Name: Implantación de cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducida por ultrasonido en ratones con infartado de miocardio (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: Aprende a implantar cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas mediante inyección intramiocárdica guiada por ecocardiografía en ratones con infarto de miocardio. Este método menos invasivo mejora la reparación cardíaca.

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Este trabajo fue apoyado por el Plan de Investigación Principal de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (No. 91539111a JY), el Proyecto Clave de Ciencia y Tecnología de la Provincia de Hunan (No. 2020SK53420 a JY) y el Programa de Innovación Científica y Tecnológica de la Provincia de Hunan (2021RC2106 a CF).

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<li>Kain, V., Prabhu, S. D., Halade, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+revisited%3A+inflammation+versus+resolution+of+inflammation+following+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Research+in+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Inflammation revisited: inflammation versus resolution of inflammation following myocardial infarction.</a> Basic Research in Cardiology. 109 (6), 444(2014).</li>
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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Los pasos críticos de este estudio incluyen cultivo de hiPSC, diferenciación de cardiomiocitos, purificación de hiPSC-CM y trasplante de hiPSC-CM en el sitio de infarto de miocardio de ratón. La clave es usar ultrasonido cardíaco para guiar transcutáneamente el tratamiento hacia el sitio del infarto en el borde del infarto donde se inyectaron hiPSC-CM en el área.
Con la prolongación del tiempo de cultivo, el fenotipo hiPSC-CM cambia en morfología (mayor tamaño celular), estructura (músculo, de...

Cuando se produce un infarto agudo de miocardio, las células del miocardio en el área infartada mueren rápidamente debido a la isquemia y la hipoxia. Varios factores inflamatorios se liberan después de la muerte celular y la ruptura, mientras que las células inflamatorias se infiltran en el sitio infartado para causar inflamación1. Significativamente, los fibroblastos y el colágeno, ambos sin contractilidad y conductividad eléctrica, reemplazan las células miocárdicas en el sitio infartado para formar tejido cicatricial. Debido a la limitada capacidad de regeneración de los cardiomiocitos en mamíferos adultos, el tejido viable formado después de una gran área de infarto generalmente no es adecuado para mantener un gasto cardíaco suficiente2. El IM causa insuficiencia cardíaca, y en casos severos de insuficiencia cardíaca, los pacientes solo pueden confiar en trasplantes cardíacos o dispositivos de asistencia ventricular para mantener las funciones cardíacas normales 3,4.
Después del IM, la estrategia de tratamiento ideal es reemplazar los cardiomiocitos muertos con cardiomiocitos recién formados, formando acoplamiento electromecánico con tejidos sanos. Sin embargo, las opciones de tratamiento generalmente han adoptado el rescate miocárdico en lugar del reemplazo. Actualmente, las terapias basadas en células madre y células progenitoras se encuentran entre las estrategias más prometedoras para promover la reparación del miocardio después de la MI5. Sin embargo, el trasplante de estas células tiene varios problemas, principalmente la incapacidad de las células madre adultas para diferenciarse en cardiomiocitos y su corta vidaútil 6.
Las cuestiones éticas relacionadas con el uso de células madre embrionarias (ES) pueden ser eludidas por las iPSC, que son una fuente prometedora de células. Además, las iPSCs poseen fuertes capacidades de auto-renovación y pueden diferenciarse en cardiomiocitos7. Los estudios han demostrado que los hiPSC-CM trasplantados en el sitio IM pueden sobrevivir y formar uniones de brecha con las células huésped 8,9. Sin embargo, debido a que estas células trasplantadas se encuentran en el microambiente de la isquemia y la inflamación, su tasa de supervivencia es extremadamente baja10,11.
Se han establecido varios métodos para mejorar la tasa de supervivencia de las células trasplantadas, como el pretratamiento de hipoxia y choque térmico de células trasplantadas12,13, la modificación genética 14,15 y el trasplante simultáneo de células y capilares 16. Desafortunadamente, la mayoría de los métodos están limitados por la complejidad y el alto costo. Por lo tanto, el presente estudio propone un método de administración de hiPSC-CM reproducible, conveniente, relativamente invasivo y efectivo.
La inyección de células intramiocárdicas guiada por ultrasonido se puede llevar a cabo solo con una pequeña máquina de ultrasonido veterinario de alta resolución y un microinyector, independientemente del sitio. Bajo la guía de ultrasonido, la entrega directa de células bajo el proceso xifoide desde el pericardio al miocardio en ratones es un protocolo seguro que evita el daño hepático y pulmonar. Este método se puede combinar simultáneamente con otras tecnologías para mejorar significativamente la tasa de supervivencia de las células trasplantadas.

<table><tbody><tr><td><fuerte>Anticuerpo</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Troponina T cardíaca</td><td>Abcam</td><td>ab8295</td><td></td></tr><tr><td>Burro Anti-Ratón IgG H& L (Alexa Fluor 488)</td><td>Abcam</td><td>ab150105</td><td></td></tr><tr><td>Burro Anti-Ratón IgG H& L (Alexa Fluor 555)</td><td>Abcam</td><td>ab150110</td><td></td></tr><tr><td>Burro Anti-Conejo IgG H& L (Alexa Fluor 488)</td><td>Abcam</td><td>ab150073</td><td></td></tr><tr><td>Burro Anti-Conejo IgG H& L (Alexa Fluor 555)</td><td>Abcam</td><td>ab150062</td><td></td></tr><tr><td>Troponina cardíaca humana T</td><td>Abcam</td><td>ab91605</td><td></td></tr><tr><td>Isolectina B4</td><td>Vector</td><td>FL-1201</td><td></td></tr><tr><td>Alfa actinina sarcomérica</td><td>Abcam</td><td>ab9465</td><td></td></tr><tr><td>Aglutinina de germen de trigo</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>W11261</td><td></td></tr><tr><td><reactivo fuerte>reactivo</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>00-4555-56</td><td></td></tr><tr><td>B27 Suplemento(menos insulina)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1895601</td><td></td></tr><tr><td>B27 Suplemento(sin suero)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17&ndash; 504-044</td><td></td></tr><tr><td>Solución de Bouin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SDHT10132</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Selleck</td><td>CT99021</td><td></td></tr><tr><td>ciclosporina A</td><td>Medchemexpress</td><td>HY-B0579</td><td></td></tr><tr><td>ROJO DIRECTO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>365548-25G</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Thermo Fisher Scientific 11320033</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNeasy Blood & Kit de pañuelos</td><td>Qiagen</td><td>69504</td><td></td></tr><tr><td>FAST GREEN FCF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&nbsp; F7252-5G</td><td></td></tr><tr><td>Sin glucosa RPMI 1640</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11879020</td><td></td></tr><tr><td>IWR1</td><td>Selleck</td><td>S7086</td><td></td></tr> ácido <tr><td>láctico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6661</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>BD356234</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>Tecnologías de células madre</td><td>72562</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T. Compuesto</td><td>SAKURA</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>PowerUP SYBR Kit MasterMix Verde</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A25742</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11875119</td><td></td></tr><tr><td>STEMdif Medio de congelación de cardiomiocitos/STEMdiff</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>5030</td><td></td></tr><tr><td>STEMdiff Medio de soporte para cardiomiocitos</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>5027</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>agente de acoplamiento de ultrasonidos</td><td>CARENT</td><td>22396269389</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Selleck</td><td>S6390</td><td></td></tr><tr><td>Equipment and Supplies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Applied Biosystems</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>7500 </td> Criostato de PCR <td></td>en tiempo real</tr><tr><td></td><td>Microscopio de</td> fluorescencia Leica <td>CM1950</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras anatómicas finas</td><td>Olympus</td> IX83 <td></td> Fine Science Tools 15000-08 <td></td></tr><tr><td>pinza de disección fina</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>Micro jeringa</td><td>Hamilton</td><td>7633</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> Animal pequeño <td></td></tr><tr><td> máquina de anestesia</td><td>MATRX</td><td>VMR</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de imagen de ultra alta resolución para pequeños animales</td><td>VisualSonics</td><td>Vevo 2100</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Statistical Product and Service Solutions</td><td>IBM</td><td>21</td><td></td></tr><tr><td>Image J</td><td>NIH</td><td>1.48</td><td></td></tr><tr><td>Human mitocondrial Cedadores de ADN</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>la secuencia de cebadores directa</td><td>CCGCTACCATAATCATCGCTAT</td> la secuencia de cebadores <td></td><td></td></tr><tr><td>inversa</td><td>TGCTAATACAATGCCAGTCAGG</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

implantación de cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducida por ultrasonido en ratones con infartado de miocardio

Ultrasound-Guided Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocyte Implantation in Myocardial Infarcted Mice

El objetivo clave de la terapia celular después del infarto de miocardio (IM) es mejorar eficazmente la tasa de injerto celular, y los cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidos por humanos (hiPSC-CM) son una fuente celular prometedora para la reparación cardíaca después del daño isquémico. Sin embargo, una tasa baja de injertos es un obstáculo significativo para la regeneración efectiva del tejido cardíaco después del trasplante. Este protocolo muestra que múltiples inyecciones percutáneas guiadas por ultrasonido hiPSC-CM en un área de IM aumentan efectivamente las tasas de trasplante celular. El estudio también describe todo el proceso de cultivo de hiPSC-CM, el pretratamiento y los métodos de administración percutánea guiados por ultrasonido. Además, el uso de ADN mitocondrial humano ayuda a detectar la ausencia de hiPSC-CMs en otros órganos de ratón. Por último, este artículo describe los cambios en la función cardíaca, la angiogénesis, el tamaño celular y la apoptosis en la zona fronteriza infartada en ratones 4 semanas después de la entrega celular. Se puede concluir que la inyección percutánea guiada por ecocardiografía del miocardio ventricular izquierdo es una terapia celular factible, relativamente invasiva, satisfactoria, repetible y efectiva.

La ecocardiografía para la evaluación de la función ventricular izquierda de los ratones en cada grupo reveló que las lesiones de IM se revirtieron efectivamente en el grupo de DM (Figura 2A). En comparación con el grupo IM, el grupo SD mostró un aumento de la fracción de eyección (FE) (del 30% al 35%; Figura 2B) y acortamiento de fracciones (FS) (del 18% al 22%; Figura 2C) después de MI. Sin embargo, es aún más crucial tener en cue...

La administración de células guiadas por ultrasonido alrededor del sitio del infarto de miocardio en ratones es una forma segura, efectiva y conveniente de trasplante de células.

Implantación de cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducida por ultrasonido en ratones con infartado de miocardio

The key objective of cell therapy after myocardial infarction (MI) is to effectively enhance the cell grafted rate, and human induced pluripotent stem ...

Este es el primer informe que demuestra que la inyección intramiocárdica percutánea guiada por ecocardiografía de cardiomiocitos mejora significativamente la propiedad reparadora de los cardiomiocitos humanos derivados de iPS. Este método es un procedimiento factible, satisfactorio, repetible, menos invasivo y efectivo para administrar terapia de cardiomiocitos derivados de iPS humanos. Creemos que la administración intramiocárdica percutánea es un método seguro y eficiente para la administración local de medicamentos para enfermedades como la cardiopatía isquémica, el infarto de miocardio y la insuficiencia cardíaca.Este proyecto está supervisado por el profesor Jinfu Yang y el profesor Jun Peng. demostrando el procedimiento estarán Xun Wu, Kele Qin y Kun Xiang, MD PhDs de mi laboratorio y Di Wang, PhD del Laboratorio Provincial Provincial Clave de Investigación Cardiovascular de Hunan. Para comenzar, aspirar al vacío el sobrenadante de cultivo de un cultivo de 60 días de hiPSC-CMs.Lave las celdas con PBS tres veces. Luego disocie los hiPSC-CM en células individuales usando la mezcla de enzimas de desprendimiento celular a 37 grados centígrados durante tres a cinco minutos. Recoja las células en un tubo de 15 mililitros que contenga cinco mililitros de RPMI más B27 medio y mezcle.Cuente las celdas y calcule el número total de celdas. Centrifugar la suspensión celular a 300G durante dos minutos a temperatura ambiente. Desechar el sobrenadante y resuspender el pellet en medio de soporte de cardiomiocitos a una concentración de 6 x 10 de las 4ª células por microlitro.Coloque el tubo a 37 grados centígrados hasta el paso de inyección. Después de que el ratón esté suficientemente anestesiado, fije las extremidades y la cola con cinta adhesiva. Luego, fije los incisivos del mouse con un hilo de seda 2/0 y cinta adhesiva.Esterilice el cuello mediano y el pecho izquierdo con tres rondas alternas de betaína seguidas de alcohol. Haga una incisión mediana en el cuello usando tijeras anatómicas finas y pinzas de disección finas. Corte algunos músculos cervicales anteriores para estabilizar y exponer completamente la tráquea.Inserte una aguja de punción con catéter de calibre 20 como un tubo traqueal a través de la boca. Conecte el tubo traqueal al ventilador y verifique el movimiento torácico para asegurarse de que ambos pulmones estén bien ventilados. Ajuste los parámetros de respiración.A continuación, vuelva a fijar la extremidad posterior izquierda al lado inferior derecho y afloje la cinta alrededor de la extremidad superior izquierda. Con tijeras y fórceps de disección fina, realice una toracotomía en el espacio intercostal de tres a cuatro del tórax izquierdo. Con fórceps, despegue el pericardio y localice la arteria coronaria descendente anterior izquierda.Use un hilo de seda 6/0 para ligar el extremo proximal de la arteria. Para asegurarse de que se establece el modelo de infarto agudo de miocardio, espere hasta que el lado distal de la arteria en el sitio de ligadura cambie de rojo a blanco. Cierra el pecho capa por capa y sutura la piel con hilo 4/0.Para el grupo simulado de animales, realice todos los procedimientos quirúrgicos excepto la ligadura. En las primeras dos semanas después del infarto de miocardio, coloque a los ratones en una caja de anestesia conectada con isofluorano al 5% y realice la intubación traqueal. Tres días antes de administrar hiPSC-CMs, inyecte ciclosporina A en la cavidad intraperitoneal a una dosis de 10 miligramos por kilogramo por día.Retire el vello del pecho y la parte superior del abdomen del ratón con crema depilatoria. Suministre isofluorano por inhalación hasta que la frecuencia cardíaca se mantenga en 400 a 500 latidos por minuto. Fije las extremidades y la cola del ratón con cinta adhesiva en la consola de detección y ajuste la temperatura de la plataforma a 37 grados centígrados.Aplique la jalea de ultrasonido en la parte superior del abdomen. Usando una sonda de ultrasonido veterinario de alta resolución, obtenga imágenes de hígado de ratón. Usando una microjeringa de cinco microlitros, extraiga aproximadamente 3 x 10 a los 5º hiPSC-CM.Sostenga la jeringa e inserte una aguja de tres milímetros en el proceso paraxifoide izquierdo. Bajo la guía de ultrasonido, siga el borde superior del diafragma. Observe el ritmo respiratorio y el rango.Ingrese al pericardio al final del círculo espiratorio, evitando daños en el hígado y el pulmón. Luego adquiera la imagen paraesternal de eje largo del corazón del ratón mediante ecocardiografía en modo B. Bajo guía ultrasónica, inyecte 1 x 10 a las 5ª células hiPSC-CMs en cada una de las tres áreas marginales del sitio del infarto.Retire la sonda de ultrasonido y enjuague la gelatina. Destete al ratón de la anestesia y devuélvelo a su jaula. Inyecte ciclosporina A continuamente durante un mes después del trasplante.El ecocardiograma del ventrículo izquierdo mostró que las lesiones debidas al infarto de miocardio se revirtieron en el grupo de dosis múltiples. El trasplante de hiPSC-CM también dio lugar a un aumento de la fracción de eyección y el acortamiento de la fracción. La medición de los parámetros cardíacos mediante tinción Sirius Red y Fast Green mostró que el tamaño del infarto y la fracción de volumen de colágeno disminuyeron, mientras que el grosor de la pared anterior del ventrículo izquierdo aumentó después del trasplante.El etiquetado de la alfa actina no específica en verde, DAPI en azul y troponina T específica para humanos en rojo mostró la presencia de células trasplantadas en el infarto y el área marginal del infarto. El número y el porcentaje de células trasplantadas fueron mayores en el grupo de dosis múltiple en comparación con la dosis única. 28 días después del infarto de miocardio, el grupo de dosis múltiples mostró un aumento en el número de células que expresan el marcador de células endoteliales, I-B4.La aglutinina de germen de trigo y la tinción de alfa actinina sarcomérica en cardiomiocitos mostraron una reducción en el diámetro mínimo de fibra. Un menor número de núcleos de cardiomiocitos positivos para túnel en el grupo de dosis múltiples indicó una reducción de la apoptosis. El análisis de PCR detectó el ADN mitocondrial humano solo en el corazón, mostrando un trasplante específico.Al insertar la aguja, asegúrese de que entre en la cavidad pericárdica junto con el margen superior del diafragma y al final del círculo espiratorio para evitar la lesión en el hígado o el pulmón.

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De suministro de células intramiocárdica en modelos murinos de enfermedades cardiovasculares, como la hipertensión o infarto de miocardio, es ampliamente utilizado para poner a prueba el potencial terapéutico de diferentes tipos de células en los estudios de regeneración. Por lo tanto, una descripción detallada y una visualización clara de este procedimiento quirúrgico ayudarán a definir los límites y las ventajas de los análisis de células terapéuticas cardiovasculares en pequeños roedores.

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Inyección intramiocárdica percutánea guiada por ecocardiografía representa una modalidad eficiente, fiable, y objeto de orientación para la entrega de agentes de transferencia de genes o células en el corazón murino. Siguiendo los pasos descritos en este protocolo, el operador puede convertirse rápidamente competente en esta técnica versátil, mínimamente invasivo.

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Presentamos tres protocolos nuevos y más eficientes para la diferenciación de células madre pluripotentes inducidos por el hombre en cardiomiocitos, células endoteliales, y células del músculo liso y un método de entrega que permite mejorar el injerto de las células transplantadas mediante la combinación de la inyección de células con la entrega de citoquinas parche mediada.

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Aquí, describimos la preparación de cortes ventriculares viables de ratones adultos y su uso para registros de potencial de acción de electrodos agudos. Estas preparaciones multicelulares proporcionan una estructura de tejido conservada in vivo como, lo que los convierte en un valioso modelo para estudios electrofisiológicos y farmacológicos in vitro .

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Aquí presentamos un protocolo para la inducción de la criocauterización ventricular izquierdo seguido de la implantación de un parche de músculo cardiaco, derivado de los cardiomiocitos células iPS humanas en un modelo del conejillo de Indias.

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En este protocolo, demostramos y profundizamos en cómo utilizar células madre pluripotentes inducidas por el hombre para la diferenciación y purificación de cardiomiocitos, y más adelante, sobre cómo mejorar su eficiencia de trasplante con inhibidor de la proteína quinasa asociada a Rho pretratamiento en un modelo de infarto de miocardio de ratón.

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Buscamos establecer un modelo porcino de insuficiencia cardíaca inducida por la obstrucción de la arteria circunfleja izquierda y un ritmo rápido para probar el efecto y la seguridad de la administración intramiocardial de células madre para terapias basadas en células.

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Células madre se investigan continuamente como tratamientos potenciales para individuos con daño miocárdico, sin embargo, su disminución de la viabilidad y retención dentro del tejido lesionado puede afectar su eficacia a largo plazo. En este manuscrito describimos un método alternativo para la entrega de células madre en un modelo murino de lesión por reperfusión de isquemia.

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Este protocolo tiene como objetivo trasplantar un parche bioimpreso 3D en el epicardio de ratones infartos modelando insuficiencia cardíaca. Incluye detalles sobre la anestesia, la abertura quirúrgica del pecho, la ligadura permanente de la arteria coronaria descendente anterior izquierda (LAD) y la aplicación de un parche bioimpreso en la zona infarta del corazón.

Trasplante de un parche bioimpreso 3D en un modelo murino de infarto de miocardio

La terapia basada en células madre ha surgido como una estrategia eficiente para reparar los tejidos cardíacos lesionados después del infarto de miocardio. Proporcionamos una aplicación in vivo óptima para el trasplante de células madre utilizando hidrogeles de gelatina que son capaces de ser enzimáticamente cruzados.

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Este artículo detalla un protocolo optimizado para inyecciones intramiocárdicas guiadas por ecocardiografía en modelos de infarto de miocardio en ratas utilizando una aguja de 29 G x 88 mm. Esta técnica garantiza una administración robusta, precisa y reproducible de agentes terapéuticos directamente en la zona periinfarto.

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Implantación de cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducida por ultrasonido en ratones con infartado de miocardio (Video) | JoVE Journal

Implantación de cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducida por ultrasonido en ratones con infartado de miocardio

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