Name: Un ensayo optimizado de extracción de una sola molécula para la cuantificación de la fosforilación de proteínas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: Aprende el ensayo SiMPull optimizado para cuantificar la fosforilación de proteínas mediante etiquetado de anticuerpos mejorado y condiciones de fijación que reducen la autofluorescencia.

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Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud R35GM126934, R01AI153617 y R01CA248166 a DSL. EMB fue apoyado a través del programa ASERT-IRACDA (NIH K12GM088021) y JAR por el programa UNM MARC (NIH 2T34GM008751-20). Agradecemos el uso del recurso compartido de microscopía de fluorescencia del Centro Integral del Cáncer de la Universidad de Nuevo México, respaldado por NIH P30CA118100. Queremos reconocer a los Dres. Ankur Jain y Taekijip Ha, cuyo desarrollo original de SiMPull inspiró este trabajo. ES-C presente dirección: Immunodynamics Group, Laboratory of Integrative Cancer Immunology, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, Bethesda

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<li>Chandradoss, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+passivation+for+single-molecule+protein+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Surface passivation for single-molecule protein studies.</a> Journal of Visualized Experiments. (86), e50549(2014).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El protocolo descrito aquí se optimizó para permitir mediciones cuantitativas de la fosforilación del receptor a nivel de proteína única. Se desarrollaron varias modificaciones sencillas pero importantes al protocolo SiMPull que mejoraron la confiabilidad de la medición para la detección de fosfo-tirosina, incluida la reducción de la autofluorescencia con el tratamiento con NaBH4 y la colocación posterior de la muestra para prevenir la disociación de anticuerpos. El uso de la máscara de canal verde para identi...

La señalización asociada a la membrana se sintoniza mediante una combinación de activación del receptor de membrana inducida por ligandos y reclutamiento de proteínas accesorias aguas abajo que propagan la señal. La fosforilación de tirosinas clave en las colas citoplasmáticas receptoras es fundamental para iniciar la formación de complejos de señalización, o tirosomas 1,2. Por lo tanto, una pregunta importante en biología es cómo se crean y mantienen los patrones de fosforilación para reclutar socios de señalización y dictar los resultados celulares. Esto incluye la comprensión de la heterogeneidad de la fosforilación del receptor, tanto en abundancia como en los patrones específicos de fosfotirosina que pueden proporcionar un medio para manipular las salidas de señalización al dictar la composición del signalosoma 3,4,5,6,7. Sin embargo, existen limitaciones en los métodos actuales para interrogar la fosforilación de proteínas. El análisis de Western blot es excelente para describir las tendencias de la fosforilación de proteínas, pero essemicuantitativo 8 y no proporciona información sobre la heterogeneidad del sistema porque se promedian entre miles y millones de receptores. Si bien los western blots permiten sondear una muestra utilizando anticuerpos fosfoespecíficos contra tirosinas específicas, no pueden proporcionar información sobre los patrones de fosforilación multisitio dentro de la misma proteína. La fosfoproteómica cuantitativa informa sobre la abundancia de fosfotirosina, pero existen limitaciones para detectar la fosforilación multisitio, ya que los residuos de interés deben ubicarse dentro del mismo péptido (típicamente 7-35 aminoácidos) que se genera por la digestión enzimática 9,10,11.
Para superar las limitaciones mencionadas anteriormente, el ensayo de extracción de una sola molécula (SiMPull) se ha adaptado para cuantificar los estados de fosforilación de los receptores intactos a nivel de molécula única. SiMPull fue demostrado por primera vez como una poderosa herramienta para interrogar complejos macromoleculares por Jain et al.12,13. En SiMPull, los complejos macromoleculares fueron inmunoprecipitados (IP) en cubiertas de vidrio funcionalizadas por anticuerpos y luego analizados a través de microscopía de molécula única para el número de subunidades de proteínas y co-IP con componentes complejos12. Una modificación de Kim et al.14, denominada SiMBlot, fue la primera en utilizar una variación de SiMPull para analizar la fosforilación de proteínas desnaturalizadas. El protocolo SiMBlot se basa en la captura de proteínas biotiniladas de la superficie celular utilizando cápsulas recubiertas de NeutrAvidin, que luego se sondean para la fosforilación con el etiquetado de anticuerpos fosfoespecíficos14. A pesar de estos avances, se necesitaron mejoras para hacer que la cuantificación de la modificación posttraduccional fuera más robusta y aplicable a una gama más amplia de proteínas.
El presente protocolo describe un enfoque optimizado de SiMPull que se utilizó para cuantificar los patrones de fosforilación del receptor intacto del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) en respuesta a una variedad de condiciones de ligando y mutaciones oncogénicas15. Si bien este trabajo se centra en EGFR, este enfoque se puede aplicar a cualquier receptor de membrana y proteínas citosólicas de interés (POI), para las cuales se dispone de anticuerpos de calidad. El protocolo incluye pasos para reducir la autofluorescencia de la muestra, un diseño de matriz de muestras que requiere un volumen mínimo de muestras con la preparación simultánea de hasta 20 muestras, y la optimización del etiquetado de anticuerpos y las condiciones de fijación. Se han desarrollado algoritmos de análisis de datos para la detección de moléculas individuales y la cuantificación de proteínas fosforiladas.

<table><tbody><tr><td>Tubos de microcentrífuga de 1,5 mL</td><td>MTC Bio</td><td>C2000</td><td></td></tr><tr><td>10 mM Tris-HCl pH 7,4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mM Tris-HCl pH 8,0/ 50 mM NaCl</td><td></td><td></td><td>T50 Tampón</td></tr><tr><td>100 mm Placa de cultivo de tejidos</td><td>CELLTREAT</td><td>229620</td><td>Almacenamiento de vidrio grabado con pirañas/matrices</td></tr><tr><td>Tubo</td><td></td><td></td><td></td>cónico de 15 mL</tr><tr><td>16% Paraformaldehído Acuoso Solución</td><td>Microscopía Electrónica Ciencias</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Peligroso Tubo</td><td></td><td></td> cónico de 50 mL <td>Funcionalizado Almacenamiento de vidrio/ Reutilización de KOH</td></tr><tr><td>50 mM Tris-HCl pH 7,2/150 mM NaCl</td><td></td><td></td><td>Componente tampón de lisis</td></tr><tr><td>60 mm Placa de cultivo de tejidos</td><td>Corning</td><td>430166</td><td></td></tr> 8<tr><td>% de glutaraldehído Solución acuosa</td> Ciencias <td>de la Microscopía Electrónica</td><td>16020</td><td>Acetona peligrosa</td></tr><tr><td>(C3H6O)</td><td>Millipore Sigma</td><td>270725</td><td>Peligrosa</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 NHS Ester</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-20006</td><td></td></tr><tr><td>EGF humano recombinante sin animales</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>EGFR antihumano (dominio externo) &ndash; Biotina</td><td>Leinco Technologies, Inc</td><td>E101</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo Anti-p-Tyr (PY99) Alexa Fluor 647</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-7020 AF647</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator de baño</td><td>Branson</td><td>1200</td><td></td></tr><tr><td>BCA Kit de ensayo de proteínas</td><td>Pierce</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>Biotina-PEG</td><td>Laysan Bio</td><td>Biotina-PEG-SVA, MW 5.000</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina</td> <td>sérica bovinaGold Biotechnology</td><td>A-420-1</td><td>Componente tampón de Tyrode</td></tr><tr><td>Embudo</td><td></td><td></td><td></td>Buchner</tr><tr><td>Quemador Bunsen Cloruro</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>de calcio (CaCl2)</td><td>Millipore Sigma</td><td>C4901</td><td>Tyrode's Buffer Component</td></tr><tr><td>Cell Scraper</td><td>Bioworld</td><td>30900017-1</td><td></td></tr><tr><td>Matraz filtrante cónico</td><td>Fisher Scientific</td><td>S15464</td><td></td></tr><tr><td>Tarro Coplin</td><td>WHEATON</td><td>900470</td><td></td></tr><tr><td>Countess II Contador de células automatizado</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AMQAX1000</td><td></td></tr><tr><td>cubreobjetos 24 x 60 #1.5</td><td>Ciencias de la Microscopía Electrónica</td><td>63793</td><td></td></tr><tr><td>DipImage</td><td></td><td></td><td>https://diplib.org/</td></tr> <tr><td>DMEM</td><td>Caisson Labs</td><td>DML19-500</td><td></td></tr><tr><td>Cámara emCCD</td><td>Andor iXon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino, Optima</td><td>Bio-Techne</td><td>S12450H</td><td>software Fusion 360 inactivado por calor</td></tr><tr><td></td><td>Autodesk</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Geneticin G418 Disulfato</td><td>Caisson Labs</td><td>G030-5GM</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético glacial (CH3COOH)</td><td>JT Baker</td><td>JTB-9526-01</td><td>Peligroso</td></tr><tr><td>Pipetas serológicas de</td><td></td><td></td><td></td>vidrio</tr><tr><td>Varilla de agitación de vidrio</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glucosa (D-(+)-glucosa)</td><td>Millipore Sigma</td><td>D9434</td><td>Tyrode's Buffer</td></tr><tr><td>Component Halt Phosphotasa and Proteasa Inhibitor Cocktail (100X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>78446</td><td>Lysis Buffer Component</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Millipore Sigma</td><td>H3375</td><td>TyrodeComponente tampón Ácido</td></tr><tr><td>clorhídrico (HCl)</td><td>VWR</td><td>BDH7204-1</td><td>Peróxido</td></tr><tr><td>de hidrógeno peligroso (H2O2) (3%)</td><td></td><td>HX0645</td><td></td></tr><tr><td>Peróxido de hidrógeno (H2O2) (30%)</td><td>EMD Millipore</td><td>HX0635-2</td><td></td></tr><tr><td>Ice</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630 ( NP-40)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I8896</td><td>Componente de tampón de lisis</td></tr><tr><td>ImmEdge Barrera hidrofóbica</td><td>Pluma Vector Laboratories</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>Immersol 518F aceite de inmersión</td><td>Zeiss</td><td>444960-0000-000</td><td></td></tr><tr><td>línea</td><td></td><td></td><td></td>de vacío interna</tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030-164</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio hexahidratado (MgCl2-6H2O)</td><td>MPBio</td><td>2191421</td><td>Tyrode's Buffer Component</td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks</td><td></td><td>Curve Fitting Toolbox, Parallel Computing Toolbox y Statistics and Machine Learning toolbox</td></tr><tr><td>Metanol (CH3OH)</td><td>IBIS Scientific</td><td>MX0486-1</td><td>Agua</td></tr> <tr><td></td><td>peligrosa Milli-Q</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kits de etiquetado de anticuerpos Mix-n-Stain CF Dye</td><td>Biotium</td><td>92245</td><td>Kit de conjugación</td></tr><tr><td>sugerido mPEG</td><td>Laysan Bio</td><td>Valerato de mPEG-succinimidilo, MW 5,000</td><td></td></tr><tr><td>N-(2-aminoetil)-3-aminopropiltrimetoxisilano</td><td>UCT United Chemical</td><td>A0700</td><td>Nanogrid</td></tr> peligroso <tr><td></td><td>Miraloma Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NeutrAvidin Biotina Proteína de unión</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31000</td><td></td></tr><tr><td>Nitrógeno (gas comprimido)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GPU NVIDIA con CUDA</td><td></td><td></td><td>Busque la compatibilidad en https://www.mathworks.com/help/parallel-computing/gpu-support-by-release.html</td></tr><tr><td>Microscopio Olympus iX71</td> Película de sellado <td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>The Lab Depot</td><td>HS234526C</td><td></td></tr><tr><td>PBS pH 7.4</td><td>Caisson Labs</td><td>PBL06</td><td></td></tr><tr><td>PC-200 Placa calefactora analógica</td><td>Corning</td><td>6795-200</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina (10,000 U/mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-163</td><td></td></tr><tr><td>Receptor de fosfo-EGF (Tyr1068) (1H12)</td><td>Tecnología de señalización de células</td> mAb <td>de ratón 2236BF</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de potasio (KCl)</td><td>Millipore Sigma</td><td>529552</td><td>Tyrode's Buffer Component</td></tr><tr><td>Hidróxido de potasio (KOH)</td><td>Millipore Sigma</td><td>1050330500</td><td></td></tr><tr><td>Filamento PLA premium peligroso, 1,75 mm de diámetro</td><td>Raise 3D</td><td>PMS:2035U/RAL:3028</td><td>Rango de temperatura de impresión: 205-235 &deg; </td></tr><tr><td>Impresora 3D C Pro2</td><td>Raise 3D</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pyrex 1 L vaso de precipitados</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PYREX 100 mL</td> botellas de almacenamiento <td>Corning</td><td>1395-100</td><td>CH3OH/C3H6O reutilización</td></tr><tr><td>Pyrex 250 mL</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vaso</td><td></td><td></td><td></td>Pyrex 4 L</tr><tr><td>Vista cuádruple Fotometría divisora</td><td></td><td>modelo QV2</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga refrigerada</td><td>Eppendorf</td><td>EP-5415R</td><td></td></tr><tr><td>RevCount Contadores de celdas, EVE Portaobjetos de recuento de celdas</td><td>VWR</td><td>10027-446</td><td></td></tr><tr><td>Filtros de emisión Semrock: azul (445/45 nm), verde (525/45 nm), rojo (600/37 nm), rojo lejano (685/40 nm)</td>Controlador de pipetas <td>serológicas Semrock</td><td>LF405/488/561/635-4X4M-B-000</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> Paquete de <tr>análisis <td></td><td></td> de molécula única de pipetas<td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td></td><td></td><td></td>smite</tr> smite https://github.com/LidkeLab/smite.git <tr><td>Bicarbonato de sodio (NaHCO3)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>Borohidruro de sodio peligroso (NaBH4)</td><td>Millipore Sigma</td><td>452874</td><td>Tyrode' s Componente tampón</td></tr><tr><td>Cloruro de sodio (NaCl)</td><td>Millipore Sigma</td><td>S9625</td><td>Activar por ciclos sucesivos de calor y pH</td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio</td><td>VWR</td><td>BDH3247-1</td><td></td></tr><tr><td>Ortovanadato de sodio (Na3VO4)</td><td>Millipore Sigma</td><td>S6508</td><td></td></tr><tr><td>Ácido sulfúrico peligroso (H2SO4)</td><td>Millipore Sigma</td><td>258105</td><td>Microesferas TetraSpeck peligrosas</td></tr><tr><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T7279</td><td>perlas multifluorescentes</td><td></td></tr><tr><td>Base Tris (Trizma)</td><td>Millipore Sigma</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Tinte azul de tripano, 0,4 %</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>tripsina-EDTA 0,05 %</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25300120</td><td></td></tr></tbody></table>

un ensayo optimizado de extracción de una sola molécula para la cuantificación de la fosforilación de proteínas

An Optimized Single-Molecule Pull-Down Assay for Quantification of Protein Phosphorylation

La fosforilación es una modificación posttraduccional necesaria que regula la función de la proteína y dirige los resultados de la señalización celular. Los métodos actuales para medir la fosforilación de proteínas no pueden preservar la heterogeneidad en la fosforilación a través de proteínas individuales. El ensayo pull-down de una sola molécula (SiMPull) se desarrolló para investigar la composición de complejos macromoleculares a través de la inmunoprecipitación de proteínas en una cubierta de vidrio seguida de imágenes de una sola molécula. La técnica actual es una adaptación de SiMPull que proporciona una cuantificación robusta del estado de fosforilación de los receptores de membrana de longitud completa a nivel de molécula única. La obtención de imágenes de miles de receptores individuales de esta manera permite cuantificar los patrones de fosforilación de proteínas. El presente protocolo detalla el procedimiento Optimizado de SiMPull, desde la preparación de la muestra hasta la obtención de imágenes. La optimización de la preparación de vidrio y los protocolos de fijación de anticuerpos mejora aún más la calidad de los datos. El protocolo actual proporciona código para el análisis de datos de una sola molécula que calcula la fracción de receptores fosforilados dentro de una muestra. Si bien este trabajo se centra en la fosforilación del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), el protocolo puede generalizarse a otros receptores de membrana y moléculas de señalización citosólica.

Una caricatura que representa el proceso SiMPull se muestra en la Figura 1A. Los trips se funcionalizan utilizando NeutrAvidin como ancla para anticuerpos anti-EGFR biotinilados para capturar EGFR-GFP de lisados de proteínas totales. Después de lavar la proteína no unida, los receptores fosforilados se etiquetan con un anticuerpo antifosfototirosina (anti-PY)15. La Figura 1B muestra una imagen de la matriz hidrofóbica, donde se pueden pre...

El presente protocolo describe la preparación de muestras y el análisis de datos para cuantificar la fosforilación de proteínas utilizando un ensayo mejorado de extracción de una sola molécula (SiMPull).

Un ensayo optimizado de extracción de una sola molécula para la cuantificación de la fosforilación de proteínas

Phosphorylation is a necessary posttranslational modification that regulates protein function and directs cell signaling outcomes. Current methods to ...

Este protocolo SiMPull permite una cuantificación de la fosforilación de proteínas al mejorar el etiquetado de anticuerpos y las condiciones de fijación, reducir la autofluorescencia que se encuentra en el canal verde y proporcionar algoritmos robustos de análisis de moléculas individuales. La principal ventaja de SiMPull es que nos permite interrogar el estado de fosforilación de proteínas intactas individuales. Con este método, podemos obtener información novedosa que no es accesible a través de técnicas tradicionales, como western blotting y análisis de especificaciones de masas.Tenemos un equipo de investigadores para ayudar a demostrar el protocolo. En primer lugar, Julián Rojo mostrará cómo grabar pirañas en el vidrio de la cubierta. Rachel Grattan mostrará los pasos para el recubrimiento del vidrio de la cubierta.Y Elizabeth Bailey mostrará cómo dibujar la matriz y las muestras de imágenes. Para comenzar, la piraña graba los resbalones de la cubierta agitando suavemente el vaso de precipitados de reacción cada cinco minutos durante 30 minutos. Neutralizó la solución de piraña agregando gradualmente una base débil.Con una varilla de vidrio, transfiera los deslizamientos de la cubierta grabada a un embudo de Buchner y enjuague durante cinco minutos en agua destilada doble. Luego coloque los resbalones de la cubierta en un frasco de vidrio Coplin y cúbralos con metanol. Selle la tapa con una película de sellado y sonicato de baño durante 10 minutos.Después de la sonicación, vacíe el metanol en una botella de almacenamiento de vidrio. Repita este paso con acetona. Enjuague los resbalones de la cubierta tres veces con agua destilada doble en el frasco Coplin.Escurra el agua de los resbalones de la cubierta y séquelos agitando la llama de un quemador Bunsen. Coloque los resbalones de la cubierta en un frasco de Coplin seco. Luego agregue la solución de amino silano al frasco de Coplin para realizar la aminosilización de deslizamiento de cubierta.Cubra y aplique una película de sellado para proteger de la luz. Enjuague los resbalones de la cubierta con metanol y deseche la solución utilizada. Una vez más, enjuague los resbalones de la cubierta tres veces con agua destilada doble durante dos minutos cada uno.Elimine el exceso de humedad y seque completamente al aire durante 10 minutos. A continuación, dibuje la matriz de rejilla con una pluma de barrera hidrofóbica. Marque un identificador en la hoja de la cubierta para identificar la orientación adecuada.Después de que la tinta se seque, coloque los resbalones de la cubierta en una cámara humidificada. Resuspend 153 miligramos de mPEG y 3,9 miligramos de biotina-PEG en 609 microlitros de bicarbonato de sodio 10 milimolares y vórtice. Centrifugar a 10.000 x g desde un minuto a temperatura ambiente para eliminar burbujas.Aplique de 10 a 15 microlitros de esta solución por cuadrado para cubrir completamente la matriz sin desbordamiento. Guarde los deslizamientos de la cubierta en la cámara de humedad en la oscuridad durante tres o cuatro horas a temperatura ambiente. Luego lave los resbalones de la cubierta sumergiéndolos durante 10 segundos secuencialmente en tres vasos de precipitados llenos de agua destilada doble.Retire toda la humedad de los resbalones de la cubierta con gas nitrógeno. Guarde los resbalones de la cubierta espalda con espalda en un tubo cónico de 50 mililitros lleno de nitrógeno y selle con una película de sellado. Envuelva el tubo con una película de sellado y colóquelo a menos 20 grados centígrados.Retire las matrices funcionalizadas de biotina-PEG del congelador y equilibre a temperatura ambiente. Coloque el resbalón de la cubierta con la matriz hacia arriba sobre un plato de cultivo de tejidos de 100 milímetros forrado con película de sellado. Incube cada cuadrado de la matriz con 10 miligramos por mililitro de borohidruro de sodio en PBS durante cuatro minutos a temperatura ambiente.Lavar tres veces con PBS. A continuación, incubar con 0,2 miligramos por mililitro de NeutrAvidin en T50 durante cinco minutos, seguido de lavar tres veces con T50 BSA. Repita la incubación con dos microgramos por mililitro de anticuerpo biotinilado específico POI en T50 BSA durante 10 minutos seguido de lavado.Primero, mezcle el lisado mediante pipeteo. Diluya un microlitro del lisado en 100 microlitros de PPI T50 BSA frío. Incubar el lisado en la matriz durante 10 minutos, seguido de lavado.Prepare el anticuerpo antifosfototirosina conjugado AF647 en el PPI T50 BSA helado e incube en la matriz durante una hora. Deposite una gota de petróleo en el objetivo. Coloque la nanorred en el escenario para obtener imágenes.Usando la luz blanca transmitida, concéntrese en el patrón de cuadrícula. Adquiere una serie de 20 imágenes de la cuadrícula, asegúrate de que los píxeles no estén saturados y guarda la serie de imágenes como fiducial. Desenfoque la nanorred para crear un patrón aireado, adquiera una serie de 20 imágenes para calibraciones de ganancia y guarde la imagen como ganancia.A continuación, adquiera una serie de 20 imágenes para el desplazamiento de la cámara bloqueando toda la luz de la cámara y guarde el fondo de las imágenes. Para adquirir imágenes simples, primero, limpie el objetivo de aceite y deposite aceite adicional en el objetivo. Asegure la matriz de deslizamiento de la cubierta en el escenario del microscopio.Adquiera imágenes para cada muestra, primero en el canal rojo lejano, seguido de fluoróforos de menor longitud de onda. Compruebe el nivel del búfer cada 30 a 45 minutos y reponga según sea necesario. Usando esta técnica, EGFR-GFP fue capturado de lisados de proteínas totales.La autofluorescencia de la tinta hidrofóbica se utilizó como guía para encontrar el plano focal de la muestra. Las imágenes de datos en bruto se adquirieron con canales espectrales separados en el chip de la cámara. Se examinó más a fondo una superposición de los canales verde y rojo lejano para la adquisición de datos.El registro del canal se realizó en imágenes adquiridas de la nanorred. Una superposición de imágenes fiduciales mostró un registro incompleto. La alineación se realizó aplicando una transformada media ponderada local en las coordenadas de los canales rojo lejano y verde, que se utilizó para registrar los datos posteriores de SiMPull.Se almacenaron emisores individuales por encima del recuento de fotones de fondo de los canales GFP y AF647 y se realizó una localización gaussiana para identificar las ubicaciones. La colocalización de EGFR-GFP en un F647 se realizó para identificar receptores fosforilados. Y el porcentaje de colocalización se utilizó para determinar la fracción de receptores fosforilados.Las detecciones de fondo se redujeron cuando el vidrio grabado con piraña se trató con borohidruro de sodio. Se observó una unión robusta de EGFR-GFP en el lisado con una unión mínima inespecífica PY99-AF647, mostrando retención de la funcionalización de la superficie utilizando esta técnica. SiMPull proporciona información sobre la fosforilación de proteínas y puede abordar una amplia gama de preguntas de autopuntuación.Esto puede mejorar nuestra comprensión de la señalización tanto en estados normales como de enfermedad.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

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Phosphoproteomics cuantitativo de ácidos grasos estimulada Saccharomyces cerevisiae</em

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