos se sequen en una incubadora a 37 grados centígrados durante una hora. Para rehidratar los portaobjetos, transfiera el portaportaobjetos a un plato de lavado que contenga agua doble destilada helada y déjelo durante 30 minutos.
Luego, coloque el portaportaobjetos en un plato de tinción que contenga 2.5 microgramos por mililitro de solución de yoduro de propidio. Cierre la tapa del plato de tinción e incube durante 20 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente. Después de la incubación, transfiera el portaportaobjetos a un plato separado y lávelo con agua doble destilada helada durante 20 minutos.
Retire el portaportaobjetos del plato y séquelo completamente en la oscuridad, ya sea en una incubadora de 37 grados centígrados o a temperatura ambiente. Después de que las diapositivas se sequen completamente, guárdelas en una caja de diapositivas en la oscuridad hasta que estén listas para el análisis de imágenes. Los queratinocitos humanos fueron irradiados con diferentes dosis de UVA y UVB o tratados con peróxido de hidrógeno 50-micromolar para inducir daño en el ADN.
El voltaje óptimo fue de 1,19 voltios centímetro, ya que induce la respuesta más sensible y el mayor porcentaje de ADN de cola. La sangre entera humana fue irradiada con diferentes dosis de UVA y tratada con diferentes concentraciones de Fpg. El ensayo de cometa alcalino de alto rendimiento reveló que los niveles óptimos de daño en el ADN se indujeron con cuatro unidades por mililitros de Fpg.
La línea celular de cáncer de ovario SK-OV-3 se trató con una combinación de cisplatino y peróxido de hidrógeno. Las células no expuestas no mostraron daño. La exposición al peróxido de hidrógeno solo generó un momento medio significativo de la cola de olivo en comparación con las células en las que se indujeron los enlaces cruzados intrahebra del ADN.
Después del tratamiento con cisplatino 100 micromolar, los enlaces cruzados intrafilamentos de ADN aumentaron con un pico a las 12 horas, después de lo cual los niveles disminuyeron a cero después de 30 horas. Es esencial colocar la bolsa de hielo en el tanque de electroforesis e incubar portaobjetos durante 20 minutos para desenrollar el ADN antes de la electroforesis. Este paso ayudará al ADN dañado a viajar por corriente. Ejecutar el ensayo con portaobjetos colocados verticalmente nos permitió automatizar el ensayo del cometa.
Además, nuestra técnica ha simplificado el ensayo de cometas para la investigación.
Visión general
Este estudio presenta un enfoque avanzado al ensayo del cometa, un método ampliamente utilizado para detectar daño al ADN. Al verticalizar las diapositivas y procesarlas en lotes, el método mejora el rendimiento de las muestras mientras reduce el tiempo y los riesgos de manipulación.
Componentes clave del estudio
Área de investigación
- Evaluación de genotoxicidad
- Detección de daño al ADN
- Optimización del ensayo del cometa
Fundamentos
- El ensayo del cometa es una herramienta crítica en la investigación genética.
- Los métodos estándar pueden ser lentos y laboriosos.
- Mejorar el rendimiento y minimizar el daño al gel es esencial para estudios efectivos.
Métodos utilizados
- Protocolo modificado del ensayo del cometa que utiliza diapositivas verticales.
- Aplicación a muestras de sangre humana y de otras especies.
- Electroforesis con enfriamiento integrado y uso optimizado de tampones.
Principales resultados
- El nuevo método permite procesar 25 muestras simultáneamente.
- Protege mejor los geles durante la manipulación.
- Validado a través de estudios sobre la respuesta al daño del ADN por exposiciones a UVA/UVB y químicos.
Conclusiones
- El estudio demuestra con éxito un enfoque simplificado del ensayo del cometa.
- Los hallazgos contribuyen a avances en la investigación y metodología de la genotoxicidad.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
High-throughput comet assay platforms address a critical bottleneck in genotoxicity assessment by enabling rapid, scalable quantification of DNA damage across diverse cell types. This innovation enhances predictive confidence in early discovery and toxicity screening, supporting risk-adjusted portfolio decisions and mechanistic de-risking. Streamlined workflows and automation readiness position this approach as a reusable asset for enterprise-scale R&D pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables robust interrogation of DNA damage pathways for target validation.
- Supports mechanistic de-risking by quantifying genotoxic responses to candidate compounds.
- Facilitates functional assessment of DNA repair mechanisms in disease-relevant systems.
- Improves predictive confidence for triaging early-stage assets based on genotoxicity profiles.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized, high-throughput DNA damage quantification for compound screening.
- Reduces assay variability and manual handling, supporting reproducibility and scalability.
- Enables rapid evaluation of multiple conditions or exposures in parallel.
- Prepares validated biological systems for downstream mechanistic or phenotypic screening.
Translational & Preclinical Research
- Aligns DNA damage readouts with translational biomarker strategies in preclinical models.
- Supports continuity from in vitro discovery to in vivo validation of genotoxic effects.
- Informs risk-adjusted advancement decisions by quantifying DNA repair and damage kinetics.
- Provides mechanistic insight into compound-induced genotoxicity relevant to disease pathogenesis.
Pipeline & Workflow Integration
This high-throughput comet assay integrates into the discovery-to-preclinical continuum, enabling early detection of genotoxic liabilities and supporting lead identification and optimization.
- Discovery Biology: Quantifies DNA strand breaks and crosslinks to clarify genotoxic mechanisms and biological risk.
- Screening: Provides reproducible, quantitative outputs for compound prioritization and toxicity triage.
- Analytics: Generates standardized measurements (e.g., Olive tail moment, % tail DNA) for cross-condition comparison.
- Translational Research: Bridges in vitro findings to in vivo models for biomarker alignment and risk assessment.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, automation-compatible platform for repeated genotoxicity testing across programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in genotoxicity assessment.
- Operational Value: Streamlines workflows, reduces reagent use, and minimizes manual slide handling.
- Strategic Value: Enables faster go/no-go decisions and improves capital efficiency by early identification of genotoxic risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of assets with favorable DNA damage profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in DNA damage quantification and comet assay interpretation.
- Needs purpose-built slide racks, integrated cooling, and compatible electrophoresis infrastructure.
- Demands cross-team standardization of sample preparation and analysis protocols.
- Adaptable to various cell types and exposure conditions with validated controls.
- Dependent on robust image analysis and statistical evaluation for reliable output.
