Perfil espacial digital para la caracterización del microambiente en glioma infiltrante difuso de tipo adulto

Digital Spatial Profiling, o DSP, ofrece un método eficiente para la cuantificación de proteínas estratificadas espacialmente. Su implementación nos permite caracterizar la expresión de proteínas en distintas regiones de un tumor y el microambiente. Una característica clave de DSP es su capacidad de multiplexación, que permite el procesamiento de datos de alto rendimiento.

La capacidad de definir regiones de interés personalizadas también proporciona una dimensión espacial para el análisis de datos. DSP se puede aplicar a cualquier muestra en la que la cuantificación espacial de la proteína o la expresión de ARN pueda ayudar a dilucidar un proceso patológico o fisiológico. Esto es especialmente relevante en oncología, donde la variabilidad del objetivo regional puede correlacionarse con el crecimiento maligno o la invasión.

Demostrando el procedimiento estarán Scott Palisoul, un histotecnólogo, y Rachael Barney, una tecnóloga genómica. Para preparar las diapositivas, comience tomando varios núcleos de dos milímetros de cada biopsia y colocándolos en un solo bloque de micromatriz de tejido. Corte secciones de cuatro micras del bloque y móntelas en portaobjetos de vidrio.

Coloque cada portaobjetos dentro de la junta del portaportaobjetos e incube a 60 grados centígrados durante 30 minutos. En el sistema IHC semiautomatizado, llene el recipiente en la posición uno con 150 microlitros de tampón de lavado por portaobjetos, más cinco mililitros de volumen muerto, y deje la tapa abierta. Llene la misma cantidad de solución de bloqueo en el recipiente en la posición dos.

Cargue la bandeja del contenedor de reactivos en la máquina. Seleccione el IHC de proceso, seguido del nombre de la solución de bloqueo en el cuadro desplegable del campo Marcador. Una vez que haya terminado para todas las diapositivas, haga clic en Cerrar.

Luego haga clic en Imprimir etiquetas, y marque Todas las etiquetas de diapositivas aún no impresas, y haga clic en Imprimir. Coloque etiquetas en la parte superior de las diapositivas. Cargue las diapositivas en la bandeja portaobjetos, asegurándose de que la muestra y la etiqueta estén orientadas hacia arriba.

Presione el botón LED para bajar la bandeja y permita que el instrumento comience el escaneo y el reconocimiento de diapositivas. Haga clic en el botón Inicio para comenzar el experimento. Cuando finalice la ejecución, presione el botón LED cuando parpadee en verde.

Retire la bandeja del instrumento y levante con cuidado las baldosas de la cubierta de cada portaobjetos. Coloque los portaobjetos en la solución salina tamponada con fosfato 1X. Retire el exceso de tampón y delinee cada sección de tejido con una pluma hidrófoba para crear una barrera hidrófoba.

Haga una solución oligo de PC de anticuerpos agregando ocho microlitros de cada anticuerpo por portaobjetos y usando Buffer W para alcanzar un volumen final de 200 microlitros. Luego aplique la solución oligo de anticuerpos PC a los portaobjetos e incube los portaobjetos durante la noche a cuatro grados centígrados. Después de la incubación, coloque los portaobjetos en una bandeja humidificada y lave tres veces durante 10 minutos en 1X TBST.

Pos-fijar en paraformaldehído al 4% durante 30 minutos a temperatura ambiente, seguido de lavar dos veces durante cinco minutos en 1X TBST. Agregue la tinción nuclear SYTO 13 durante 15 minutos a temperatura ambiente, seguida de lavar dos veces con 1X TBST. Desplace el mouse sobre Recopilación de datos en el Centro de control y seleccione Nuevo o Continuar ejecución.

Coloque la diapositiva en el portadiapositivas con la etiqueta hacia el usuario. Baje la abrazadera de la bandeja deslizante, asegurándose de que el tejido sea visible en la ventana alargada. Agregue seis mililitros de Buffer S.Siga las indicaciones en el Centro de control.

Haga zoom entre diferentes ejes con los controles deslizantes x e y para delinear una región para escanear. Seleccione Escanear y permita que el escaneo continúe hasta que se haya creado una imagen de toda el área de destino definida. Generar una imagen 20 veces.

Defina los ROI seleccionando tres ROI circulares de igual tamaño de un diámetro de 250 micrómetros para cada núcleo de tejido. Apruebe los ROI haciendo clic en el botón Salir del espacio de trabajo de escaneo. Luego espere a que la luz UV separe los oligos de los anticuerpos.

Después de completar el proceso del instrumento de limpieza, seleccione Nueva recopilación de datos para continuar con las diapositivas o placas actuales. Abra la ventana de la placa finalizada haciendo doble clic en el área del icono de la placa. Introduzca el número de lote del paquete de códigos de hibridación y haga clic en Actualizar.

Luego haga clic en Finalizar. Separe el portaportaobjetos y la placa de recolección siguiendo las indicaciones. Guarde los portaobjetos en TBST, o cúbralos con un medio acuoso y cubra el papel para el almacenamiento a largo plazo.

Sellar las placas con un sello permeable y secar los aspirados a 65 grados centígrados en un termociclador con la parte superior abierta. Agregue siete microlitros de agua tratada con pirocarbonato de dietilo y mezcle. Incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos y luego girar hacia abajo rápidamente.

Prepare la mezcla de búfer de la sonda eligiendo las ecuaciones R y U de la sonda adecuadas aplicando la ecuación como se describe en el protocolo de texto. Agregue 84 microlitros de mezcla de tampón de sonda a cada paquete de códigos de hibridación. En una placa de hibridación fresca de 96 pocillos, agregue ocho microlitros de cada mezcla maestra de código de hibridación en los 12 pocillos de la fila indicada.

Transfiera siete microlitros de la placa de recolección DSP al pocillo correspondiente en la placa de hibridación. Selle con calor, gire la placa e incube durante la noche a 67 grados centígrados. Después de la incubación, enfríe la placa en hielo y realice un giro rápido.

Agrupe los productos de hibridación de cada pocillo en un tubo de tira, pipeteando suavemente cada pocillo cinco veces. Gire hacia abajo y cargue los tubos de la tira en el sistema de análisis. En el instrumento DSP, guarde el archivo CDF en una unidad USB y transfiera los datos al analizador digital.

En la pantalla, presione Iniciar procesamiento. Seleccione Alta sensibilidad seguido de Siguiente. Pulse Seleccionar todo para el número de pozos con muestras, luego Finalizar, seguido de Siguiente en la notificación por correo electrónico.

Luego haga clic en Inicio. Una vez que la estación de preparación haya terminado, selle el cartucho y transfiéralo al analizador digital. Presione Iniciar conteo.

Seleccione Posición del escenario. Presione Cargar archivo CDF existente y seleccione el archivo cargado anteriormente. Presione Listo.

Seleccione Posición de escenario de nuevo, pulse Listo y, a continuación, Iniciar para ejecutar el programa. Guarde el archivo ZIP de los archivos de conversión de recuento de reporteros del sistema de análisis en una unidad USB. Inserte la unidad en el equipo DSP.

En el Centro de control de DSP, coloque el cursor sobre Recopilación de datos y luego haga clic en Cargar cuentas. Seleccione el archivo ZIP correspondiente. Haga clic en Registros en el Centro de control de DSP.

Para ver los análisis de la cola, seleccione Agregar análisis seleccionados a la cola y, a continuación, Mi cola de análisis. Seleccione Nuevo estudio en cola colocando el cursor sobre la opción Análisis de datos en el Centro de control. El experimento DSP se realizó en muestras de glioblastoma, y los resultados se visualizaron como un mapa de calor.

Las filas representan objetivos de proteínas, y cada columna corresponde a una región de interés. El nivel de expresión se representa mediante una gama de colores que varía desde el azul, que muestra una expresión baja, hasta el rojo, que denota una expresión alta. La variabilidad del color dentro de una fila refleja la heterogeneidad regional de proteínas y sugiere una posible asociación espacial con la expresión diferencial de proteínas.

En este experimento, S100 y CD-56 fueron universalmente altos, porque son marcadores neuronales. Los marcadores con mayor variabilidad incluyen B7-H3, KI-67, CD-44 y fibronectina, que se sabe que están asociados con la proliferación, migración y metástasis del tumor. A partir de una amplia gama de objetivos candidatos, DSP puede identificar aquellos que exhiben una variación regional significativa.

Esto sienta las bases para investigar los factores asociados con la variabilidad y su relevancia para la enfermedad.