Name: Evaluación de la oxidación del sustrato energético in vitro con 14capturas de CO2 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-23T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Aprende a medir la oxidación de sustratos energéticos in vitro mediante captura de 14CO2 en células óseas. Este método adaptable facilita el estudio de trastornos metabólicos y la flexibilidad energética celular.

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El trabajo fue apoyado en parte por la subvención R01 AR060456 (FL) de los NIH. Agradecemos al Dr. Michael Robinson y Elizabeth Krizman (The Children's Hospital of Philadelphia) por su generosa ayuda con el mostrador de centelleo.

El uso de materiales radiactivos (RAM) requiere la aprobación previa de un comité de seguridad designado en cada institución. Las RAM utilizadas en este protocolo han sido aprobadas por Environmental Health &amp; Radiation Safety (EHRS) en la Universidad de Pensilvania. El uso de animales requiere la aprobación previa del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) en la institución de origen. El siguiente estudio fue aprobado por IACUC en el Hospital de Niños de Filadelfia.
1. Preparación de soluciones madre para 14sustratos marcados con C
<ol><li>Haga 4 mM de solución madre de albúmina sérica bovina (BSA) mezclando 11 g de BSA y 33.1 ml de solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco y agite suavemente a temperatura ambiente durante ~ 3 h hasta que BSA se disuelva por completo. Caliente la solución madre de BSA en un baño de agua a 70 °C antes de su uso.</li>
	<li>Secado al aire de 50 μCi 14C-oleato (50 μCi/μmol en etanol) en el vial con la tapa apagada durante 8 h en una campana de trabajo RAM designada. Agregue 312.5 μL de H2O y luego 3.5 mg (11.5 μmol) de oleato de sodio. Homogeneizar.</li>
	<li>Caliente la solución resultante a 70 °C en un baño de agua. Agregue 0.9375 ml de la solución madre BSA precalentada para producir una solución madre de oleato caliente de 10 mM (que contiene una relación 1: 11.5 de 14C-oleato a oleato sin etiquetar). Alícuota la solución madre y guárdela a -20 °C para su uso a largo plazo.</li>
	<li>Use 14C-glucosa y 14C-glutamina directamente después de la descongelación.</li>
</ol>2. Preparación de un medio que contenga 14sustratos marcados con C
NOTA: Para garantizar concentraciones confiables de sustratos de energía en el medio, se deben usar medios personalizados con sustratos frescos agregados poco antes de su uso. Aquí, se utiliza un Medio Esencial Mínimo (MEMα) hecho a medida sin glucosa, piruvato, glutamina, rojo fenol o bicarbonato de sodio. Sin embargo, se debe determinar un medio óptimo para cada tipo de célula.
<ol><li>Reconstituir 8,67 g del polvo medio en 1 L de agua purificada. Añadir 2,2 g de bicarbonato de sodio para lograr un pH de 7,4 y filtrar la solución mediante filtración al vacío de 0,22 μm.</li>
	<li>Agregue ingredientes frescos para obtener el medio completo (cMEMα) con concentraciones finales de 5,5 mM de glucosa, 2 mM de glutamina, 1 mM de piruvato y 10% de suero fetal bovino (FBS). Suplementar aún más cMEMα con 100 mM L-carnitina y 10 μM HEPES para facilitar la oxidación de ácidos grasos.</li>
	<li>Inmediatamente antes de su uso, agregue 14sustratos marcados con C a cMEMα recién preparado para hacer medios calientes. Para hacer el medio caliente de oleato, agregue la solución madre de oleato caliente de 10 mM a cMEMα para una concentración final de oleato de 100 μM (dilución 1:100, radiactividad final 0.4 μCi/mL). NOTA: La cepa de oleato caliente de 10 mM que contiene una relación 1:11.5 de oleato caliente:frío (ver paso 1.3) se utiliza para alcanzar un nivel fisiológico de 100 μM de oleato total en el medio mientras se minimiza la cantidad de material radiactivo.</li>
	<li>Haga 10 mM de oleato sin etiquetar agregando 24.36 mg de oleato de sodio a 2 mL de H2O en un baño de agua a 70 °C durante ~20 min hasta que se disuelva completamente antes de mezclar rápidamente con 6 mL de la solución madre de BSA de 4 mM precalentada a 70 °C. Transfiera a un baño de agua de 37 °C durante 1 h y filtre a través de un filtro de 0,22 μm. Alícuota y conservar a -20 °C para uso a largo plazo.</li>
	<li>Para hacer que la glucosa sea media caliente, agregue 14C-glucosa a una concentración final de 1.333 μM (dilución 1: 4,125, radiactividad final 0.4 μCi / ml). Para hacer medio caliente de glutamina, agregue 14C-glutamina a la concentración final de 2 μM (dilución 1: 1,000, radiactividad final 0.4 μCi / ml).</li>
	<li>Complemente el medio caliente de glucosa y glutamina con una solución madre de 10 mM de oleato sin etiquetar del paso 2.4 para lograr la concentración final de oleato de 100 μM, la misma que en el medio caliente de oleato.</li>
</ol>3. Preparación de las células
NOTA: Los preosteoblastos calvariales y los macrófagos de la médula ósea se utilizan como ejemplos aquí. Los usuarios deben preparar su tipo de célula de elección de acuerdo con los protocolos apropiados. Optimizar la concentración de colagenasa II para ser utilizada para la digestión en experimentos piloto, ya que la actividad enzimática puede variar entre diferentes lotes.
<ol><li>Aislamiento y cultivo de preosteoblastos calvariales<ol>
<li>Sacrifice a los cachorros postnatales del día 3-5 (P3-5) por decapitación y transfiéralos a DPBS helados que contengan penicilina-estreptomicina (P / S).</li>
		<li>Exponga la calvaria extirpando la piel y los tejidos blandos. Recoja la región media cortando los tejidos circundantes de atrás hacia adelante en DPBS (Figura 1A). Rasque las superficies internas y externas de la calvaria suavemente usando pinzas para ayudar a liberar las células en la digestión posterior.</li>
		<li>Prepare una solución de 2 mg/ml y 4 mg/ml de colagenasa tipo II en DPBS y filtre cada solución con un filtro fresco de 0,22 μm. Digiera la calvaria limpia primero con la solución de colagenasa de 2 mg/ml durante 15 min y deseche la solución de digestión. Digiera las muestras limpias en 4 mg / ml de solución de colagenasa 3 veces durante 15 minutos cada vez, agrupando y guardando la solución de digestión.</li>
		<li>Filtrar la solución de digestión a través de coladores celulares de 70 μm y centrifugar el filtrado a 300 × g durante 5 min. Resuspend el pellet celular en cMEMα (ver paso 2.2) que contiene 10% fbs y P/S.</li>
		<li>Cuente y sembra las células a 4 × 104 células/cm2 en placas de 10 cm. Cultive las células en una incubadora de 37 °C con 5% de CO2 durante 3 días.</li>
		<li>Disociar las células a 37 °C con tripsina-EDTA al 0,25%. Contar y sembrar las células en placas de cultivo celular de 24 pocillos con cMEMα que contengan 10% de FBS y P/S a 7,5 × 105/cm2. Sembrar al menos 4 pocillos por tipo de célula por sustrato y al menos tres pocillos adicionales para cada tipo de célula para el conteo celular antes del ensayo.</li>
		<li>Cultive las células a 37 °C durante la noche antes de los ensayos de oxidación del sustrato.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aislamiento y cultivo de BMM NOTA: El cultivo de BMM requiere un factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF), que se puede comprar comercialmente como una proteína recombinante. El medio acondicionado de la línea celular CMG14-12 diseñado para expresar M-CSF es una alternativa económica utilizada aquí13.<ol>
<li>Recolecte fémures y tibias de ratones de 8 semanas de edad después de extirpar el músculo y los tejidos conectivos. Cortar y desechar ambos extremos de los huesos con tijeras afiladas.</li>
		<li>Enjuague la médula ósea de un fémur y una tibia en una placa de Petri de 10 cm con una jeringa equipada con una aguja de 23 G que contiene 15 ml de cMEMα con 10% de FBS, P / S y 10% de CMG14-12 medio acondicionado (medio BMM). Cultiva las células en la placa de Petri en una incubadora de 37 °C con 5% de CO2.</li>
		<li>Después de 3 días, deseche los medios de cultivo y enjuague con DPBS. Disociar las células adheridas a 37 °C con tripsina-EDTA al 0,25% durante 5 min. Centrifugar y resuspendir el pellet celular en el medio BMM.</li>
		<li>Contar y sembrar las células en placas de cultivo celular de 24 pocillos a 7,5 × 105/cm2 de la misma manera que se describe en 3.1.6. Cultivo a 37 °C durante la noche en el medio BMM antes de comenzar los ensayos.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Ensayo de oxidación de sustrato con trampa de CO2
NOTA: Se debe determinar una densidad de siembra adecuada para cada tipo de célula para lograr una confluencia del 80-90% antes del inicio del ensayo. Tenga en cuenta que la densidad celular puede afectar el estado metabólico de las células.
<ol><li>Lave las células en los pocillos adicionales dos veces con DPBS. Disociar las células con tripsina-EDTA al 0,25% y células mixtas de 20 μL resuspendidas en DPBS con 20 μL de solución de colorante comercial lista para usar de naranja acridina/yoduro de propidio (AO/PI). Determine el número de células vivas con un contador de celdas automatizado y registre el número para los cálculos finales.</li>
	<li>Lave las células en los pocillos de ensayo dos veces con DPBS. Agregue 500 μL de medio caliente a cada ensayo bien en la campana de cultivo de tejidos designada por RAM. Selle las placas con parafilm e incube las células en una incubadora designada por RAM a 37 °C durante 4 h.</li>
	<li>Durante la incubación, corte el papel de filtro en trozos circulares ligeramente más grandes que el área dentro de la tapa de 1,5 ml de tubos de microcentrífuga e inserte el papel cómodamente en la tapa (Figura 1B). Añadir 200 μL de ácido perclórico 1 M a cada tubo y 20 μL de hidróxido de sodio al papel de filtro instalado dentro de la tapa.</li>
	<li>Después de la incubación de las células, transfiera 400 μL de medio de cultivo de cada pozo a los tubos preparados y cierre las tapas inmediatamente. Deje los tubos en un estante de tubos a temperatura ambiente durante 1 h.</li>
	<li>Durante la incubación, coloque un vial de centelleo para cada tubo y llénelo con 4 ml de líquido de centelleo. Transfiera cada trozo de papel de filtro a un vial de centelleo e incube a temperatura ambiente durante 30 min.</li>
	<li>Realice pruebas de limpieza en la campana de cultivo de tejidos, el baño de agua (utilizado para la preparación de 14C-oleato), refrigerador, incubadora, fregadero, suelo y cualquier otra área de trabajo para detectar una posible contaminación de RAM. Coloque las toallitas de papel en viales de centelleo que contengan líquido de centelleo.</li>
	<li>Mida 14C de radiactividad en los viales de centelleo con un contador de centelleo. Registre los resultados de la lectura. Descontaminar el ambiente de trabajo de acuerdo con las pautas de seguridad radiológica si es necesario.</li>
</ol>5. Análisis de datos
NOTA: Suponiendo que cada sustrato está completamente oxidado para liberar CO2, la tasa de oxidación del sustrato se puede calcular a partir de la radiactividad de CO2 atrapada.
<ol><li>Calcule la tasa de oxidación del sustrato utilizando Eq (1) y los valores X, Y y Z dados en la Tabla 1 para diferentes sustratos. Velocidad de oxidación del sustrato (μmol/célula/h) = <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63568/63568eq01.jpg">   (1)<ol>
<li>Calcule las desintegraciones totales por minuto (DPM) para cada pozo de reacción. Para X, utilice el valor DPM (lectura del contador de centelleo) de 0,4 ml del medio de reacción utilizado para atrapar CO2 de 0,5 ml del medio de reacción total. Por lo tanto, el DPM total de cada pozo de reacción es X × 1.25.</li>
		<li>Divida el DPM total por un factor de 2.220.000 para convertirlo a μCi.</li>
		<li>Convertir la radiactividad en μCi al número de 14moléculas marcadas con C. Divida el valor de μCi por la actividad específica (Y) de cada sustrato etiquetado. Utilice los siguientes valores Y (Tabla 1): 14C-glucosa: 300 mCi/mmol; 14 C-glutamina: 200 mCi/mmol; 14 C-oleato: 50 mCi/mmol.</li>
		<li>Calcule el número total de moléculas oxidadas a partir de las 14moléculas oxidadas marcadas con C multiplicando estas últimas con el factor de dilución caliente a total (Z). Utilice los siguientes valores Z (Tabla 1): Glucosa: 4.125; glutamina: 1.000; oleato: 12.5.</li>
		<li>Divida el producto resultante por número de celda (número de celda) y 4 (para el tiempo de reacción de 4 h) para determinar la tasa de oxidación del sustrato por célula. Utilice la celda# determinada en los pozos paralelos al comienzo del ensayo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Hargreaves, M., Spriet, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+energy+metabolism+during+exercise%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle energy metabolism during exercise.</a> Nature Metabolism. 2 (9), 817-828 (2020).</li>
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<li>Randle, P. J., Newsholme, E. A., Garland, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+glucose+uptake+by+muscle.+8.+Effects+of+fatty+acids%2C+ketone+bodies+and+pyruvate%2C+and+of+alloxan-diabetes+and+starvation%2C+on+the+uptake+and+metabolic+fate+of+glucose+in+rat+heart+and+diaphragm+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Regulation of glucose uptake by muscle. 8. Effects of fatty acids, ketone bodies and pyruvate, and of alloxan-diabetes and starvation, on the uptake and metabolic fate of glucose in rat heart and diaphragm muscles.</a> Biochemical Journal. 93 (3), 652-665 (1964).</li>
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<li>Lee, W. C., Guntur, A. R., Long, F., Rosen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energy+metabolism+of+the+osteoblast%3A+implications+for+osteoporosis%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine+Reviews%22%5BJournal%5D)">Energy metabolism of the osteoblast: implications for osteoporosis.</a> Endocrine Reviews. 38 (3), 255-266 (2017).</li>
<li>Li, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Both+aerobic+glycolysis+and+mitochondrial+respiration+are+required+for+osteoclast+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Both aerobic glycolysis and mitochondrial respiration are required for osteoclast differentiation.</a> FASEB Journal. 34 (8), 11058-11067 (2020).</li>
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<li>Yu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamine+metabolism+regulates+proliferation+and+lineage+allocation+in+skeletal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Glutamine metabolism regulates proliferation and lineage allocation in skeletal stem cells.</a> Cell Metabolism. 29 (4), 966-978 (2019).</li>
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<li>Itoh, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dichloroacetate+effects+on+glucose+and+lactate+oxidation+by+neurons+and+astroglia+in+vitro+and+on+glucose+utilization+by+brain+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Dichloroacetate effects on glucose and lactate oxidation by neurons and astroglia in vitro and on glucose utilization by brain in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (8), 4879-4884 (2003).</li>
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<li>Esen, E., Lee, S. Y., Wice, B. M., Long, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PTH+promotes+bone+anabolism+by+stimulating+aerobic+glycolysis+via+IGF+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">PTH promotes bone anabolism by stimulating aerobic glycolysis via IGF signaling.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 30 (11), 1959-1968 (2015).</li>
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<li>Abdelmagid, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+profiling+of+plasma+fatty+acid+concentrations+in+young+healthy+Canadian+adults%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Comprehensive profiling of plasma fatty acid concentrations in young healthy Canadian adults.</a> PLoS One. 10 (2), 0116195(2015).</li>
</ol>

Los autores declaran que no hay conflictos de intereses.

El protocolo proporciona un método fácil de usar para determinar la tasa de oxidación de los principales sustratos energéticos. Es una alternativa más sencilla a otros protocolos que utilizan matraces que contienen un pozo central y están tapados con tapones de goma 14,15,16. Aunque el estudio de ejemplo aquí se realiza con cultivo celular, el método se puede adaptar fácilmente para explantes de tejido u homogeneizados de tejido...

La fosforilación oxidativa (OXPHOS) en eucariotas es el proceso por el cual los nutrientes se descomponen dentro de las mitocondrias para liberar energía química en forma de ATP a través del consumo de oxígeno.  El catabolismo de varios sustratos dentro de las mitocondrias a través del ciclo del ácido tricarboxílico (TCA) genera pocas moléculas de ATP directamente, pero más bien almacena energía a través de la reducción de los portadores de electrones nicotinamida adenina dinucleótido (NAD +) y flavina adenina dinucleótido (FAD +). Los portadores reducidos son oxidados por ETC ubicado en la membrana interna de las mitocondrias para generar un gradiente de concentración de protones a través de la membrana. Los protones eventualmente fluyen por su gradiente de regreso a la matriz mitocondrial a través de la ATP sintasa para producir ATP. OXPHOS es el medio más eficiente de producción de ATP a partir de sustratos energéticos y generalmente se prefiere en entornos aeróbicos. Anteriormente, se pensaba que la glucólisis aeróbica (producción de lactato a partir de glucosa mientras el oxígeno está presente) era fisiopatológica, a menudo un sello distintivo de las células cancerosas. Cada vez más, se está descubriendo que algunos tipos de células normales utilizan la glucólisis aeróbica por razones que aún no se han descifrado por completo.
La flexibilidad metabólica es la capacidad de las células u organismos para adaptarse a las cambiantes demandas de energía y las fuentes de combustible disponibles. Por ejemplo, la demanda energética del músculo esquelético es satisfecha principalmente por OXPHOS en estado estacionario, pero por glucólisis anaeróbica durante el ejercicio de alta intensidad1. A medida que aumenta la duración del ejercicio, la glucosa y la oxidación de ácidos grasos contribuyen más a la producción general de energía2. Sin embargo, el uso del sustrato no depende solo de la disponibilidad, ya que los sustratos compiten antagónicamente durante la oxidación. En particular, se ha demostrado que la oxidación de ácidos grasos inhibe la utilización de glucosa por el músculo esquelético en un fenómeno conocido como el efecto Randle3. Un efecto recíproco fue demostrado por estudios posteriores 4,5. Además, muchas enfermedades se asocian con un cambio en la preferencia de sustrato y el desarrollo de inflexibilidad metabólica en las células. Por ejemplo, la oxidación de ácidos grasos se reduce en el músculo esquelético de los pacientes diabéticos tipo II en comparación con los sujetos de control normales6. Los cambios metabólicos en los entornos de la enfermedad son objeto de una intensa investigación, ya que pueden contribuir a la patogénesis.
El metabolismo energético en los tipos de células esqueléticas está relativamente poco estudiado, pero ha ganado atención en los últimos años7. Trabajos previos han demostrado que la glucólisis aeróbica es la vía de energía dominante en los osteoblastos calvariales, mientras que la oxidación de la glucosa a través del ciclo TCA juega un papel en la formación de osteoclastos 8,9. Otros han proporcionado evidencia de ácidos grasos como fuente de energía para los osteoblastos10. También se ha demostrado que el catabolismo de glutamina apoya la diferenciación osteoblástica de los progenitores11,12. Sin embargo, todavía falta una comprensión integral de la utilización del sustrato por varios tipos de células esqueléticas. Además, se espera que los cambios en el metabolismo celular durante la diferenciación celular o en respuesta a señales patológicas alteren la utilización del sustrato de combustible. A continuación se describe un protocolo fácil de usar para evaluar la oxidación del sustrato in vitro.

<table><tbody><tr><td>0,22 y micro; m filtros</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SLGVM33RS</td><td>Se utiliza para filtrar la solución BSA al</td></tr><tr><td>0,25% Tripsina-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td>Disociar células de placas de cultivo celular</td></tr><tr><td>1,5 mL Tubos Eppendorf</td><td>PR1MA</td><td>PR MCT17 RB</td><td>Utilizado para la incubación de reacción</td></tr> placas <tr><td>de 10 cm</td><td>TPP</td><td>93100</td><td>Utilizado para cultivo celular</td></tr><tr><td>Jeringa de 10 mL</td><td>BD</td><td>302995</td><td>Se utiliza para lavar la médula de los huesos largos</td></tr><tr><td>10% FBS</td><td>Atlanta biologicals</td><td>S11550</td><td>Para la preparación del medio de cultivo celular</td></tr><tr><td>14C-Glucosa</td><td>PerkinElmer</td><td>NEC042X050UC</td><td>Se utiliza para hacer medios calientes</td></tr><tr><td>14C-glutamina</td><td>PerkinElmer</td><td>NEC451050UC</td><td>Se utiliza para hacer medios calientes</td></tr><tr><td>14C-oleato</td><td>PerkinElmer</td><td>NEC317050UC</td><td>Se utiliza para fabricar medios calientes</td></tr><tr><td>Aguja de 23 G</td><td>BD</td><td>305120</td><td>Se utiliza para lavar la médula de los huesos largos</td></tr><tr><td>Placas de 24 pocillos</td><td>TPP</td><td>92024</td><td>Se utiliza para el cultivo celular</td></tr><tr><td>70 &mu; Filtros de células m</td><td>MIDSCI</td><td>70CELL</td><td>Se utiliza para filtrar el sobrenadante durante la digestión varial</td></tr><tr><td>Colorante naranja acridina/yoduro de propidio (AO/PI)</td><td>Nexcelom Biosciences</td><td>CS2-0106</td><td>Tiñe células vivas para determinar la densidad de semillas</td></tr><tr><td>Suero bovino Ablumin</td><td>Proliant Biologicals</td><td>68700</td><td>Utilizado para la conjugación de ácidos grasos</td></tr><tr><td>Celómetro Auto 2000</td><td>Nexcelom Biosciences</td><td></td><td>Determinar el número de células viables</td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Thermo Fisher</td><td>Legend Micro 21R</td><td>Se utiliza para pellets células</td></tr><tr><td>Colagenasa tipo II</td><td>Worthington LS004176</td><td></td><td>Disociar células del tejido</td></tr><tr><td>MEM personalizado alpha</td><td>GIBCO</td><td>SKU: ME 18459P1</td><td>Se utiliza para crear medios calientes personalizados</td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td>Se utiliza para disolver y diluir reactivos, y lavar platos de cultivo</td></tr><tr><td>Papel de filtro</td><td>Millipore-Sigma</td><td>WHA1001090</td><td>Trampas CO2 con hidróxido de sodio</td></tr><tr><td>Glucosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>g7528</td><td>Se utiliza para fabricar medios personalizados</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td>Traps CO2 durante el cultivo celular</td></tr><tr><td>L-carnitina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0283</td><td>Suplementado para la oxidación de ácidos grasos</td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>g3126</td><td>Se utiliza para fabricar medios personalizados</td></tr><tr><td>MEM alpha</td><td>Thermo</td><td>A10490</td><td>Medio de cultivo celular</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Pecheney Embalaje de plástico</td><td>PM998</td><td>Se utiliza para sellar placas de cultivo celular</td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>Thermo Fisher</td><td>15140122</td><td>Previene la contaminación en cultivos celulares</td></tr><tr><td>El ácido perclórico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>244252</td><td>libera CO2 durante el ensayo metabólico</td></tr><tr><td>Pyruvate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>p5280</td><td>Se utiliza para fabricar medios personalizados</td></tr><tr><td>Contador de centelleo</td><td>Beckman Coulter</td><td>LS6500</td><td>Determina la radiactividad del papel de filtro</td></tr><tr><td>Fluido de centelleo</td><td>MP Biomedicals</td><td>882453</td><td>Absorben la energía emitida por las RAM y la vuelven a emitir en forma de destellos de luz</td></tr><tr><td>Vial de centelleo</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-337-1</td><td>Recipientes de reacción para fluido de centelleo</td></tr><tr><td>Carbonato de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td>Tampón de equilibrio para</td></tr><tr><td>hidróxido de sodio</td> medio <td>Sigma-Aldrich</td><td>58045</td><td>Atrapa CO2 durante el ensayo de metaboilc</td></tr><tr><td>Oleato</td> <td>de sodioSANTA CRUZ</td><td>SC-215879</td><td>BSA preparación de ácidos grasos conjugados</td></tr><tr><td>Filtración al vacío 1000</td><td>TPP</td><td>99950</td><td>Filtro cMEM&alpha;</td></tr></tbody></table>

evaluación de la oxidación del sustrato energético in vitro con 14capturas de co2

Assessing Energy Substrate Oxidation In Vitro with 14CO2 Trapping

Las mitocondrias albergan la maquinaria para el ciclo del ácido tricarboxílico (TCA) y la cadena de transporte de electrones (ETC), que generan trifosfato de adenosina (ATP) para mantener la homeostasis energética. La glucosa, los ácidos grasos y los aminoácidos son los principales sustratos energéticos que alimentan la respiración mitocondrial en la mayoría de las células somáticas. La evidencia muestra que los diferentes tipos de células pueden tener una clara preferencia por ciertos sustratos. Sin embargo, la utilización del sustrato por varias células en el esqueleto no se ha estudiado en detalle. Además, como el metabolismo celular está en sintonía con los cambios fisiológicos y fisiopatológicos, las evaluaciones directas de la dependencia del sustrato en las células esqueléticas pueden proporcionar información importante sobre la patogénesis de las enfermedades óseas.
El siguiente protocolo se basa en el principio de liberación de dióxido de carbono de las moléculas de sustrato después de la fosforilación oxidativa. Mediante el uso de sustratos que contienen átomos de carbono marcados radiactivamente (14C), el método proporciona un ensayo sensible y fácil de usar para la tasa de oxidación del sustrato en el cultivo celular. Un estudio de caso con preosteoblastos calvariales primarios versus macrófagos derivados de la médula ósea (BMM) demuestra una diferente utilización de los sustratos principales entre los dos tipos de células.

En este ejemplo, el método de captura de CO2 se utiliza para comparar la oxidación del sustrato por preosteoblastos calvariales primarios versus BMM, que se utilizan con frecuencia para la diferenciación in vitro de osteoblastos u osteoclastos, respectivamente. Después de que las células primarias se pasan y se cultivan en cMEMα durante la noche, generalmente alcanzan el 80-90% de la confluencia y exhiben su morfología característica. Los preosteoblastos calvariales son notablemente más grandes que lo...

Este protocolo describe un método fácil de usar para examinar la oxidación del sustrato mediante el seguimiento de la producción de 14CO2 in vitro.

Evaluación de la oxidación del sustrato energético in vitro con 14capturas de CO2

Mitochondria host the machinery for the tricarboxylic acid (TCA) cycle and electron transport&#160;chain (ETC), which generate adenosine triphosphate ...

El uso de diferentes sustratos energéticos es tanto específico del tipo de célula como indicativo de la enfermedad. Medir el consumo de los sustratos específicos puede arrojar luz tanto sobre la biología normal como sobre la patología. La técnica no necesita equipo especializado y es fácil de escalar.También es más fácil de usar que los métodos publicados anteriormente. Comprender los cambios en la tasa de oxidación del sustrato permitirá el desarrollo de intervenciones dietéticas y farmacológicas para los trastornos metabólicos. Aunque se demuestra con tejido óseo, esta técnica se personaliza fácilmente para estudiar la flexibilidad metabólica en todos los tipos de células, proporcionando una comprensión de las causas y consecuencias de los cambios metabólicos.Después de sacrificar a los cachorros de tres a cinco días postnatales, transfiéralos a D PBS helado que contenga solución antibiótica dual de penicilina estreptomicina. Exponga la calvaria extirpando la piel y los tejidos blandos. Recoja la región media cortando los tejidos circundantes de atrás hacia adelante en D PBS.Rasque las superficies internas y externas de la calvaria suavemente usando pinzas para ayudar a liberar las células en la digestión posterior. Prepare soluciones de 2 y 4 miligramos por mililitro de colagenasa tipo dos en D PBS y filtre cada solución con un filtro fresco de 0,22 micrómetros. Primero, digiera la calvaria limpia con dos miligramos por mililitro de solución de colagenasa durante 15 minutos, y luego deseche la solución de digestión.A continuación, digiera las muestras limpias en cuatro miligramos por mililitro de solución de colagenasa tres veces durante 15 minutos cada vez. Luego, tire de la solución de digestión y guárdela. Filtre la solución de digestión a través de coladores celulares de 70 micrómetros y centrífique el filtrado a 300 RCF durante cinco minutos.Vuelva a suspender el gránulo celular en medio alfa MEM completo que contenga 10% FBS y solución antibiótica dual de penicilina estreptomicina. Cuente y selle las células en una placa de 10 centímetros. Cultive las células en una incubadora de 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono durante tres días.Luego, disociar las células a 37 grados Celsius con 0.25 Tripsina EDTA. Después de la digestión, cuente y sembra las células en una placa de cultivo celular de 24 pocillos con un medio alfa MEM completo que contenga 10% FBS y solución antibiótica dual de penicilina estreptomicina. Sembrar al menos cuatro pocillos por tipo de célula por sustrato, y al menos tres pocillos adicionales para cada tipo de célula para el conteo previo al ensayo.Cultive las células a 37 grados centígrados durante la noche. Después de extraer el músculo y el tejido conectivo de ratones de ocho semanas de edad y recolectar fémures y tibias, corte y descarte ambos extremos de los huesos con tijeras afiladas. Enjuague la médula ósea de un fémur y una tibia en una placa de Petri fresca de 10 centímetros con una jeringa equipada con una aguja de calibre 23 que contiene 15 mililitros de medio alfa MEM completo con solución antibiótica dual de estreptomicina de penicilina FBS al 10% y medio acondicionado 10% CGM 14 12.Cultive las células en la placa de Petri en una incubadora de 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono. Después de tres días, deseche los medios de cultivo y enjuague las células con D PBS. Disociar las células unidas a 37 grados Celsius con 0.25% de Tripsina EDTA durante cinco minutos.Después de la centrifugación, vuelva a suspender el pellet celular en el medio BMM. Contar y sembrar las células en una placa de cultivo celular de 24 pocillos según el procedimiento descrito anteriormente. Cultivo a 37 grados centígrados durante la noche en el medio BMM antes de comenzar los ensayos.Lave las células en los pocillos adicionales dos veces con D PBS. Disociar las células con 0,25%Tripsina EDTA. Suspender 20 microlitros de células digeridas en D PBS.Con 20 microlitros de solución de colorante de naranja acridina y yoduro de propidio, determine el número de células vivas con un contador celular automatizado y registre el número. Lave las células en los pocillos de ensayo dos veces con D PBS. Agregue 500 microlitros de medio caliente a cada ensayo bien en la campana de cultivo de tejidos designada RAM.Después de sellar la placa con parafilm, incube las células en una incubadora designada RAM a 37 grados Celsius durante 4 horas. Durante la incubación, corte el papel de filtro en trozos circulares, ligeramente más grandes que el área dentro de la tapa del tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros e inserte el papel cómodamente en la tapa. Agregue 200 microlitros de un ácido perclórico de 1 molar a cada tubo y 20 microlitros de hidróxido de sodio al papel de filtro instalado dentro de la tapa.Después de incubar las células, transfiera 400 microlitros de medio de cultivo de cada pozo a los tubos preparados y cierre las tapas inmediatamente. Deje los tubos en un estante de tubos a temperatura ambiente durante una hora. Parallelae durante la incubación configura un vial de centelleo para cada tubo y lo llena con cuatro mililitros de líquido de centelleo.Transfiera cada trozo de papel de filtro a un vial de centelleo e incube a temperatura ambiente durante 30 minutos. Realice pruebas de limpieza en la campana de cultivo de tejidos, el baño de agua, el refrigerador, la incubadora, el fregadero, el suelo y cualquier otra área de trabajo para detectar una posible contaminación de RAM. Coloque las toallitas de papel en viales de centelleo que contengan líquido de centelleo.Mida la actividad de radio de carbono 14 en los viales de centelleo con un contador de centelleo y registre los resultados de lectura. Descontaminar el ambiente de trabajo, de acuerdo con las pautas de seguridad radiológica, si es necesario. La figura compara la oxidación del sustrato por calvaria primaria pre osteoblastos versus BMM.Después de que las células primarias se pasan y se cultivan en medio alfa MEM completo durante la noche, generalmente alcanzan una confluencia del 80 al 90% y exhiben su morfología característica. Los pre osteoblastos calvariales son notablemente más grandes que los BMM. Los resultados de la oxidación del sustrato mostraron que la tasa de oxidación para cada sustrato es significativamente mayor en los pre osteoblastos calvariales que en losBM, lo que probablemente indica una mayor producción de energía por fosforilación oxidativa en los pre osteoblastos.El tercer papel insertado debe ser ligeramente más grande que una tapa de tubo superior de 1,7 mililitros. Este método se puede utilizar junto con el consumo de oxígeno y para determinar la tasa general de fosforilación oxidativa y producción lactativa en las células. Este protocolo se puede utilizar para determinar el uso del sustrato durante distintas etapas de diferenciación o entornos de enfermedad.Con este conocimiento podemos desarrollar intervenciones para los trastornos metabólicos.

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Investigación

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Biología

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La detección de óxido nítrico y el radical anión superóxido por espectroscopía de resonancia paramagnética de electrones de las células utilizando atrapadores

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