Name: Tipo de fibra y análisis subcelular específico del contenido de gotas lipídicas en el músculo esquelético (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-08T13:40:00.000+00:00
Duration: 11 min 50 s
Description: Aprende a cuantificar gotas lipídicas y analizar su morfología en fibras musculares específicas usando tinción con Bodipy. Este protocolo permite el procesamiento simultáneo de muestras y la automatización del análisis.

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Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Fonds National de la Recherche Scientifique (FNRS-Crédit de Recherche J.0022.20) y la Société Francophone du Diabète (SFD-Roche Diabetes Care).C.M.S. es el receptor de una beca de doctorado de la FRIA (FNRS). M.A.D.-L.d.C. recibió una beca del Programa de Excelencia Internacional Wallonie-Bruxelles.
Los autores agradecen a Alice Monnier por su contribución al desarrollo de este protocolo y a Caroline Bouzin por su experiencia y ayuda técnica en el proceso de adquisición de imágenes. También agradecemos a la plataforma de imágenes 2IP-IREC por el acceso al criostato y los microscopios (2IP-IREC Imaging Platform, Institute of Experimental and Clinical Research, Université Catholique de Louvain, 1200 Bruselas, Bélgica). Finalmente, los autores desean agradecer a Nicolas Dubuisson, Romain Versele y Michel Abou-Samra por la crítica constructiva del manuscrito. Algunas de las figuras de estos artículos fueron creadas con BioRender.com.

Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.

El protocolo detallado aquí describe un método eficiente para cuantificar los LD etiquetados con Bodipy sobre una base específica de tipo de fibra y subcelular. En los últimos años, los colorantes lipídicos clásicos, como ORO o Sudan Black B, han sido sustituidos por una nueva gama de colorantes fluorescentes, lipofílicos y permeables a las células que se unen a lípidos neutros (por ejemplo, Bodipy). Disponible como diferentes conjugados, Bodipy ha demostrado ser muy eficaz en el etiquetado de LD para estudiar su morfolo...

La infiltración de lípidos del músculo esquelético, conocida como miosteatosis, aumenta con la obesidad y el envejecimiento. La miostetosis se correlaciona negativamente con la masa muscular y la fuerza y con la sensibilidad a la insulina1. Además, estudios recientes indican que el grado de miosteatosis podría usarse como factor pronóstico para otras afecciones como la enfermedad cardiovascular2, la enfermedad del hígado graso no alcohólico3 o el cáncer4. Los lípidos pueden acumularse en el músculo esquelético entre las fibras musculares como lípidos extramiocelulares o dentro de las fibras, como lípidos intramiocelulares (MMCL). Los MMCL se almacenan predominantemente como triglicéridos en gotas lipídicas (LD) que se utilizan como combustible metabólico durante el ejercicio físico 5,6. Sin embargo, cuando el suministro de lípidos excede la demanda, o cuando las mitocondrias se vuelven disfuncionales, las MMCL estarán implicadas en la resistencia muscular a la insulina, como se ve en individuos obesos metabólicamente insalubres y en pacientes con diabetes tipo 27. Curiosamente, los atletas de resistencia tienen niveles similares, si no más altos, de MMCL a los que se encuentran en pacientes obesos con diabetes mellitus tipo 2, mientras que mantienen una alta sensibilidad a la insulina. Este fenómeno se describe como la "paradoja del atleta"8,9, y se explica por una evaluación más matizada de los LD musculares, relacionados con su tamaño, densidad, localización, dinámica y composición de especies lipídicas.
En primer lugar, el tamaño de la DA está inversamente correlacionado con la sensibilidad a la insulina y la aptitud física10,11. De hecho, los LD más pequeños exhiben un área de superficie relativamente mayor para la acción de la lipasa y, por lo tanto, potencialmente tienen una mayor capacidad para movilizar lípidos12. En segundo lugar, la densidad de LD (número/superficie) juega un papel controvertido en la acción de la insulina 8,10; sin embargo, parece estar aumentado en los atletas. En tercer lugar, la localización subcelular de los LD es importante, ya que los LD situados justo debajo de la membrana superficial (subsarcolémmica o periférica) ejercen un efecto más perjudicial sobre la sensibilidad a la insulina que los centrales 8,9,13. Estos últimos proporcionan combustible a las mitocondrias centrales, que tienen una mayor actividad respiratoria y están más especializadas para satisfacer la alta demanda de energía requerida para la contracción14. Por el contrario, los LD periféricos suministran mitocondrias subsarcolemmales, que están involucradas en procesos relacionados con la membrana8. Finalmente, más allá de los triglicéridos, los lípidos complejos específicos dentro del músculo pueden ser más perjudiciales que otros. Por ejemplo, el diacilglicerol, el acil-CoA de cadena larga y las ceramidas pueden acumularse en el músculo cuando la tasa de renovación de triglicéridos es baja, lo que afecta la señalización de la insulina 9,15. Volviendo a la "paradoja del atleta", los atletas de resistencia tienen un alto número de LD centrales más pequeños con tasas de rotación elevadas en fibras tipo I (oxidativas), mientras que los pacientes obesos y diabéticos tienen LD periféricos más grandes con bajas tasas de renovación en fibras tipo II (glucolíticas) 8,15,16. Además de su papel en el almacenamiento y liberación de energía, los LD a través de ácidos grasos derivados (FA) y una proteína de capa (perilipina 5) también podrían funcionar como actores críticos involucrados en la regulación transcripcional de la oxidación de FA y la biogénesis mitocondrial8. Debido a sus implicaciones cruciales en fisiología y fisiopatología, se justifican estudios en profundidad sobre la dinámica y las funciones de los LD.
Aunque existen varias técnicas para estudiar las IGMCL, no todas son adecuadas para cuantificar con precisión el tamaño, la densidad y la distribución de la LD de una manera específica de la fibra. Por ejemplo, la evaluación de los MMCL por espectroscopia de resonancia magnética, si bien no es invasiva, ofrece un nivel de resolución que no es suficiente para estudiar el tamaño y la ubicación precisa de los LD dentro de la fibra, y no es específico del tipo de fibra17,18. Del mismo modo, las técnicas bioquímicas realizadas en homogeneizados de músculo entero19 no pueden evaluar la ubicación y el tamaño de los lípidos. En consecuencia, el método más adecuado para analizar la morfología y la ubicación de la DA es la microscopía electrónica de transmisión cuantitativa13, pero esta técnica es costosa y requiere mucho tiempo. Por lo tanto, la imagen de fluorescencia confocal en preparaciones con colorantes como Oil Red O (ORO)20,21, monodansilipentano (MDH)22 o Bodipy 23,24,25, se ha convertido en la mejor herramienta para estos estudios.
Aquí, se describe un protocolo completo, que incluye muestreo y procesamiento de tejidos, tinción de Bodipy y adquisición y análisis de imágenes confocales para cuantificar el tamaño, el número y la localización de LD en criosecciones musculares de ratón. Dado que los MMCL no están distribuidos uniformemente entre las fibras oxidativas y glucolíticas, y cada tipo de fibra regula la dinámica de la LD de manera diferente, el estudio de los MMCL debe ser específico del tipo de fibra 16,25,26,27. Por lo tanto, este protocolo utiliza inmunofluorescencia en secciones seriadas para identificar las isoformas de cadena pesada de miosina (MyHC) expresadas por cada fibra. Otra ventaja de este protocolo es el procesamiento simultáneo de un músculo glicolítico (extensor digitorum longus, EDL) y oxidativo (sóleo) colocados uno al lado del otro antes de la congelación (Figura 1). Este procesamiento simultáneo no solo ahorra tiempo, sino que también evita la variabilidad debido al procesamiento separado de las muestras.
<img alt="Esquema de protocolo para la congelación y criosección de tejidos; Diagrama con inmunohistoquímica y microscopía." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63718/63718fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Figura 1: Descripción general esquemática del procedimiento. Después de la disección muscular (1), los músculos seleccionados de tamaño similar se preparan y congelan juntos (2). Las secciones transversales en serie de 10 μm se obtienen mediante un criostato y se montan directamente en portaobjetos de adhesión (3). A partir de dos diapositivas seriadas, la primera (4A) está inmunomarcada para laminina y teñida con Bodipy para reconocer las LD y la segunda (4B) está inmunoteñida con anticuerpos contra MyHCs para el reconocimiento de tipos de fibras musculares. Las imágenes se adquieren utilizando un microscopio confocal para Bodipy (5A) y un microscopio de epifluorescencia para tipos de fibras musculares (5B). Las imágenes se analizan en Fiji aplicando un umbral y cuantificando partículas (6A) para obtener el número, tamaño medio, densidad y porcentaje del área total ocupada por LD (7) o celdas de conteo (6B) para obtener el porcentaje de fibras de cada tipo en la sección (7). Abreviaturas: LD = gotas lipídicas; EDL = extensor digitorum longus; MyHCs = isoformas de cadena pesada de miosina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63718/63718fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr>Cámara <tr><td>AxioCam 506 mono 6 Mpix</td><td>Cámara CCD Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AxioCam MRm 1.4MPix&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Campana química</td><td>Potteau Labo</td><td>EN-14175</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocal</td><td>Zeiss</td><td>LSM800</td><td></td></tr><tr><td>Discos de corcho (&oslash; 20 mm, 3 mm de grosor)&nbsp;</td><td>Ciencias de la Microscopía Electrónica</td><td>63305</td><td></td></tr><tr><td>Cryo-Gloves</td><td>Tempshield</td><td>16072252</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat&nbsp;</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>Microm Cryo Star HM 560</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico de disección SMZ745</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinza de hielo</td><td></td><td></td><td></td>seco</tr><tr><td>Dumont</td><td>F.S.T</td><td>11295-10</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de epifluorescencia</td><td>Zeiss</td><td>AxioImage-Apotome Z1</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras Bonn extrafinas</td><td>F.S.T</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>FisherBrand Desechable Base Moldes (0,7 x 0,7 cm)</td><td>ThermoFisher</td><td>22-363-552</td><td>Se utiliza para cortar una pieza para sujetar el músculo en el corcho para congelar</td></tr><tr><td>Placa de Petri de vidrio (H 25&nbsp; milímetros, &oslash; 150&nbsp; mm)</td><td>MARCA Placa de Petri, MERK</td><td>BR455751</td><td>Se utiliza para colocar los músculos en hielo durante la disección</td></tr><tr><td>ImmEdge Barrera hidrofóbica PAP Pen</td><td>Vector Labs</td><td>H-4000</td><td>Se utiliza para crear una barrera hidrofóbica alrededor de las secciones musculares</td></tr><tr><td>Incubadora</td><td>MMM Medcenter</td><td>Incucell 707&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos de microscopio (24x50 mm)</td><td>Assistent&nbsp;</td><td></td><td></td>40990151</tr><tr><td>Cajas de portaobjetos de microscopio&nbsp;</td><td>Kartell</td><td>278</td><td>Utilizados como cámaras húmedas para inmunohistoquímica</td></tr><tr><td>Soporte de cuello</td><td>Linie zwo</td><td>SB-035X-02</td><td>Se utiliza como correa para sujetar el vaso de acero inoxidable</td></tr><tr><td>No 15 Hoja de bisturí estéril de acero al carbono</td><td>Swann-Morton</td><td>0205</td><td></td></tr><tr><td>Pinceles</td><td>Van Bleiswijck</td><td>Amazon B07W7KJQ2X</td><td>Se utiliza para manejar criosecciones</td></tr><tr><td>Rotulador permanente Negro</td><td>Klinipath/VWR</td><td>98307-R</td><td>Se utiliza para etiquetar portaobjetos</td></tr><tr><td>Pinza de fijación para perforaciones</td><td>F.S.T</td><td>18155-13</td><td></td></tr><tr><td>Caja de poliestireno&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Al 12 cm x L 25 cm x W 18 cm, utilizado como contenedor de nitrógeno líquido y para transportar las muestras al criostato</td></tr><tr><td>Mango de bisturí, 125 mm (5"), No. 3</td><td>Aesculap</td><td>BB073R</td><td></td></tr><tr><td>Vaso de acero inoxidable 10oz&nbsp;</td><td>Eboxer</td><td>B07GFCBPFH</td><td>Vaso para rellenar con isopenteno para la congelación muscular</td></tr><tr><td>Portaobjetos Superfrost Ultra Plus Pinzas quirúrgicas</td><td>ThermoFisher</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>1/2 dientes</td><td>Medische Vakhandel</td><td>1303152</td><td>También llamadas "Pinzas de dientes de rata"</td></tr><tr><td>Tijeras de resorte Vannas - 3 mm Filo de corte</td><td>F.S.T</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>Barcos de pesaje</td><td>VWR internacional</td><td>611-2249</td><td></td></tr><tr><td>Escáner de portaobjetos enteros para fluorescencia</td><td>Zeiss</td><td>Axio Scan.Z1</td><td></td></tr><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 405 Cabra Anti-Ratón IgG2b</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SAB4600477</td><td>Utilizado a una concentración final de 1:500</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Cabra Anti-Ratón IgG1</td><td>ThermoFisher</td><td>A-21121</td><td>Utilizado en un concentración final de 1:500</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 IgM anti-ratón de cabra Abcam</td><td></td><td>ab175702</td><td>Utilizado a una concentración final de 1:1.000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 anticuerpo secundario anti rata anti-IgG (H+L)</td><td>de cabra ThermoFisher</td><td>A-21247</td><td>Utilizado a una concentración final de 1:500</td></tr><tr><td>BODIPY-493/503 (4,4-difluoro-1,3,5,7,8-pentametil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceno)</td><td>ThermoFisher</td><td>D3922</td><td>Se utiliza a una concentración final de 1 & micro; g/mL</td></tr><tr><td>BODIPY-558/568 C12 (Ácido 4,4-Difluoro-5-(2-Thienil)-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Dodecanoico)</td><td>ThermoFisher</td><td>D3835</td><td>Utilizado en una concentración final de 1 &micro; g/mL</td></tr><tr><td>DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol)</td><td>ThermoFisher</td><td>D1306</td><td>Utilizado a una concentración final de 0,5 &micro; g/mL</td></tr><tr><td>de dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-8418</td><td>Se utiliza para disolver Bodipy para la solución madre de 1 mg/mL. <fuerte>PRECAUCIÓN</fuerte>: Tóxico e inflamable. Los vapores pueden causar irritación. Manipule en una campana extractora. Evite el contacto directo con la piel. Use guantes de goma, gafas protectoras para los ojos.</td></tr><tr><td>Solución de formaldehído al 4%, tamponada, pH 6,9</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1004969011</td><td><fuerte>PRECAUCIÓN</fuerte>: Puede provocar una reacción alérgica en la piel. Se sospecha que causa defectos genéticos. Puede causar cáncer. Manipule en una campana extractora. Evite el contacto directo con la piel. Use guantes de goma, gafas protectoras para los ojos.</td></tr><tr><td>Isopentano GPR RectaPur</td><td>VWR international</td><td>24872.298</td><td><fuerte>ATENCIÓN</fuerte>: Líquidos y vapores extremadamente inflamables. Puede ser mortal si se ingiere y entra en las vías respiratorias. Puede causar somnolencia o mareos. La exposición repetida puede causar sequedad o agrietamiento de la piel. Use guantes protectores/ropa protectora/protección para los ojos/protección facial.</td></tr><tr><td>Nitrógeno</td><td></td><td></td> líquido<td><fuerte>PRECAUCIÓN</fuerte>:&nbsp; Extremadamente frío. Usa guantes. Manipule lentamente para minimizar la ebullición y las salpicaduras y en áreas bien ventiladas. Utilice recipientes diseñados para líquidos a baja temperatura.</td></tr><tr><td>Ratón sobre ratón Reactivo de bloqueo &nbsp;</td><td>Vector Labs</td><td>MKB-2213-1</td><td>Utilizado a una concentración de 1:30</td></tr><tr><td>Cadena pesada de miosina tipo I (anticuerpo primario BA-D5-s) Gen: MYH7, monoclonal bovino anti ratón IgG2b</td><td>DSHB Universidad de Iowa</td><td>BA-D5-sobrenadante</td><td>Utilizado a una concentración final de 1:10</td></tr><tr><td>Cadena pesada de miosina Tipo IIA (anticuerpo primario SC-71-s) Gen:&nbsp; MYH2, Monoclonal bovino anti ratón IgG1</td><td>DSHB Universidad de Iowa</td><td>SC-71-sobrenadante</td><td>Utilizado a una concentración final de 1:10</td></tr><tr><td>Cadena pesada de miosina tipo IIX (anticuerpo primario 6H1-s), Gen:&nbsp; MYH1, Monoclonal de conejo anti ratón IgM</td><td>Estudios del desarrollo Banco de hibridomas, Universidad de Iowa</td><td>6H1-sobrenadante</td><td>Utilizado en una concentración final de 1:5</td></tr><tr><td>Suero normal de cabra (NGS)</td><td>Vector Labs</td><td>S-1000</td><td></td></tr><tr><td>PBS 0.1 M</td><td></td><td></td><td>Comúnmente utilizado en laboratorios de histología</td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo primario (monoclonal) anti-Laminina-2 para ratas-Laminina-2 (&alfa;-2 cadenas)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L0663</td><td>Utilizado en una concentración final de 1:1.000</td></tr><tr><td>Tejido Tek O.C.T</td><td>compuesto Sakura&nbsp;</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adobe Illustrator CC</td><td>Adobe Inc.</td><td></td><td>Se utiliza para diseñar las figuras:</td></tr><tr><td>Adobe Photoshop</td>, <td>Adobe Inc.</td><td></td><td>Software confocal</td></tr><tr><td>BioRender</td><td>https://biorender.com/</td><td></td> <td>Utilizado para diseñar las figuras</td></tr><tr><td>Fiji/ImageJ</td><td>https://imagej.net/software/fiji/</td><td></td> <td>Utilizado para analizar las imágenes adquiridas</td></tr><tr><td>Microsoft PowerPoint</td><td>Microsoft</td><td></td><td>Utilizado para reconstruir la histología de todo el músculo después de escanear los tipos de fibra</td></tr><tr><td>Zen Blue 2.6</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Se utiliza para reconstruir la histología de todo el músculo después de escanear los tipos de fibra</td></tr></tbody></table>

tipo de fibra y análisis subcelular específico del contenido de gotas lipídicas en el músculo esquelético

Fiber Type and Subcellular-Specific Analysis of Lipid Droplet Content in Skeletal Muscle

La infiltración de lípidos del músculo esquelético, conocida como miosteatosis, aumenta con la obesidad y el envejecimiento. La miosteatosis también se ha descubierto recientemente como un factor de pronóstico negativo para varios otros trastornos como las enfermedades cardiovasculares y el cáncer. La infiltración excesiva de lípidos disminuye la masa muscular y la fuerza. También resulta en lipotoxicidad y resistencia a la insulina dependiendo del contenido total de lípidos intramiocelulares, la morfología de las gotas lipídicas (LD) y la distribución subcelular. El tipo de fibra (oxidativa vs glucolítica) también es importante, ya que las fibras oxidativas tienen una mayor capacidad para utilizar lípidos. Debido a sus implicaciones cruciales en la fisiopatología, se justifican estudios en profundidad sobre la dinámica y la función de la DA de una manera específica del tipo de fibra.
Aquí, se presenta un protocolo completo para la cuantificación del contenido de lípidos intramiocelulares y el análisis de la morfología de LD y la distribución subcelular de una manera específica del tipo de fibra. Con este fin, las criosecciones musculares en serie se tiñeron con el tinte fluorescente Bodipy y anticuerpos contra las isoformas de cadena pesada de miosina. Este protocolo permite el procesamiento simultáneo de diferentes músculos, ahorrando tiempo y evitando posibles artefactos y, gracias a una macro personalizada creada en Fiji, también es posible la automatización del análisis LD.

El protocolo descrito en este documento proporciona un método eficiente para cuantificar fácilmente los LD de una manera específica de tipo de fibra y subcelular. Muestra cómo, al congelar juntos dos músculos de tamaño similar, como el EDL y el sóleo, el tiempo y los recursos gastados en los siguientes pasos se reducen a la mitad.
Se proporciona un protocolo completo para la inmunotinción, la adquisición de imágenes y el análisis de las diferentes isoformas MyHC expresadas en los músculos del ...

La creciente evidencia indica que la infiltración excesiva de lípidos dentro del músculo esquelético resulta en lipotoxicidad y diabetes. Aquí, presentamos un protocolo completo, que incluye procesamiento de tejidos, tinción con Bodipy, adquisición de imágenes y análisis, para cuantificar el tamaño, la densidad y la distribución subcelular de las gotas lipídicas de una manera específica de tipo de fibra.

Tipo de fibra y análisis subcelular específico del contenido de gotas lipídicas en el músculo esquelético

Skeletal muscle lipid infiltration, known as myosteatosis, increases with obesity and ageing. Myosteatosis has also recently been discovered as a negative ...

Este protocolo permite la cuantificación de las gotas lipídicas y el análisis de su morfología y distribución subcelular de forma específica al tipo de fibra. Esta técnica permite el procesamiento simultáneo de diferentes músculos, ahorrando tiempo y evitando artefactos que podrían ocurrir cuando se procesan de forma independiente. También permite la automatización de la cuantificación de las gotas lipídicas.La miosteatosis se evaluó en los músculos marinos, pero este protocolo podría traducirse a los humanos en diferentes afecciones, como la obesidad, el envejecimiento y el cáncer. Reconocer las mismas fibras en la sección paralela podría ser difícil, pero estructuras notables como los ajustes del axón o los husos musculares son buenos puntos de referencia que ayudarán al investigador a localizar las mismas fibras en ambas diapositivas. Para comenzar, coloque dos secciones transversales criocongeladas en serie de la muestra muscular en dos portaobjetos de adhesión preetiquetados.Una diapositiva para determinar los tipos de fibra y la otra para cuantificar el contenido de lípidos. Para la detección inmunohistoquímica del tipo de fibra muscular, rodee las secciones con un contorno dibujado con una pluma hidrofóbica. Colóquelo en una cámara húmeda y enjuague con PBS molar 0.1 frío durante un minuto a temperatura ambiente.A continuación, retire el PBS, agregue la solución de bloqueo a la diapositiva e incube durante 90 minutos a 37 grados centígrados. Más tarde retire la solución de bloqueo e incube los portaobjetos durante 90 minutos a 37 grados centígrados con la solución que contiene los anticuerpos primarios. Lave los portaobjetos tres veces con PBS durante cinco minutos cada uno, a temperatura ambiente.Agregue la solución que contiene los anticuerpos secundarios e incube los portaobjetos en la oscuridad durante una hora a temperatura ambiente, a continuación asegúrese de mantener el portaobjetos alejado de la luz y proceda con los tres lavados en PBS durante cinco minutos cada uno, luego enjuague el portaobjetos en agua destilada doble, después de eliminar el exceso de agua, monte el portaobjetos con reactivo antifas y guárdelo a cuatro grados centígrados protegido de la luz. Para manchar la gota lipídica con corpulóptero, rodee la sección muscular con un contorno dibujado por una pluma hidrofóbica antes de enjuagarla con PBS molar 0.1 helado durante 10 minutos. Ambas diapositivas deben mancharse simultáneamente.Fije la sección con paraformaldehído al cuatro por ciento frío sin metanol durante 10 minutos a temperatura ambiente. Después del primer enjuague rápido, lave los portaobjetos tres veces con PBS durante cinco minutos. Bloquee el portaobjetos con suero de cabra normal al 5% en PBS durante una hora en cámara humana.Seguido de la incubación del portaobjetos con la solución del anticuerpo primario que comprende un 2% de suero normal de cabra y anti-laminina de rata en PBS durante 90 minutos. Después de lavar los portaobjetos tres veces en PBS, realice la siguiente incubación con la solución secundaria de anticuerpos que contiene cabra, anti-rata, anticuerpo Alexa fluor 647 en PBS a temperatura ambiente durante una hora. Asegúrese de que la diapositiva esté protegida de la luz.Después de la incubación, lave el portaobjetos tres veces con PBS. A continuación, incubar la sección durante 20 minutos con dapi y solución bodipy. Después de un enjuague rápido, lave tres veces con PBS, y una vez con agua destilada doble, luego retire el exceso de agua y monte la sección con un reactivo antidesvanecimiento.Una vez que se escanea el músculo, cargue las imágenes digitales capturadas en cualquier software de procesamiento de imágenes para la reconstrucción. En función de la morfología de la fibra y la histología de la sección muscular, guarde la imagen en un formato adecuado con todos los canales fusionados. Para la observación y adquisición de imágenes corporales, establezca los parámetros para un microscopio confocal, con una lente de objetivo de inmersión en aceite de 40 X y una apertura numérica de 1.4, como se describe en el manuscrito.Para evitar la diafonía entre bodipy y 558, 568, y laminina Alexa fluor 647; Utilice el modo de escaneo secuencial en el software confocal. Excitar bodipy y 493, 503 usando la línea láser de 488 nanómetros o línea láser de argón, y excitar bodipy y 555, 568 usando la línea láser de diodo de 561 nanómetros. Finalmente, detectar laminina Alexa fluor 647 con una línea láser de diodo de 640 nanómetros, dependiendo del tinte elegido, establecer las tasas de emisión en 570 a 650 nanómetros para bodipy y 493, 503.Y a 565 a 620 nanómetros para bodipy y 558, 568. Establezca el rango de emisión de laminina en 656 a 700 nanómetros. A continuación, configure la ganancia y la ganancia digital de manera adecuada para evitar detectar píxeles saturados en el indicador de rango.Corrija la señal de fondo ajustando el desplazamiento. Para identificar el tipo de fibra en el microscopio confocal, use una computadora portátil en la que se pueda verificar la imagen de la diapositiva previamente reconstruida con la detección de inmunodetección de tipo fibra. Una vez que un grupo de fibras se identifica correctamente adquiere la imagen con los canales bodipy y laminin.Abra cada imagen con la ayuda del importador del bioformato de Fiji. En la vista pila con opción, seleccione hyper stack, luego color mode y default. Asegúrese de que la ventana de escala automática esté seleccionada.Utilice la herramienta de selección a mano alzada para seleccionar manualmente el sarcolema de la fibra en función del canal de laminina. Y presione T en el teclado para grabar la región de interés en la ventana roi. Vaya a la ventana principal de Fiji y haga clic en analizar y establecer mediciones.Luego, en la ventana emergente, seleccione el área y para el diámetro elevado, deje las casillas restantes sin marcar y otros parámetros tal como aparecen de forma predeterminada. Haga clic en medir en la ventana roi para obtener el área y el mínimo para el diámetro elevado de la fibra seleccionada y anotarlos para su uso posterior. Calcule el valor de una sexta parte del diámetro mínimo elevado para delimitar la parte central de la fibra.Haga clic en la ventana de ROI, haga clic en agregar para tener un duplicado del primer ROI y seleccione el segundo ROI que aparece en la ventana. En la ventana principal de Fiji, haga clic en editar, luego seleccione y amplíe. Para introducir el valor calculado previamente con un signo menos antes del número y haga clic en aceptar.En la ventana ROI, haga clic en agregar, debe aparecer un tercer ROI y elimine para eliminar el segundo ROI. En la ventana roi, seleccione ambos ROI y haga clic en más luego en ZOR y agregue, espere a que aparezca un tercer ROI que corresponda a la periferia de la fibra. Si es necesario volver a analizar las mismas fibras, guarde el ROI haciendo clic en más y luego en guardar.Seleccione el canal bodipy y abra la herramienta de umbral haciendo clic en las pestañas imagen, ajuste y umbral en la ventana principal de Fiji. En la ventana emergente de umbral, establezca los valores en 70 y 255. A continuación, seleccione YEN y método en blanco y negro.Antes de hacer clic en el fondo oscuro. Finalmente presione la pestaña de aplicación. Vaya a la ventana principal de Fiji y haga clic en analizar y establecer mediciones.En la ventana emergente, seleccione área, fracción de área y límite al umbral. Deje los cuadros y parámetros restantes como predeterminados. Vaya a la ventana roi y seleccione el primer ROI.En la ventana principal de Fiji, haga clic en analizar, luego en la herramienta analizar partículas. En la ventana de partículas analizadas, establezca los valores de dos a infinito y marque la casilla de píxeles. Mantenga el valor de circularidad predeterminado y seleccione resumir antes de hacer clic en Aceptar.Para obtener los valores del centro y la periferia de la fibra, repita la selección del segundo y el tercer ROI cada vez. Luego guarde los resultados haciendo clic en el archivo, luego guárdelo como en la ventana de resumen. Incluya el tipo de fibra en el nombre del archivo.Este protocolo inmunohistoquímico permite el reconocimiento de ratones, fibras oxidativas lentas, como tipo 1 y 2A, fibras glucolíticas rápidas, como tipo 2X y 2B, y la presencia de fibras híbridas. Al medir el área y el diámetro mínimo elevado de la fibra muscular se aplicó una reducción dependiente del tamaño para obtener las áreas central y periférica de cada fibra. Las estructuras notables de cada sección muscular, como las ramitas de axón o los husos musculares son buenos puntos de referencia que podrían ayudar a localizar las mismas fibras en ambos lados.Los ajustes descritos para adquirir la tinción de laminina corporal mediante microscopía confocal. Permitido, la visualización y análisis del tamaño, número y distribución de gotas lipídicas de tres a seis fibras simultáneamente. El método también permitió la cuantificación de tres parámetros importantes, a saber, el porcentaje del área de fibra ocupada por las gotas de lípidos, la densidad y el tamaño promedio de las gotas de lípidos.El procedimiento de congelación inadecuado y la falta de alcanzar la temperatura correcta de isopentano dieron como resultado una formación de cristal de hielo dentro de las fibras musculares. Cuando las secciones no estaban alineadas transversalmente, no se pudo realizar la cuantificación de las gotas lipídicas y la comparación entre fibras, músculos o animales. El procesamiento de la segunda diapositiva debe hacerse simultáneamente con la primera.El secado al aire de la diapositiva después de la crioseccion durante 15 minutos reducirá significativamente el tamaño y el número de gotas de lípidos. Bodipy se puede utilizar para estudiar la interacción de gotas lipídicas con otros orgánulos subcelulares, o pila de proteínas con fluorescencia de un espectro diferente, o con modelos GFP modificados genéticamente. Se ha informado que la miosteatosis es un factor de mal pronóstico para varias enfermedades.Por lo tanto, esta técnica podría usarse para monitorear la progresión de una enfermedad o para evaluar el efecto de un tratamiento.

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Investigación

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Medicine

Medicina

En este video, demostramos la preparación de muestras de tejido muscular esquelético humano y su tinción para microscopía electrónica de transmisión para visualizar y cuantificar la distribución subcelular de glucógeno.

Microscopía electrónica de transmisión para cuantificar la distribución de glucógeno en músculos esqueléticos humanos

Los principales tipos de células adherentes derivadas del músculo humano son las células miogénicas y los fibroblastos. Aquí, las poblaciones celulares se enriquecen mediante la clasificación de células activadas magnéticamente basadas en el antígeno CD56. El posterior inmunomarcaje con anticuerpos específicos y el uso de técnicas de análisis de imagen permiten cuantificar las características citoplasmáticas y nucleares de las células individuales.

Aislamiento y Caracterización cuantitativa inmunocitoquímica de células miogénicas Primarias y fibroblastos de músculo esquelético humano

gotitas de lípidos son orgánulos importantes para la replicación de varios patógenos, incluyendo el virus de la hepatitis C (VHC). Se describe un método para aislar las gotas de lípidos para la espectrometría de masas cuantitativa de proteínas asociadas; se puede utilizar bajo una variedad de condiciones, tales como infección por el virus, el estrés ambiental, o tratamiento con fármacos.

Aislamiento gotas de lípidos para el análisis cuantitativo de Espectrometría de Masas

La coloración de Immunohistochemical de las isoformas de cadena pesada de miosina ha surgido como discriminador de estado de la técnica del tipo de fibra del músculo esquelético (es decir, tipo I, tipo IIA, tipo IIX, tipo IIB). Aquí, presentamos un protocolo de tinción junto con un algoritmo novela semi-automatizado que facilita la rápida evaluación de la morfología del tipo de fibra y fibra.

Análisis semi-automatizado de fibra tipo composición y morfología del músculo esquelético de ratón

Un procedimiento modificado posterior a la fijación aumenta el contraste de las partículas de glucógeno en el tejido. Este documento proporciona un protocolo paso a paso que describe cómo manejar el tejido, realizar las imágenes y utilizar métodos estereológicos para obtener datos imparciales y cuantitativos sobre la distribución de glucógeno subcelular específico del tipo de fibra en el músculo esquelético.

Cuantificación de la distribución de glucógeno subcelular en fibras musculares esqueléticas mediante microscopía electrónica de transmisión

La lipidómica basada en espectrometría de masas de escopeta ofrece una instantánea cuantitativa sensible de un amplio espectro de clases de lípidos simultáneamente en una sola medición de varios tejidos de roedores.

Lipidómica de escopeta de tejidos de roedores

El reemplazo del tejido muscular sano con grasa intramuscular es una característica prominente de las enfermedades y afecciones humanas. Este protocolo describe cómo visualizar, visualizar y cuantificar la grasa intramuscular, lo que permite el estudio riguroso de los mecanismos subyacentes a la formación de grasa intramuscular.

Una guía para examinar la formación de grasa intramuscular y su origen celular en el músculo esquelético

En este documento, demostramos un protocolo optimizado basado en fluorescencia BODIPY 493/503 para la caracterización de gotas de lípidos en el tejido hepático. Mediante el uso de proyecciones ortogonales y reconstrucciones 3D, el fluoróforo permite una discriminación exitosa entre esteatosis microvesicular y macrovesicular y puede representar un enfoque complementario a los protocolos histológicos clásicos para la evaluación de esteatosis hepática.

Análisis de gotitas de lípidos teñidas con fluorescencia con reconstrucción 3D para la evaluación de la esteatosis hepática

El presente estudio describe metodologías basadas en la descelularización para visualizar y cuantificar la deposición de tejido adiposo intramuscular (IMAT) a través del volumen muscular intacto, así como cuantificar las métricas de los adipocitos individuales que componen IMAT.

Cuantificación basada en la descelularización de la infiltración grasa del músculo esquelético

Este protocolo demuestra el aislamiento de una sola fibra del músculo esquelético humano liofilizado y la clasificación del tipo de fibra de acuerdo con la isoforma de la cadena pesada de miosina (MHC) utilizando la técnica de transferencia de puntos. Las muestras de fibra MHC I y II identificadas se pueden analizar más a fondo para detectar diferencias específicas del tipo de fibra en la expresión de proteínas mediante Western blot.

Identificación del tipo de fibra del músculo esquelético humano

Describimos un protocolo para obtener fibras disociadas enzimáticamente de diferentes longitudes y tipos a partir de seis músculos de ratones adultos: tres de ellos ya descritos (flexor corto de los dedos, extensor largo de los dedos, sóleo) y tres de ellos disociados con éxito por primera vez (extensor largo del dedo gordo, peroneo largo, peroneo largo de los dedos cuartos).

Fibras musculares esqueléticas cortas, intermedias y largas intactas obtenidas por disociación enzimática de seis músculos de las extremidades posteriores de ratones: más allá del flexor corto de los dedos

Aprende a cuantificar gotas lipídicas y analizar su morfología en fibras musculares específicas usando tinción con Bodipy. Este protocolo permite el procesamiento simultáneo de muestras y la automatización del análisis.

Tipo de fibra y análisis subcelular específico del contenido de gotas lipídicas en el músculo esquelético

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