Investigación de los efectos paliantes de la administración de Bacillus cereus en la colitis a través de la modulación de la microbiota intestinal

Este protocolo permite evaluar el efecto regulador bidireccional de la suplementación con probióticos sobre la salud y resultados estables y reproducibles. Se estableció un modelo alternativo de colitis inducida por DSS utilizando ratones pseudo libres de gérmenes para evitar algunas limitaciones de laboratorio en el uso de ratones libres de gérmenes como receptores de probióticos. Explorar los efectos beneficiosos de los probióticos en esta técnica, es un enfoque prometedor para desarrollar nuevas estrategias de tratamiento para aliviar los síntomas de los trastornos inflamatorios crónicos asociados.

Para comenzar, prepare un cóctel de antibióticos disolviendo ampicilina, sulfato de neomicina, metronidazol y vancomicina en agua potable. Después de la disolución completa, almacene las soluciones a cuatro grados centígrados. Ponga las soluciones de cóctel de antibióticos en una botella de agua.

Asegúrese de usar botellas marrones o envuélvalas con papel de aluminio para proteger las soluciones antibióticas de la luz. Coloque la botella encima de la jaula del ratón. Para hacer una solución de sulfato de dextrano sódico al 2,5%, disuelva 2,5 gramos de DSS en 100 mililitros de agua destilada.

Reemplace el agua potable con la solución DSS al 2.5% en el grupo de ratones modelo de colitis. Para evaluar el efecto positivo de B cereus en el alivio de la colitis, asigne aleatoriamente a los ratones a los siguientes tres grupos, el grupo de control, el modelo de colitis inducida por DSS y la suplementación con probióticos B cereus para ratones inducidos por DSS. Para explorar el papel de la microbiota intestinal en la regulación de los efectos probióticos de B cereus en la colitis inducida por DSS, asigne aleatoriamente a los ratones en los siguientes tres grupos, ABX/control, ABX/DSS y ABX/B cereus más DSS.

Registre el peso corporal de los ratones como el peso de referencia después de la administración del cóctel de antibióticos. Tratar inmediatamente a los seis ratones machos C 57 BL con una solución de DSS al 2,5% en agua potable durante siete días. Prepare ocho tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros llenos de 900 microlitros de solución salina normal estéril.

Pipetear 100 microlitros de crecimiento logarítmico B cereus y disolver en 900 microlitros de solución salina normal estéril. Diluir en serie B cereus usando tubos. Coloque 40 microlitros de cada dilución en la placa de agar LB respectiva etiquetada con la relación de dilución.

Repita tres veces para cada proporción de dilución. Cultive las placas en una incubadora de temperatura constante de 37 grados centígrados durante 16 horas. Seleccione las placas con aproximadamente 20 a 70 colonias para contar.

Después de la cuantificación de B cereus, recolectar un mililitro de medio B cereus que contenga uno por 10 a la novena UFC y centrifugar a 8, 000 G durante 10 minutos. Luego lave las células bacterianas dos veces con agua estéril por centrificación a 8, 000 G durante 10 minutos y retire el sobrenadante. Diluir el B cereus concentrado con solución salina normal estéril hasta una concentración final de dos veces 10 a la octava UFC por 200 microlitros.

Pipetear la dilución hacia arriba y hacia abajo repetidamente para adquirir una suspensión dispersa de B cereus. Limpie el exterior de la aguja de sonda con etanol al 70% y mantenga la aplicación de dosis adecuada. Para sujetar a los ratones, levántelos por la cola y agarre la piel suelta de la espalda firmemente con el extremo de la cola fijado entre los dos últimos dedos del adiestrador.

Mantenga a los ratones en posición vertical. Luego inserte la aguja de sonda con cuidado y suavemente a través de la boca hasta el esófago. Administre la solución de B cereus, retire la aguja suavemente y devuelva el ratón a su jaula.

Mida el peso corporal de los ratones diariamente y recolecte las muestras de heces inmediatamente en un tubo de centrífuga esterilizado. Determine la sangre oculta en heces mediante papel de prueba de sangre oculta en heces. Recoja 10 miligramos de muestra de heces en un aplicador.

Coloque la muestra en la tarjeta de prueba y aplique un frotis delgado a la tarjeta. Abra la solapa trasera y aplique el revelador sobre el frotis. Fije los ratones en posición supina en la mesa de operaciones y abra la cavidad peritoneal.

Separe todo el colon quirúrgicamente y mida la longitud con una regla. Luego, lave suavemente el colon con una jeringa de cinco mililitros llena de PBS preenfriado. Desencerar e hidratar las secciones del colon.

A continuación, tiñe las secciones del colon con hematoxilina y eosina. Deje que dos experimentadores independientes evalúen los puntajes histológicos de la muestra bajo un microscopio óptico, la tinción de hematoxilina y eosina reveló que el tejido del colon de los ratones modelo de colitis presentaba pérdida de criptas, daño de células caliciformes, infiltración de células inflamatorias y pérdida de epitelio. El tratamiento con B cereus mejoró el daño histopatológico inducido por el DSS.

Las puntuaciones histopatológicas de los ratones con colitis fueron significativamente más altas que en el grupo de control. Sin embargo, las puntuaciones histopatológicas en el grupo B cereus fueron significativamente más bajas que en los ratones con colitis. Los ratones se asignaron aleatoriamente en tres grupos, la pérdida de peso corporal, las puntuaciones DAI y las puntuaciones histopatológicas fueron más altas y la longitud del colon fue más corta en el grupo ABX/DSS en comparación con los ratones en el grupo ABX/control.

La pérdida de peso corporal, la longitud del colon, las puntuaciones de DAI y las puntuaciones histopatológicas no fueron estadísticamente diferentes entre los grupos ABX/DSS y ABX/B cereus más DSS. Los presentes resultados sugieren indirectamente que la microbiota intestinal juega un papel clave en los efectos positivos de B cereus sobre la colitis. Uno de los pasos más importantes es utilizar Bacillus cereus por el método de sonda para construir el modelado de colitis en ratones.

El tratamiento de Bacillus cereus eliminó la colitis inducida por DSS, lo que llevó a una fundación para el estudio de seguimiento de probióticos para el tratamiento de la colitis.