Evaluación de la oxidación del sustrato energético in vitro con ¹⁴capturas de CO₂

El uso de diferentes sustratos energéticos es tanto específico del tipo de célula como indicativo de la enfermedad. Medir el consumo de los sustratos específicos puede arrojar luz tanto sobre la biología normal como sobre la patología. La técnica no necesita equipo especializado y es fácil de escalar.

También es más fácil de usar que los métodos publicados anteriormente. Comprender los cambios en la tasa de oxidación del sustrato permitirá el desarrollo de intervenciones dietéticas y farmacológicas para los trastornos metabólicos. Aunque se demuestra con tejido óseo, esta técnica se personaliza fácilmente para estudiar la flexibilidad metabólica en todos los tipos de células, proporcionando una comprensión de las causas y consecuencias de los cambios metabólicos.

Después de sacrificar a los cachorros de tres a cinco días postnatales, transfiéralos a D PBS helado que contenga solución antibiótica dual de penicilina estreptomicina. Exponga la calvaria extirpando la piel y los tejidos blandos. Recoja la región media cortando los tejidos circundantes de atrás hacia adelante en D PBS.

Rasque las superficies internas y externas de la calvaria suavemente usando pinzas para ayudar a liberar las células en la digestión posterior. Prepare soluciones de 2 y 4 miligramos por mililitro de colagenasa tipo dos en D PBS y filtre cada solución con un filtro fresco de 0,22 micrómetros. Primero, digiera la calvaria limpia con dos miligramos por mililitro de solución de colagenasa durante 15 minutos, y luego deseche la solución de digestión.

A continuación, digiera las muestras limpias en cuatro miligramos por mililitro de solución de colagenasa tres veces durante 15 minutos cada vez. Luego, tire de la solución de digestión y guárdela. Filtre la solución de digestión a través de coladores celulares de 70 micrómetros y centrífique el filtrado a 300 RCF durante cinco minutos.

Vuelva a suspender el gránulo celular en medio alfa MEM completo que contenga 10% FBS y solución antibiótica dual de penicilina estreptomicina. Cuente y selle las células en una placa de 10 centímetros. Cultive las células en una incubadora de 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono durante tres días.

Luego, disociar las células a 37 grados Celsius con 0.25 Tripsina EDTA. Después de la digestión, cuente y sembra las células en una placa de cultivo celular de 24 pocillos con un medio alfa MEM completo que contenga 10% FBS y solución antibiótica dual de penicilina estreptomicina. Sembrar al menos cuatro pocillos por tipo de célula por sustrato, y al menos tres pocillos adicionales para cada tipo de célula para el conteo previo al ensayo.

Cultive las células a 37 grados centígrados durante la noche. Después de extraer el músculo y el tejido conectivo de ratones de ocho semanas de edad y recolectar fémures y tibias, corte y descarte ambos extremos de los huesos con tijeras afiladas. Enjuague la médula ósea de un fémur y una tibia en una placa de Petri fresca de 10 centímetros con una jeringa equipada con una aguja de calibre 23 que contiene 15 mililitros de medio alfa MEM completo con solución antibiótica dual de estreptomicina de penicilina FBS al 10% y medio acondicionado 10% CGM 14 12.

Cultive las células en la placa de Petri en una incubadora de 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono. Después de tres días, deseche los medios de cultivo y enjuague las células con D PBS. Disociar las células unidas a 37 grados Celsius con 0.25% de Tripsina EDTA durante cinco minutos.

Después de la centrifugación, vuelva a suspender el pellet celular en el medio BMM. Contar y sembrar las células en una placa de cultivo celular de 24 pocillos según el procedimiento descrito anteriormente. Cultivo a 37 grados centígrados durante la noche en el medio BMM antes de comenzar los ensayos.

Lave las células en los pocillos adicionales dos veces con D PBS. Disociar las células con 0,25%Tripsina EDTA. Suspender 20 microlitros de células digeridas en D PBS.

Con 20 microlitros de solución de colorante de naranja acridina y yoduro de propidio, determine el número de células vivas con un contador celular automatizado y registre el número. Lave las células en los pocillos de ensayo dos veces con D PBS. Agregue 500 microlitros de medio caliente a cada ensayo bien en la campana de cultivo de tejidos designada RAM.

Después de sellar la placa con parafilm, incube las células en una incubadora designada RAM a 37 grados Celsius durante 4 horas. Durante la incubación, corte el papel de filtro en trozos circulares, ligeramente más grandes que el área dentro de la tapa del tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros e inserte el papel cómodamente en la tapa. Agregue 200 microlitros de un ácido perclórico de 1 molar a cada tubo y 20 microlitros de hidróxido de sodio al papel de filtro instalado dentro de la tapa.

Después de incubar las células, transfiera 400 microlitros de medio de cultivo de cada pozo a los tubos preparados y cierre las tapas inmediatamente. Deje los tubos en un estante de tubos a temperatura ambiente durante una hora. Parallelae durante la incubación configura un vial de centelleo para cada tubo y lo llena con cuatro mililitros de líquido de centelleo.

Transfiera cada trozo de papel de filtro a un vial de centelleo e incube a temperatura ambiente durante 30 minutos. Realice pruebas de limpieza en la campana de cultivo de tejidos, el baño de agua, el refrigerador, la incubadora, el fregadero, el suelo y cualquier otra área de trabajo para detectar una posible contaminación de RAM. Coloque las toallitas de papel en viales de centelleo que contengan líquido de centelleo.

Mida la actividad de radio de carbono 14 en los viales de centelleo con un contador de centelleo y registre los resultados de lectura. Descontaminar el ambiente de trabajo, de acuerdo con las pautas de seguridad radiológica, si es necesario. La figura compara la oxidación del sustrato por calvaria primaria pre osteoblastos versus BMM.

Después de que las células primarias se pasan y se cultivan en medio alfa MEM completo durante la noche, generalmente alcanzan una confluencia del 80 al 90% y exhiben su morfología característica. Los pre osteoblastos calvariales son notablemente más grandes que los BMM. Los resultados de la oxidación del sustrato mostraron que la tasa de oxidación para cada sustrato es significativamente mayor en los pre osteoblastos calvariales que en losBM, lo que probablemente indica una mayor producción de energía por fosforilación oxidativa en los pre osteoblastos.

El tercer papel insertado debe ser ligeramente más grande que una tapa de tubo superior de 1,7 mililitros. Este método se puede utilizar junto con el consumo de oxígeno y para determinar la tasa general de fosforilación oxidativa y producción lactativa en las células. Este protocolo se puede utilizar para determinar el uso del sustrato durante distintas etapas de diferenciación o entornos de enfermedad.

Con este conocimiento podemos desarrollar intervenciones para los trastornos metabólicos.