Name: Generación de células madre mesenquimales a partir del tejido del cordón umbilical humano y su diferenciación en el linaje del músculo esquelético (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: Aprende a aislar células madre mesenquimales del cordón umbilical humano y diferenciarlas en línea muscular esquelética. Este protocolo garantiza alta viabilidad celular con mínima contaminación endotelial.

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Agradecemos al Sr. Ojas Tikoo por su ayuda con la filmación y producción de video. También reconocemos la ayuda recibida del personal de GARBH-Ini (Grupo Interdisciplinario sobre Investigación Avanzada y Resultado del Nacimiento-DBT India), enfermeras y oficiales superiores de investigación en el Hospital Civil Gurugram y el Dr. Pallavi Kshetrapal por su ayuda con la logística. Este trabajo fue apoyado por subvenciones otorgadas a Suchitra Gopinath del Departamento de Biotecnología, India (BT/09/IYBA/2015; BT/PR29599/PFN/20/1393/2018).

El uso de tejido del cordón umbilical en este estudio fue aprobado por el Comité Institucional para la Investigación con Células Madre (IC-SCR), el Comité de Ética Institucional, el Instituto traslacional de Ciencia y Tecnología de la Salud (IEC-THSTI), el Comité de Ética Institucional del Hospital Civil, Gurugram, Haryana, y el Comité Institucional de Bioseguridad, THSTI. Las muestras de tejido del cordón humano se recolectaron de partos a término en el momento del nacimiento. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de los sujetos. Todos los métodos se llevaron a cabo de conformidad con las directrices y reglamentos pertinentes.
1. Aislamiento de las MSC del tejido del cordón umbilical
<ol><li>En el momento del parto, corte al menos 5 cm de cordón, preferiblemente más cerca de la placenta, y esterilize el cordón frotando la superficie externa con etanol al 70%. Transfiera el pedazo de tejido del cordón umbilical secuencialmente de un tubo de recolección de 50 ml que contiene solución salina tamponada con fosfato (PBS) a otro que contiene el mismo. Transportar el tubo de recolección que lleva el nombre del sujeto en hielo al laboratorio dentro de 1 h. NOTA: Para un estudio más amplio, podría ser útil codificar las muestras para permitir su seguimiento a lo largo del estudio. Es importante destacar que a todo el personal que maneja tejidos humanos se le debe ofrecer el régimen completo de la vacuna contra la hepatitis B.</li>
	<li>En el laboratorio, encienda los rayos UV durante 25 minutos en la campana BSL-2 para esterilizar los instrumentos y pipetas en autoclave antes de su uso.</li>
	<li>Transfiera la pieza de tejido del cordón umbilical del tubo de recolección a un plato tratado con cultivo de tejido de 10 cm2 que contenga PBS enriquecido con 5 g/L de glucosa, 50 μg/ml de gentamicina, 2,5 μg/ml de anfotericina B, 100 U/ml de penicilina y 100 μg/ml de estreptomicina (esquemático de la Figura 1).</li>
	<li>Usando un bisturí, corte el tejido del cordón verticalmente a lo largo de su eje longitudinal para obtener dos piezas medio cilíndricas. Debido a la torsión del cordón umbilical y la superficie mucoide, fije el tejido con un par de fórceps sostenidos en la otra mano.</li>
	<li>En este punto, observe las arterias umbilicales y la vena y retire los vasos sanguíneos usando un bisturí para rasparlos en una dirección desde la superficie. Enjuague el tejido del cordón umbilical una vez más en PBS para eliminar toda la sangre residual asociada con el tejido. Asegúrese de que el raspado sea suave para preservar la integridad de las células en el WJ que rodea los vasos.</li>
	<li>Picar cada mitad del tejido del cordón en fragmentos de 0,5 cmde tamaño 3 y colocar los fragmentos con la superficie luminal hacia abajo en el plato. Incubar el plato brevemente durante 10 min en una cámara humidificada a 37 °C que contenga un 5% de CO2.</li>
	<li>Después de la incubación, inunde el plato que contiene los trozos de tejido del cordón umbilical con 20 ml de medio que contenga MEM Alpha Modification sin L-glutamina, ribo- y desoxirribonucleósidos, suero bovino fetal al 15% (no inactivado por calor) y 50 μg / ml de gentamicina. Agregue el medio de crecimiento suavemente a lo largo de los lados para evitar que los explantes de tejido se desalojen de su orientación. Agregue el exceso de medio para dar cuenta de una fracción que será absorbida por los explantes de tejido durante la incubación.</li>
	<li>Después de 3 días de incubación, agregue medio fresco a los cultivos. Asegúrese de que los cultivos estén protegidos de los golpes y el movimiento de los explantes mientras manipula los platos.</li>
	<li>Después de 1 semana, retire los fragmentos de tejido individualmente usando fórceps estériles y deseche usando bolsas de riesgo biológico apropiadas para su eliminación. Conserve el medio existente y agregue 10 ml de medio de crecimiento fresco. Reemplace el medio de crecimiento cada 4 días hasta que las colonias individuales alcancen una confluencia del 70%. NOTA: Es probable que las células no se distribuyan uniformemente en todo el plato, ya que habrá colonias proliferativas individuales que deben ser monitoreadas para la confluencia con el tiempo. Generalmente, dentro de un mes, un plato de 10 cm2 genera suficientes células para dividirse en un plato separado.</li>
	<li>Cosechar las células adherentes usando solución de tripsina/EDTA (1x 0.25% de tripsina y 0.02% de EDTA en Hanks Balanced Salt Solution [HBSS]). Centrifugar la suspensión celular a 470 × g durante 5 min a 25 °C y resuspendir el pellet celular en medio de crecimiento.</li>
</ol>2. Inmunofenotipado y propagación de uMSCS
<ol><li>Proceder al inmunofenotipado una vez que las células adherentes hayan alcanzado un 50%-60% de confluencia y estén bien diseminadas. No realice análisis de marcadores MSC en cultivos totalmente confluentes, ya que esto tiende a causar una regulación a la baja de los marcadores MSC clave.</li>
	<li>Después de la tripsinización, distribuya una suspensión celular de 1 × 106 células/ml en tubos FACS (1 × 105 células/tubo) y tiñe con anticuerpos adecuados ligados a fluoróforos (todos dilución 1:50) en combinación: sin teñir; CD105 + CD90; CD105 + CD73; CD105; CD90; CD73; CD34 + CD45 (fluoróforo común); controles de isotipo para cada fluoróforo. Registre un número total de eventos de al menos 10,000 en el citómetro de flujo para su posterior análisis. NOTA: Dado que las celdas se analizan para cada marcador de superficie por separado, no es necesario cerrar los subconjuntos de celdas.</li>
	<li>Además de los marcadores anteriores, confirme la presencia de marcadores de superficie positivos y negativos en las líneas uMSC creadas a partir de muestras individuales de tejido del cordón umbilical (Tabla 1).</li>
	<li>Analizar las células marcadas por citometría de flujo y determinar el porcentaje de células CD105+CD90+ y CD105+CD73+ . Analice las células CD105+ y CD34−CD45− por separado.</li>
</ol>3. Diferenciación de uMSCs en músculo esquelético
<ol><li>Recubrir las placas de cultivo de tejidos con 0,01% de colágeno y 20 μg/ml de laminina en PBS. Cubra estas placas durante un mínimo de 4 h a temperatura ambiente.</li>
	<li>Placa uMSCs a una densidad de 10.000 células/cm2 en medio de crecimiento.</li>
	<li>Cuando las células sean 70% confluentes, aspire el medio de crecimiento y enjuague los cultivos 2x con PBS. Añadir medio de diferenciación miogénica (M1) compuesto por DMEM + 5% de suero de caballo + 0,1 μM de dexametasona + 50 μM de hidrocortisona a las uMSCs. Para la determinación de la cinética de la progresión miogénica, agregue medio M1 cada dos días a los cultivos.</li>
	<li>Para determinar la cinética de la progresión miogénica, analice las uMSC para la expresión de Pax7, MyoD, Myogenin y MyHC a los 2 días, 4-5 días, 6-7 días y 10-14 días, respectivamente.</li>
</ol>

<ol><li>Kuroda, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+multipotent+cells+in+adult+human+mesenchymal+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Unique multipotent cells in adult human mesenchymal cell populations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (19), 8639-8643 (2010).</li>
<li>Troyer, D. L., Weiss, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wharton%27s+jelly-derived+cells+are+a+primitive+stromal+cell+population%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Wharton's jelly-derived cells are a primitive stromal cell population.</a> Stem Cells. 26 (3), 591-599 (2008).</li>
<li>Karahuseyinoglu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+of+stem+cells+in+human+umbilical+cord+stroma%3A+In+situ+and+in+vitro+surveys%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Biology of stem cells in human umbilical cord stroma: In situ and in vitro surveys.</a> Stem Cells. 25 (2), 319-331 (2007).</li>
<li>Kita, K., Gauglitz, G. G., Phan, T. T., Herndon, D. N., Jeschke, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+mesenchymal+stem+cells+from+the+sub-amniotic+human+umbilical+cord+lining+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of mesenchymal stem cells from the sub-amniotic human umbilical cord lining membrane.</a> Stem Cells and Development. 19 (4), 491-502 (2010).</li>
<li>Sarugaser, R., Lickorish, D., Baksh, D., Hosseini, M. M., Davies, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+umbilical+cord+perivascular+%28HUCPV%29+cells%3A+A+source+of+mesenchymal+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Human umbilical cord perivascular (HUCPV) cells: A source of mesenchymal progenitors.</a> Stem Cells. 23 (2), 220-229 (2005).</li>
<li>Mishra, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Umbilical+cord+tissue+is+a+robust+source+for+mesenchymal+stem+cells+with+enhanced+myogenic+differentiation+potential+compared+to+cord+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Umbilical cord tissue is a robust source for mesenchymal stem cells with enhanced myogenic differentiation potential compared to cord blood.</a> Scientific Reports. 10 (1), 18978(2020).</li>
<li>Lu, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+human+umbilical+cord+mesenchymal+stem+cells+with+hematopoiesis-supportive+function+and+other+potentials%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of human umbilical cord mesenchymal stem cells with hematopoiesis-supportive function and other potentials.</a> Haematologica. 91 (8), 1017-1026 (2006).</li>
<li>Seshareddy, K., Troyer, D., Weiss, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+to+isolate+mesenchymal-like+cells+from+Wharton%27s+Jelly+of+umbilical+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Method to isolate mesenchymal-like cells from Wharton's Jelly of umbilical cord.</a> Methods in Cell Biology. 86, 101-119 (2008).</li>
<li>Sotiropoulou, P. A., Perez, S. A., Salagianni, M., Baxevanis, C. N., Papamichail, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+optimal+culture+conditions+for+clinical+scale+production+of+human+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Characterization of the optimal culture conditions for clinical scale production of human mesenchymal stem cells.</a> Stem Cells. 24 (2), 462-471 (2006).</li>
<li>Yoon, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+explant-derived+and+enzymatic+digestion-derived+MSCs+and+the+growth+factors+from+Wharton%27s+jelly%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Comparison of explant-derived and enzymatic digestion-derived MSCs and the growth factors from Wharton's jelly.</a> BioMed Research International. 2013, 428726(2013).</li>
<li>Ishige, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+mesenchymal+stem+cells+derived+from+arterial%2C+venous%2C+and+Wharton%27s+jelly+explants+of+human+umbilical+cord%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Hematology%22%5BJournal%5D)">Comparison of mesenchymal stem cells derived from arterial, venous, and Wharton's jelly explants of human umbilical cord.</a> International Journal of Hematology. 90 (2), 261-269 (2009).</li>
<li>Chal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+pluripotent+stem+cells+to+muscle+fiber+to+model+Duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Differentiation of pluripotent stem cells to muscle fiber to model Duchenne muscular dystrophy.</a> Nature Biotechnology. 33 (9), 962-969 (2015).</li>
</ol>

Los autores no declaran intereses contrapuestos.

Pasos críticos Un paso crítico en este protocolo es la recolección de tejido en condiciones asépticas, desde el momento de la entrega hasta el mantenimiento de cultivos estériles, durante toda la propagación. Durante la recolección del cordón, es esencial que el cordón no toque ninguna superficie no esterilizada y se frote externamente con etanol al 70% antes de la recolección en tubos que contengan PBS suplementado con antibióticos. Es importante limitar el tiempo entre la recolección del cordón umbi...

Se ha acreditado que el cordón umbilical humano posee un reservorio robusto de células madre mesenquimales, que actualmente se están explorando para terapias regenerativas debido a sus robustas tasas de proliferación y diferenciación, propiedades inmunomoduladoras y capacidad para generar células a partir de las tres capas germinales1. El tejido del cordón umbilical consta de múltiples compartimentos como la sangre del cordón umbilical, el subendotelio de la vena umbilical y la gelatina de Wharton (WJ), que en sí misma abarca tres regiones indistintas: la zona perivascular, la zona intervascular y el subamnio o el revestimiento del cordón umbilical (CL)2. Si bien las uMSC pueden aislarse de todas estas regiones diferentes y expresar ampliamente los marcadores clave de MSC, no hay claridad sobre si estos compartimentos contienen la misma población de uMSC o muestran diferencias en sus potencias de diferenciación3. Por lo tanto, los protocolos para el aislamiento de uMSC requieren una mayor precisión en su modo y región de aislamiento, la caracterización robusta de los potenciales de diferenciación y, finalmente, un análisis comparativo de diferentes compartimentos del cordón. 
En este contexto, pocos estudios han demostrado diferencias en los potenciales proliferativos y diferenciativos de uMSC entre las diferentes partes del cordón. De estos, los análisis comparativos entre uMSCs aislados de las regiones CL y WJ revelaron un mayor potencial proliferativo en uMSCs derivados de CL 3,4. En un estudio separado, las uMSC derivadas de WJ tuvieron un mejor desempeño en los ensayos de proliferación en comparación con las células perivasculares (HUCPV)5. Al examinar las diferencias entre las uMSC derivadas de la sangre del cordón umbilical y las uMSC derivadas del tejido del cordón umbilical desprovistas de contaminación vascular, se informó la expresión diferencial de los marcadores clave de MSC entre los dos compartimentos, así como el aumento de las tasas de proliferación en las uMSC derivadas del tejido del cordón umbilical6.
De los varios estudios que examinan los potenciales de diferenciación de las uMSC principalmente en tejidos del linaje mesodermo, como los linajes osteogénicos, adipogénicos y condrogénicos, muy pocos han proporcionado protocolos detallados para la diferenciación miogénica y la caracterización posterior, así como análisis comparativos entre varios compartimentos del cordón umbilical. En este contexto, hemos desarrollado un protocolo robusto de diferenciación muscular y hemos observado que las uMSC derivadas del tejido del cordón umbilical muestran capacidades de diferenciación miogénica superiores en comparación con la sangre del cordón umbilical6. Aquí, se detalla un protocolo paso a paso para el aislamiento de uMSC de todo el tejido del cordón umbilical desprovisto de células asociadas con la vasculatura, su caracterización y su diferenciación en el linaje miogénico.

<table><tbody><tr><td>4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Anfotericina B</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2411</td><td></td></tr><tr><td>Solución antibiótica 100x Líquido, endotoxina probada (10,000 U de penicilina y 10 mg de estreptomicina/mL en solución salina normal al 0.9%)</td><td>HiMedia</td><td>A001A-50mL</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-GAPDH</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8795</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-MyHC (My32)</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP2-50401AF647</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-MyoD (5.8A)</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB100-56511</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-miogenina (clon F5D)</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP2-34616AF594</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-Pax7</td><td>DSHB</td><td>DSHB-C1-576</td><td></td></tr><tr><td>APC Ratón anti-humano clon CD90 5E10</td><td>BD Biosciences</td><td>559869</td><td></td></tr><tr><td>Colágeno Tipo 1</td><td>Merck</td><td>C8919</td><td></td></tr><tr><td>D (+) Glucosa</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>Dexametasona</td><td>SIGMA</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>FACSCanto II o FACSAria III</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino, calificado Brasil</td><td>GIBCO</td><td>10270106</td><td>no ser inactivado por calor</td></tr><tr><td>FITC Ratón anti-humano clon CD106 51-10C9</td><td>BD Biosciences</td><td>551146</td><td></td></tr><tr><td>FITC Ratón anti-humano clon CD14 M5E2</td><td>BD Biosciences</td><td>557153</td><td></td></tr><tr><td>FITC Ratón anti-humano clon CD31 WM59</td><td>BD Biosciences</td><td>557508</td><td></td></tr><tr><td>FITC Ratón anti-humano clon CD34 581</td><td>BD Biosciences</td><td>555821</td><td></td></tr><tr><td>FITC Ratón anti-humano clon CD45 HI30</td><td>BD Biosciences</td><td>555482</td><td></td></tr><tr><td>FITC Ratón anti-humano CD49D clon 9F10</td><td>BD Biosciences</td><td>560840</td><td></td></tr><tr><td>FITC Ratón anti-humano CD90 clon 5E10</td><td>BD Biosciences</td><td>555595</td><td></td></tr><tr><td>FITC Ratón anti-humano HLA-A,B,C clon G46-2.6</td><td>BD Biosciences</td><td>557348</td><td></td></tr><tr><td>FITC Ratón anti-humano clon de IgG G18-145</td><td>BD Biosciences</td><td>555786</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo software</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1264</td><td></td></tr><tr><td>Suero de caballo</td><td>HiMedia</td><td>RM1239</td><td></td></tr><tr><td>Hidrocortisona</td><td>Merck</td><td>H4001</td><td></td></tr><tr><td>Laminina</td><td>Merck</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>MEM Modificación alfa sin L-glutamina, ribo- y desoxirribonucleósidos</td><td>Hyclone</td><td>SH30568. FS</td><td>Medio basal para uMSCs</td></tr><tr><td>PE Ratón anti-humano CD105 clon 266</td><td>BD Biosciences</td><td>560839</td><td></td></tr><tr><td>PE Ratón anti-humano CD44 clon 515</td><td>BD Biosciences</td><td>550989</td><td></td></tr><tr><td>PE Ratón anti-humano CD49E clon llA1</td><td>BD Biosciences</td><td>555617</td><td></td></tr><tr><td>PE Ratón antihumano clon de IgG G18-145</td><td>BD Biosciences</td><td>555787</td><td></td></tr><tr><td>PE-Cy7 Ratón antihumano CLON CD73 AD2</td><td>BD Biosciences</td><td>561258</td><td></td></tr><tr><td>solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH=7,4</td><td>HiMedia</td><td>M1866</td><td></td></tr><tr><td>Solución de tripsina/EDTA (1x 0,25% de tripsina y 0,02% EDTA en solución salina equilibrada Hanks (HBSS)</td><td>HiMedia</td><td>TCL049-100mL</td><td></td></tr></tbody></table>

generación de células madre mesenquimales a partir del tejido del cordón umbilical humano y su diferenciación en el linaje del músculo esquelético

Generation of Mesenchymal Stem Cells from Human Umbilical Cord Tissue and their Differentiation into the Skeletal Muscle Lineage

La exploración del potencial terapéutico de las células madre mesenquimales depende de la facilidad de aislamiento, la potencia hacia la diferenciación y la confiabilidad y robustez de la fuente. Describimos aquí un protocolo gradual para el aislamiento de células madre mesenquimales del tejido del cordón umbilical humano (uMSC), su inmunofenotipado y la propagación de dichos cultivos en varios pasajes. En este procedimiento, la viabilidad de las uMSCs es alta porque no hay digestión enzimática. Además, la eliminación de los vasos sanguíneos, incluidas las arterias del cordón umbilical y la vena, garantiza que no haya contaminación de las células de origen endotelial. Usando citometría de flujo, las uMSCs tras el aislamiento son CD45−CD34−, lo que indica una ausencia de células del linaje hematopoyético. Es importante destacar que expresan marcadores de superficie clave, CD105, CD90 y CD73. Tras el establecimiento de cultivos, este artículo describe un método eficiente para inducir la diferenciación en estas uMSC en el linaje del músculo esquelético. Un análisis detallado de la progresión miogénica en uMSCs diferenciadas revela que las uMSCs expresan Pax7, un marcador para progenitores miogénicos en las etapas iniciales de diferenciación, seguido de la expresión de MyoD y Myf5, y, finalmente, un marcador de diferenciación terminal, la cadena pesada de miosina (MyHC).

El éxito del aislamiento de las uMSC del tejido del cordón umbilical es del &gt;95%, a diferencia de las bajas tasas de éxito de la sangre total del cordón umbilical. Tras el aislamiento exitoso de las uMSC, el análisis FACS revela que todas las células son CD34−CD45−CD105+CD90+. Sin embargo, en el análisis comparativo, las uMSC aisladas de la sangre del cordón umbilical muestran poblaciones heterogéneas, en las que una proporción de células muestra CD34 + CD45 ...

Describimos un protocolo para el aislamiento de células madre mesenquimales del tejido del cordón umbilical humano y su diferenciación en el linaje del músculo esquelético.

Generación de células madre mesenquimales a partir del tejido del cordón umbilical humano y su diferenciación en el linaje del músculo esquelético

Exploring the therapeutic potential of mesenchymal stem cells is contingent upon the ease of isolation, potency toward differentiation, and the ...

Describimos nuestro protocolo para aislar las células madre mesenquimales del tejido del cordón umbilical humano y un método robusto para diferenciarlas en linaje del músculo esquelético. Esta técnica nos permite aislar células madre mesenquimales que poseen alta viabilidad y calor, con poca o ninguna contaminación de células de origen endotelial e inducir la diferenciación miogénica de manera eficiente en estas enfermedades. La torsión del cordón y la consistencia mucoide dificultan el manejo del cordón.Mostramos cómo procesar el cordón, para no raspar la gelatina de Wharton y excluir las células endoteliales de la población. Después de recolectar el tejido del cordón umbilical en el momento del parto, transfiera la pieza de tejido del cordón umbilical del tubo de recolección a un plato tratado con cultivo de tejido de 10 centímetros cuadrados y lave bien el tejido con PBS fresco. Para cuidar la torsión del cordón umbilical y la superficie mucoide, fije el tejido con un par de fórceps sostenidos en una mano.Usando un bisturí, corte el tejido del cordón verticalmente a lo largo de su acceso longitudinal para obtener dos piezas medio cilíndricas. En este punto, observe las arterias y venas umbilicales. Usando un bisturí, retire los vasos sanguíneos raspándolos en una dirección de la superficie y enjuague el tejido del cordón umbilical en PBS para eliminar toda la sangre residual asociada con el tejido.Picar cada mitad del tejido del cordón umbilical en fragmentos de 0,5 centímetros cúbicos de tamaño. Coloque los fragmentos con la superficie luminal hacia abajo en el plato e incube el plato brevemente durante 10 minutos. Al final de la incubación, agregue 20 mililitros de medio que contengan la modificación MEM Alpha suavemente a lo largo de los lados del plato que contiene el tejido del cordón umbilical.Asegúrese de que los explantes no se desalojen de su orientación y agregue el exceso de medio para dar cuenta de una fracción que los explantes de tejido absorberán durante la incubación. Luego coloque el plato en la incubadora durante tres días. Después del final de la incubación, agregue medio fresco al cultivo y asegúrese de que los cultivos estén protegidos de los choques y el movimiento de los explantes mientras manipula los platos.Después de una semana, usando fórceps estériles, retire los fragmentos de tejido individualmente y deséchelos usando bolsas de riesgo biológico apropiadas para su eliminación. Conserve el medio existente y agregue 10 mililitros de medio de crecimiento fresco. Reemplace el medio de crecimiento cada cuatro días hasta que las colonias individuales alcancen una confluencia del 70% Después de teñir las células como se describe en el manuscrito, analice las células marcadas por citometría de flujo y determine el porcentaje de células CD105 CD90 positivas y CD105 CD73 positivas.Analice las células CD105 positivas y CD34 CD45 negativas por separado. Cubra la placa de cultivo de tejidos con 0.01% de colágeno y 20 microgramos por mililitros de laminina en PBS y colóquela en el balancín durante un mínimo de cuatro horas a temperatura ambiente. Después de la incubación, retire el colágeno y lave la placa con PBS, luego placa uMSC a 10, 000 células por centímetro cuadrado de densidad en el medio de crecimiento.Una vez que las células alcanzan el 70% de confluencia, aspire el medio de crecimiento y enjuague la placa de cultivo dos veces con PBS. Para determinar la cinética de la progresión miogénica, agregue medio M1 cada dos días a los cultivos y analice las uMSC para la expresión de pax7, MyoD, miogenina y miosina de cadena pesada a los dos días, de cuatro a cinco días, de seis a siete días y de diez a catorce días respectivamente. Las uMSC muestran la expresión de CD105 y CD90, y no expresan marcadores hematopoyéticos CD34 y CD45.Las uMSC también fueron positivas para la expresión del marcador uMSCs CD73, lo que indica que las uMSCs expresaron múltiples marcadores clave. Las uMSC mostraron expresión de pax7 dentro de los primeros dos días de la adición de M1, seguida de la expresión de MyoD dentro de los primeros cuatro días de adición de M1. Las células expresan la proteína miogenina a los seis días de diferenciación, seguida de la expresión de la cadena pesada de miosina entre 10 días y 14 días de la inducción de la diferenciación.970 genes fueron regulados al alza en respuesta a la inducción de la diferenciación miogénica en comparación con las uMSC indiferenciadas. Más genes miogénicos fueron regulados al alza en las uMSC derivadas del tejido del cordón umbilical en comparación con las uMSC derivadas de la sangre del cordón umbilical. Tanto el tejido del cordón umbilical como la sangre del cordón umbilical mostraron una regulación al alza de los genes relacionados con las proteínas citoesqueléticas, asociados con la unión a la actina y el ensamblaje de los sarcómeros, los transportadores asociados con la función contráctil, el mantenimiento de la masa muscular, la señalización del calcio y la función enzimática.Recoger el tejido en condición aséptica y mantener el cultivo estéril. El cordón debe barrerse externamente con etanol al 70% y procesarse lo más rápido posible. Muchas terapias regenerativas requieren un gran número de células de los primeros pasajes.También se puede utilizar como modelo para imitar todo el ambiente seco y reflejar el metabolismo postnatal.

generation-mesenchymal-stem-cells-from-human-umbilical-cord-tissue

Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Este protocolo describe el aislamiento y la posterior expansión de células mesenquimales del estroma y las células endoteliales que forman colonias sin el uso de suero animal para generar pares con fines de trasplante autólogo experimental.

Aislamiento y suero animal expansión libre de cordón umbilical humano derivado de células mesenquimales del estroma (MSC) y endoteliales formadoras de colonias Células Progenitoras (ECFCs)

Aislar las células madre adultas de músculo esquelético tejidos blandos sobre la base de la velocidad de la adhesión de las células para matraz.

Aislamiento de células madre de tejidos blandos musculoesqueléticos

Los vasos sanguíneos dentro del puerto músculo esquelético varias poblaciones precursoras de múltiples linajes humanos que son ideales para aplicaciones regenerativas. Este método de aislamiento permite la purificación simultánea de tres poblaciones de células precursoras multipotentes, respectivamente, de tres capas estructurales de los vasos sanguíneos: las células endoteliales de miogénicos íntima, pericitos de los medios de comunicación y células adventicias de la adventicia.

Aislamiento de Vaso sanguíneo derivado Multipotentes Precursores de músculo esquelético humano

Aquí, se describe un protocolo basado en la reprogramación epigenética de células madre embrionarias humanas (hESCs) hacia la generación de una población homogénea de células progenitoras del músculo esquelético que bajo condiciones de cultivo permisivas formar grupos tridimensionales de miofibras contráctiles (myospheres), que recapitulan las características biológicas de la humana los músculos esqueléticos.

Generación de Myospheres De hESCs por epigenética Reprogramación

Aquí, se presenta un protocolo para la disección de cordón umbilical humano umbilical (CU) y la muestra de placenta fetal en cable de forro (CL), gelatina de Wharton (WJ), la unión de cordón placenta (CPJ), y placenta fetal (FP) para el aislamiento y caracterización de células estromales mesenquimales (MSCs) utilizando la técnica de cultivo de explantes.

Aislamiento y caracterización de las células mesenquimales del estroma de cordón umbilical humano y fetal Placenta

Aquí, presentamos un método para aprovechar eficientemente el potencial de diferenciación cardiaca de jóvenes fuentes de células madre mesenquimales humanas con el fin de generar las células funcionales, contratantes, cardiomiocitos-como en vitro.

In Vitro Diferenciación de células madre mesenquimales humanas en células funcionales en cardiomiocitos

Aquí, proponemos un protocolo para la diferenciación condrogénica de células madre pluripotentes inducidas por humanos derivadas de células mononucleares de sangre del cordón umbilical.

Formación de gránulos condrogénicos a partir de células madre pluripotentes inducidas derivadas de sangre del cordón umbilical

Cordón umbilical humano (UC) puede obtenerse durante el período perinatal como consecuencia de la prematuro, término y entrega de postterm. En este protocolo, describimos el aislamiento y la caracterización de UC-derivados de células madre mesenquimales (MSCs-UC) de fetos/neonatos en 19-40 semanas de gestación.

Aislamiento y caracterización de humanas derivadas de cordón Umbilical las células madre mesenquimales de prematuros y recién nacidos a término

Proponemos un protocolo que muestra cómo distinguir keratinocytes derivados de células madre pluripotentes inducidas y fibroblastos y generar un organoide de piel 3D, usando estos queratinocitos y fibroblastos. Este protocolo contiene un paso adicional de generar un modelo de ratones humanizados. La técnica presentada aquí mejorará la investigación dermatológica.

Generación de 3D piel organoide de cable derivadas de sangre inducida por las células de vástago Pluripotent

Este protocolo describe y compara dos métodos representativos para diferenciar las hiPSC en células estromales mesenquimales (MSC). El método monocapa se caracteriza por un menor costo, una operación más simple y una diferenciación osteogénica más fácil. El método de los cuerpos embrioides (EB) se caracteriza por un menor consumo de tiempo.

Comparación de dos métodos representativos para la diferenciación de células madre pluripotentes inducidas humanas en células estromales mesenquimales

Aprende a aislar células madre mesenquimales del cordón umbilical humano y diferenciarlas en línea muscular esquelética. Este protocolo garantiza alta viabilidad celular con mínima contaminación endotelial.

Generación de células madre mesenquimales a partir del tejido del cordón umbilical humano y su diferenciación en el linaje del músculo esquelético (Video) | JoVE Journal

Generación de células madre mesenquimales a partir del tejido del cordón umbilical humano y su diferenciación en el linaje del músculo esquelético

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