Name: Efecto del ácido hialurónico 35 kDa en un modelo in vitro de lesión prematura del intestino delgado y curación utilizando monocapas derivadas de enteroides (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: Aprende el ensayo de herida por arañazo en monocapas derivadas de enteroides para estudiar la regeneración intestinal prematura. Este método permite visualizar el cierre de heridas en tiempo real usando células del intestino delgado.

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Este contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente los puntos de vista oficiales de los Institutos Nacionales de Salud. HC es apoyado por la subvención P20GM134973 de los Institutos Nacionales de Salud. KB cuenta con el apoyo de una subvención de Children's Hospital Foundation (CHF) y Presbyterian Health Foundation (PHF). Los servicios de imágenes de células vivas proporcionados por el núcleo de Genómica Funcional del Cáncer fueron apoyados en parte por la Subvención P20GM103639 del Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales y la Subvención P30CA225520 del Instituto Nacional del Cáncer del Instituto Nacional del Cáncer, otorgada al Centro de Ciencias de la Salud Stephenson del Centro de Cáncer Stephenson de la Universidad de Oklahoma.

Todos los procedimientos con animales en este estudio fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad de Oklahoma. Después de la aprobación institucional, se obtuvieron muestras fetales de conveniencia del intestino delgado de un primate no humano prematuro (NHP, 90% gestación, babuino oliva, Papio anubis) después de la eutanasia para un estudio separado (Protocolo # 101523-16-039-I)20.
1. Establecimiento de enteroides intestinales 3D de primates no humanos prematuros
<ol><li>Preparación de los medios NOTA: Los medios se pueden preparar hasta 1 semana antes del aislamiento de la cripta siguiendo la técnica aséptica estándar. La penicilina/estreptomicina (concentración final del 1%) se puede utilizar en lugar de los antibióticos de amplio espectro para las células primarias si se desea.<ol><li>Prepare el medio de crecimiento de organoides humanos + Y-27632 (HOGMY) mezclando 50 mL de medio de crecimiento de organoides medio basal humano con 50 mL de suplemento de organoide (Tabla de materiales). Añadir 200 μL de los antibióticos de amplio espectro (concentración final 100 μg/ml) (tabla de materiales) e Y-27632 (a una concentración final de 10 μM). Caliente en la mesa de trabajo a temperatura ambiente.</li>
		<li>Prepare los medios de crecimiento de organoides humanos (HOGM) mezclando 50 ml de medio basal humano medio de crecimiento organoide con 50 ml de suplemento organoide. Añadir 200 μL de los antibióticos de amplio espectro (100 μg/ml). Caliente en la mesa de trabajo a temperatura ambiente. NOTA: HOGM se utilizará cuando se cambie de medio más allá de los primeros 2-3 días posteriores a la aprobación.</li>
		<li>Enfríe 100 ml de 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS) sin calcio ni magnesio hasta que esté helada.</li>
		<li>Prepare 50 ml de tampón de lavado combinando 1x PBS sin calcio ni magnesio con albúmina sérica bovina (BSA) al 0,1%. Enfríe hasta que esté helado.</li>
		<li>Prepare el tampón de lavado DMEM-F12 agregando 1 ml de antibióticos de amplio espectro (100 μg / ml) a 500 ml de DMEM / F12 (Medio de águila modificada de Dulbecco/mezcla de jamón nutriente F12 + 15 mM HEPES tampón). Manténgalo helado.</li>
	</ol></li>
	<li>Aislamiento y chapado de criptas NOTA: El hidrogel a base de matriz extracelular (ECM) debe permanecer en el hielo durante todo el procedimiento. Este procedimiento supone suficiente tejido para poblar seis domos de hidrogel basados en ECM. Si se cosecha una densidad diferente de criptas, el número de la cúpula debe modificarse en consecuencia.<ol><li>Descongele 150 μL de extracto de membrana basal (BME) reducido (TFG) con factor de crecimiento reducido (TFG) durante la noche en el hielo a 2-8 °C.</li>
		<li>Incubar una placa de poliestireno tratado con cultivo de tejidos de fondo plano de 24 pocillos en una incubadora a 37 °C y 5% deCO2 durante un mínimo de 30 minutos antes de su uso.</li>
		<li>Después de la eutanasia NHP y la recolección de tejidos, enjuague el segmento de íleon de residuos con una punta de pipeta de 1,000 μL usando PBS 1x helado en una placa de Petri desechable. NOTA: El tejido fresco debe cosecharse rápidamente y mantenerse helado para cosechar enteroides sanos.</li>
		<li>Corte el íleon longitudinalmente a lo largo de todo el intestino y lávese con PBS 3x helado. Picar el tejido en pequeños fragmentos (aproximadamente 2 mm de longitud) con tijeras estériles sobre un tubo cónico de 50 ml que contiene 15 ml de PBS helado, comenzando desde la porción del segmento ileal más cercana al tubo.</li>
		<li>Use una pipeta serológica de 10 ml para interrumpir las criptas pipeteando hacia arriba y hacia abajo 5-10x. Deje que los segmentos de tejido se asienten en el fondo del tubo, luego retire el sobrenadante y reemplácelo con PBS fresco y helado. Repita este proceso un mínimo de 7x-10x hasta que el sobrenadante esté limpio y libre de residuos.</li>
		<li>Una vez claro, retire el sobrenadante y vuelva a suspender las criptas en 25 ml de reactivo de disociación celular. Coloque el tubo en una plataforma oscilante a 20 rpm durante 15 minutos a temperatura ambiente.</li>
		<li>Retire el tubo del balancín, deje que las células se asienten durante aproximadamente 30 s a 1 min, y retire el sobrenadante. Agregue 10 ml de tampón de lavado helado. Pipetear hacia arriba y hacia abajo con una pipeta p1000 para disociar aún más en criptas individuales.</li>
		<li>Filtre el tejido a través de un filtro celular de 70 μm en un nuevo tubo cónico de 50 ml. Enjuague el tubo cónico original de 50 ml con 10 ml de tampón de lavado helado y filtre a través del filtro de 70 μm para asegurarse de que todas las criptas se hayan retirado del tubo original. Repita este lavado de pañuelos de papel para un total de 4x enjuagues.</li>
		<li>Centrifugar el filtrado a 300 x g durante 5 min a 4 °C y retirar el sobrenadante. Añadir 600 μL de HOGMY e interrumpir el pellet pipeteando hacia arriba y hacia abajo con una pipeta de 200 μL. Coloque el tubo sobre hielo hasta que la solución se enfríe como el hielo. NOTA: Si la solución no está helada, la cúpula no mantendrá la estructura adecuada cuando esté plateada. Evite introducir burbujas al pipetear domos de hidrogel a base de ECM, ya que las burbujas evitarán la adherencia adecuada al fondo de la placa.</li>
		<li>Añadir 600 μL de hidrogel helado a base de ECM para suspender el pellet celular y mezclar bien con una pipeta de 200 μL.</li>
		<li>Retire la placa de 24 pocillos de la incubadora y colóquela en un calentador de placas a 37 °C. Pipetear 50 μL de mezcla de hidrogel helada a base de HOGMY/ECM en el centro de 24 pocillos de una placa de cultivo de 24 pocillos (50 μL por domo).</li>
		<li>Una vez plateadas, deje que las cúpulas se asienten en un calentador de placas a 37 ° C durante 1 minuto para permitir la adherencia a la parte inferior de la placa. Invierta cuidadosamente la placa, asegúrese de que no se haya acumulado condensación en la parte inferior de la placa y coloque la placa invertida en la incubadora a 37 °C y 5% deCO2.</li>
		<li>Después de 15 minutos, gire la placa hacia arriba y pipete 750 μL de HOGMY a temperatura ambiente en cada pocillo. NOTA: Pipetea los medios lentamente sobre la pared lateral de los pocillos, teniendo cuidado de no interrumpir la cúpula de hidrogel basada en ECM 3D recién formada.</li>
		<li>Una vez que todos los pocillos se hayan llenado con medios, coloque la placa en la incubadora y cambie el medio cada 3 días con 750 μL de HOGM. Paso enteroides cada 7-10 días.</li>
	</ol></li>
	<li>Evacuación enteroide intestinal NOTA: El siguiente protocolo es para una placa de cultivo de 24 pocillos que contiene enteroides NHP a una velocidad de división de 1:2.<ol><li>Retire los medios enteroides de cada pocillo, teniendo cuidado de no interrumpir la cúpula ECM que contiene enteroides, agregue 500 μL de reactivo de disociación de células heladas a cada pocillo con una pipeta de 1.000 μL e incube a temperatura ambiente durante 1 minuto.</li>
		<li>Interrumpa manualmente el ECM pipeteando hacia arriba y hacia abajo 8-12x. Transfiera el contenido de 12 pocillos a un tubo cónico de 15 ml.</li>
		<li>Una vez que se haya recogido toda la solución de la placa de cultivo de 24 pocillos, agregue 250 μL de reactivo de interrupción celular a cada pocillo para asegurarse de que todos los enteroides NHP se hayan eliminado de cada pocillo, agregando este último enjuague a los tubos cónicos de 15 ml existentes.</li>
		<li>Colóquelo en una plataforma oscilante a 40 rpm durante 15 min a temperatura ambiente (20 °C). Alternativamente, agite manualmente los tubos durante 15 minutos a temperatura ambiente.</li>
		<li>Después de 15 min, centrifugar a 300 x g durante 5 min a 4 °C. Retire el sobrenadante de los tubos de 15 ml hasta que solo quede el pellet.</li>
		<li>Agregue 8 ml de DMEM helado + antibióticos de amplio espectro a un tubo cónico de 15 ml, asegurándose de que el pellet esté suficientemente interrumpido. Centrifugar a 300 x g durante 5 min a 4 °C y desechar el sobrenadante.</li>
		<li>Añadir 600 μL de HOGMY e interrumpir el pellet pipeteando hacia arriba y hacia abajo con una pipeta de 1.000 μL. Coloque el tubo sobre hielo hasta que la solución se enfríe como el hielo. Una vez que la solución esté helada, añadir 600 μL de ECM helada para suspender el pellet de la célula y mezclar bien con una pipeta de 1.000 μL. Repita los pasos 1.3.2.-1.3.7. para los 12 pozos restantes.<ol><li>Para los pasos restantes, consulte los pasos 1.2.11.-1.2.16.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>2. Establecimiento de monocapa enteroide y ensayo de herida por rasguño
<ol><li>Preparación de medios y tratamiento<ol><li>Enfríe 5 ml de PBS sin calcio o magnesio hasta que esté helado.</li>
		<li>Prepare el tampón de lavado DMEM-F12 agregando 1 ml de antibióticos de amplio espectro (100 μg / ml) a 500 ml de DMEM / F12 (Medio de águila modificada de Dulbecco/mezcla de jamón nutriente F12 + 15 mM HEPES tampón). Mantener el hielo frío.</li>
		<li>Prepare 100 ml de HOGMY, como se describe en el paso 1.1.1., y caliéntelo en la mesa de trabajo a temperatura ambiente.</li>
		<li>Calentar 25 ml de ácido tripsina-etilendiaminotetraacético (EDTA) al 0,25% en un baño maría a 37 °C.</li>
		<li>Preparar concentraciones de 50 μg/mL, 100 μg/mL y 200 μg/mL de HA35 para el tratamiento celular, utilizando PBS estéril sin calcio o magnesio como disolvente. La dilución final de HA35 utilizará HOMGY como disolvente. NOTA: La preparación de HA35 puede requerir varias diluciones, ya que HA35 a menudo sale de la solución a una concentración superior a 5 mg / ml.</li>
	</ol></li>
	<li>Formación de monocapa enteroide NOTA: El siguiente procedimiento proporciona volúmenes suficientes para la generación de una placa de 24 pocillos de monocapas enteroides. Ajuste los volúmenes para el número deseado de monocapas.<ol><li>Descongele 96 μL de hidrogel BME (libre de rojo de fenol) a base de ECM durante la noche en hielo a 2-8 °C. Diluir el hidrogel a base de ECM en PBS helado sin calcio ni magnesio en una proporción de 1:50. Cubra cada pocillo de una placa de cultivo de tejido de 24 pocillos con 200 μL de hidrogel diluido a base de ECM helado.</li>
		<li>Incubar la placa recubierta de hidrogel a base de ECM durante un mínimo de 1 h a 37 °C y 5% deCO2. Aspirar los medios de la placa de cultivo de 24 pocillos que contiene los enteroides 3D destinados a monocapas y reemplazarlos con 500 μL de reactivo/pocillo de disociación celular.</li>
		<li>Interrumpa manualmente los domos de hidrogel basados en ECM pipeteando hacia arriba y hacia abajo 8x-12x y transfiera el contenido de 12 pocillos a un tubo cónico de 15 ml.</li>
		<li>Lave los 12 pocillos vacíos con 250 μL de reactivo de disociación celular para asegurarse de que se hayan eliminado todos los enteroides y transfiera el contenido a un tubo cónico de 15 ml. Repita el paso 2.2.5. y paso 2.2.6. para los 12 pocillos restantes utilizando un segundo tubo cónico de 15 ml.</li>
		<li>Centrifugar los tubos cónicos a 300 x g durante 5 min a 4 °C y desechar el sobrenadante. Agregue 10 ml de tampón de lavado DMEM-F12 helado a 15 ml de tubos cónicos y suspenda los gránulos enteroides invirtiendo los tubos. Centrifugar a 300 x g durante 5 min a 4 °C.</li>
		<li>Retirar el sobrenadante y resuspender los gránulos celulares en 12 mL de tripsina-EDTA a 37 °C. Coloque los tubos en un baño de agua a 37 °C durante 10 minutos o hasta que las células parezcan solubles. Agregue 3 ml de tampón de lavado DMEM-F12 a cada tubo para diluir la tripsina-EDTA, mezcle invirtiendo los tubos y colóquelos en hielo.</li>
		<li>Filtre los enteroides disociados a través de un filtro de células de malla de 37 μM, recogiendo el contenido en tubos cónicos limpios de 15 ml. Centrifugar los tubos a 300 x g durante 5 min a 4 °C.</li>
		<li>Mientras las células se peletizan en la centrífuga, retire la placa recubierta de hidrogel a base de ECM de la incubadora y aspire cualquier exceso de solución de hidrogel a base de ECM sin rayar la superficie recubierta ni dejar que la placa se seque completamente.</li>
		<li>Retire el sobrenadante de los tubos cónicos y resuspenda los gránulos celulares con 6 ml de HOMGY. Agregue 500 μL de la suspensión combinada de células HOMGY de 12 ml en cada pocillo de la placa de 24 pocillos recubierta con hidrogel a base de ECM a una densidad de siembra de aproximadamente 3 x 105 células/pocillo. Agite la placa con una tapa para asegurar una distribución uniforme de las células dentro de los pocillos.</li>
		<li>Incubar la placa a 37 °C y 5% deCO2, intercambiando medios HOMGY cada 2 días hasta que las monocapas alcancen &gt;90% de confluencia.</li>
	</ol></li>
	<li>Tratamiento monocapa y ensayo de heridas por rasguño<ol><li>Una vez que las monocapas alcancen &gt;90% de confluencia, aspire los medios para eliminar las células que no se adhieran. Tratar las células con 500 μL de HA35 (50 μg/mL, 100 μg/mL, 200 μg/mL) o PBS, disueltos en HOMGY, durante 24 h.</li>
		<li>Después de 24 h, retire el medio, teniendo cuidado de no interrumpir la superficie de la monocapa. Usando una punta de pipeta de 200 μL, haga un rasguño lineal en todo el diámetro de la superficie de la monocapa en cada pocillo, teniendo cuidado de no dejar que las monocapas se sequen.</li>
		<li>Lave las monocapas rayadas 1x con 500 μL de 1x PBS. Añadir 500 μL de HA35 (50 μg/ml, 100 μg/ml, 200 μg/ml) o PBS disuelto en HOMGY y transferir la placa al instrumento de análisis de células vivas (tabla de materiales) dentro de una incubadora de 37 °C y 5% deCO2 .</li>
		<li>En el icono Schedule (Programación ) en el software de análisis de células vivas (Tabla de materiales), haga clic en el icono Launch Add New Vessel Wizard (Iniciar agregar nuevo buque) y configure la frecuencia de escaneo para escanear según un cronograma. Cree un nuevo recipiente de pozo completo en Tipo de escaneo, especifique la configuración de escaneo (es decir, Fase para canales de imagen y 4x para Objetivo) y haga clic en Siguiente.</li>
		<li>Seleccione el fabricante de la placa y el número de catálogo de la lista proporcionada. En el icono Programación , elija el símbolo más donde se colocará la placa dentro del instrumento de análisis de células vivas. Seleccione el patrón de escaneo deseado y, a continuación, cree un mapa de placas seleccionando "+" en la página Diseño de placa. Seleccione Aplazar análisis hasta más tarde y, a continuación, establezca el Programa de escaneo para cada 4 h durante 24 h y verifique la configuración de adquisición en la página Resumen del asistente de buques . Finalmente, seleccione Agregar a programación.</li>
		<li>Una vez completado el ensayo 24, en el icono Ver, haga doble clic en Nombre del buque y exporte imágenes y películas. Seleccione pozos y una serie de imágenes para mostrar y exportar como JPEG. Analice las imágenes para el porcentaje de cicatrización de heridas utilizando el complemento Wound Healing Size para ImageJ21, según el paso 2.4. abajo.</li>
	</ol></li>
	<li>Análisis de heridas por arañazos<ol><li>Abra el software ImageJ. Cargue las imágenes del ensayo de la herida por rasguño (. TIFF o .JPG).</li>
		<li>Seleccione Imagen &gt; Tipo &gt; 8 bits para cambiar la imagen de RGB de 24 bits a 8 bits. Instale el complemento Wound Healing Size seleccionando Plugins &gt; Macros &gt; Install &gt; Wound Healing Size Plugin.</li>
		<li>Gire la imagen para que el rasguño sea vertical e inicialice el complemento Wound Healing Size Tool.</li>
		<li>Seleccione los parámetros del complemento en el cuadro de diálogo para que se ajusten mejor a la herida por arañazo. Establezca el valor de los parámetros para las opciones de tamaño de cicatrización de heridas de la siguiente manera: Radio de ventana de varianza en 20, Valor de umbral en 100 y Porcentaje de píxeles saturados en 0,001, y elija Sí para Establecer escala global. Finalice la selección haciendo clic en el botón Aceptar. Verifique si el área seleccionada es el área de la herida. Los parámetros anteriores pueden requerir estandarización de laboratorio a laboratorio.</li>
		<li>Repita los pasos 2.4.2.-2.4.4. para los puntos de tiempo restantes para cada rasguño.</li>
		<li>Calcule el porcentaje de cicatrización de heridas en el área de rasguño de células migratorias o proliferantes durante 24 h de la siguiente manera: % de cicatrización de heridas = <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63758/63758eq01.jpg" style="margin: auto;"> donde T 0 = % Área en el momento 0 h y Tc = % Área a las 0 h, 4 h, 12 h o 24 h.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Lemons, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Very+low+birth+weight+outcomes+of+the+National+Institute+of+Child+Health+and+Human+Development+Neonatal+Research+Network%2C+January+1995+through+December+1996%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Very low birth weight outcomes of the National Institute of Child Health and Human Development Neonatal Research Network, January 1995 through December 1996.</a> Pediatrics. 107 (1), 1(2001).</li>
<li>Burge, K., Vieira, F., Eckert, J., Chaaban, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+composition%2C+digestion%2C+and+absorption+differences+among+neonatal+feeding+strategies%3A+Potential+implications+for+intestinal+inflammation+in+preterm+infants%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrients%22%5BJournal%5D)">Lipid composition, digestion, and absorption differences among neonatal feeding strategies: Potential implications for intestinal inflammation in preterm infants.</a> Nutrients. 13 (2), 550(2021).</li>
<li>Duffy, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+mediating+bacterial+translocation+in+the+immature+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Interactions mediating bacterial translocation in the immature intestine.</a> The Journal of Nutrition. 130, 2S Suppl 432-436 (2000).</li>
<li>Nanthakumar, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+excessive+intestinal+inflammation+in+necrotizing+enterocolitis%3A+An+immature+innate+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The mechanism of excessive intestinal inflammation in necrotizing enterocolitis: An immature innate immune response.</a> PLoS One. 6 (3), 17776(2011).</li>
<li>Nanthakumar, N. N., Fusunyan, R. D., Sanderson, I., Walker, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+in+the+developing+human+intestine%3A+A+possible+pathophysiologic+contribution+to+necrotizing+enterocolitis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Inflammation in the developing human intestine: A possible pathophysiologic contribution to necrotizing enterocolitis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (11), 6043-6048 (2000).</li>
<li>He, Y., Lawlor, N. T., Newburg, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+milk+components+modulate+toll-like+receptor-mediated+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Human milk components modulate toll-like receptor-mediated inflammation.</a> Advances in Nutrition. 7 (1), 102-111 (2016).</li>
<li>Walker, W. A., Iyengar, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+milk%2C+microbiota%2C+and+intestinal+immune+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Research%22%5BJournal%5D)">Breast milk, microbiota, and intestinal immune homeostasis.</a> Pediatric Research. 77 (1-2), 220-228 (2015).</li>
<li>Westerbeek, E. A., vanden Berg, A., Lafeber, H. N., Fetter, W. P., van Elburg, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+enteral+supplementation+of+a+prebiotic+mixture+of+non-human+milk+galacto-%2C+fructo-+and+acidic+oligosaccharides+on+intestinal+permeability+in+preterm+infants%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Nutrition%22%5BJournal%5D)">The effect of enteral supplementation of a prebiotic mixture of non-human milk galacto-, fructo- and acidic oligosaccharides on intestinal permeability in preterm infants.</a> British Journal of Nutrition. 105 (2), 268-274 (2011).</li>
<li>vanden Berg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+glutamine-enriched+enteral+nutrition+on+intestinal+permeability+in+very-low-birth-weight+infants%3A+A+randomized+controlled+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Parenteral+and+Enteral+Nutrition%22%5BJournal%5D)">The effect of glutamine-enriched enteral nutrition on intestinal permeability in very-low-birth-weight infants: A randomized controlled trial.</a> Journal of Parenteral and Enteral Nutrition. 30 (5), 408-414 (2006).</li>
<li>Foster, J. P., Seth, R., Cole, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+immunoglobulin+for+preventing+necrotizing+enterocolitis+in+preterm+and+low+birth+weight+neonates%5BTitle%5D)+AND+%22The+Cochrane+Database+of+Systematic+Reviews%22%5BJournal%5D)">Oral immunoglobulin for preventing necrotizing enterocolitis in preterm and low birth weight neonates.</a> The Cochrane Database of Systematic Reviews. 4 (4), (2016).</li>
<li>Maffei, D., Schanler, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+milk+is+the+feeding+strategy+to+prevent+necrotizing+enterocolitis%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Perinatology%22%5BJournal%5D)">Human milk is the feeding strategy to prevent necrotizing enterocolitis.</a> Seminars in Perinatology. 41 (1), 36-40 (2017).</li>
<li>Patel, A. L., Kim, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+milk+and+necrotizing+enterocolitis%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Pediatric+Surgery%22%5BJournal%5D)">Human milk and necrotizing enterocolitis.</a> Seminars in Pediatric Surgery. 27 (1), 34-38 (2018).</li>
<li>Nolan, L. S., Parks, O. B., Good, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+the+immunomodulating+components+of+maternal+breast+milk+and+protection+against+necrotizing+enterocolitis%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrients%22%5BJournal%5D)">A review of the immunomodulating components of maternal breast milk and protection against necrotizing enterocolitis.</a> Nutrients. 12 (1), 14(2019).</li>
<li>Hill, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+milk+hyaluronan+enhances+innate+defense+of+the+intestinal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Human milk hyaluronan enhances innate defense of the intestinal epithelium.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (40), 29090-29104 (2013).</li>
<li>Burge, K., Bergner, E., Gunasekaran, A., Eckert, J., Chaaban, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+glycosaminoglycans+in+protection+from+neonatal+necrotizing+enterocolitis%3A+A+narrative+review%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrients%22%5BJournal%5D)">The role of glycosaminoglycans in protection from neonatal necrotizing enterocolitis: A narrative review.</a> Nutrients. 12 (2), 546(2020).</li>
<li>Chaaban, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acceleration+of+small+intestine+development+and+remodeling+of+the+microbiome+following+hyaluronan+35+kDa+treatment+in+neonatal+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrients%22%5BJournal%5D)">Acceleration of small intestine development and remodeling of the microbiome following hyaluronan 35 kDa treatment in neonatal mice.</a> Nutrients. 13 (6), 2030(2021).</li>
<li>Gunasekaran, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyaluronan+35+kDa+enhances+epithelial+barrier+function+and+protects+against+the+development+of+murine+necrotizing+enterocolitis%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Research%22%5BJournal%5D)">Hyaluronan 35 kDa enhances epithelial barrier function and protects against the development of murine necrotizing enterocolitis.</a> Pediatric Research. 87 (7), 1177-1184 (2020).</li>
<li>Montenegro-Miranda, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+organoid+model+of+damage+and+repair+identifies+HNF4%CE%B1+as+a+critical+regulator+of+intestinal+epithelial+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">A novel organoid model of damage and repair identifies HNF4α as a critical regulator of intestinal epithelial regeneration.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 10 (2), 209-223 (2020).</li>
<li>Lee, C., Hong, S. N., Kim, E. R., Chang, D. K., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+regeneration+ability+of+Crohn%27s+disease+assessed+using+patient-derived+intestinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Epithelial regeneration ability of Crohn's disease assessed using patient-derived intestinal organoids.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (11), 6013(2021).</li>
<li>Gurung, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+Zika+virus+%28ZIKV%29+infection+following+vaginal+inoculation+with+ZIKV-infected+semen+in+timed-pregnant+olive+baboons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Maternal Zika virus (ZIKV) infection following vaginal inoculation with ZIKV-infected semen in timed-pregnant olive baboons.</a> Journal of Virology. 94 (11), 00058(2020).</li>
<li>Suarez-Arnedo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+image+J+plugin+for+the+high+throughput+image+analysis+of+in+vitro+scratch+wound+healing+assays%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">An image J plugin for the high throughput image analysis of in vitro scratch wound healing assays.</a> PLoS One. 15 (7), 0232565(2020).</li>
<li>Kobelt, D., Walther, W., Stein, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+cell+migration+monitoring+to+analyze+drug+synergism+in+the+scratch+assay+using+the+IncuCyte+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Real-time cell migration monitoring to analyze drug synergism in the scratch assay using the IncuCyte system.</a> Methods in Molecular Biology. 2294, 133-142 (2021).</li>
<li>de Jong, J. C. W., Ijssennagger, N., van Mil, S. W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+milk+nutrients+driving+intestinal+epithelial+layer+maturation+via+Wnt+and+Notch+signaling%3A+Implications+for+necrotizing+enterocolitis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+-+Molecular+Basis+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Breast milk nutrients driving intestinal epithelial layer maturation via Wnt and Notch signaling: Implications for necrotizing enterocolitis.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1867 (11), 166229(2021).</li>
<li>Yu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erythropoietin+protects+epithelial+cells+from+excessive+autophagy+and+apoptosis+in+experimental+neonatal+necrotizing+enterocolitis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Erythropoietin protects epithelial cells from excessive autophagy and apoptosis in experimental neonatal necrotizing enterocolitis.</a> PLoS One. 8 (7), 69620(2013).</li>
<li>Kessler, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifunctional+role+of+35+kilodalton+hyaluronan+in+promoting+defense+of+the+intestinal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Multifunctional role of 35 kilodalton hyaluronan in promoting defense of the intestinal epithelium.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 66 (4), 273-287 (2018).</li>
<li>Fraser, J. R. E., Laurent, T. C., Laurent, U. B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyaluronan%3A+Its+nature%2C+distribution%2C+functions+and+turnover%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Internal+Medicine%22%5BJournal%5D)">Hyaluronan: Its nature, distribution, functions and turnover.</a> Journal of Internal Medicine. 242 (1), 27-33 (1997).</li>
<li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyaluronan+35kDa+treatment+protects+mice+from+Citrobacter+rodentium+infection+and+induces+epithelial+tight+junction+protein+ZO-1+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biology%22%5BJournal%5D)">Hyaluronan 35kDa treatment protects mice from Citrobacter rodentium infection and induces epithelial tight junction protein ZO-1 in vivo.</a> Matrix Biology. 62, 28-39 (2017).</li>
<li>Prehm, P., Schumacher, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+hyaluronan+export+from+human+fibroblasts+by+inhibitors+of+multidrug+resistance+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Inhibition of hyaluronan export from human fibroblasts by inhibitors of multidrug resistance transporters.</a> Biochemical Pharmacology. 68 (7), 1401-1410 (2004).</li>
<li>Stenson, W. F., Ciorba, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonmicrobial+activation+of+TLRs+controls+intestinal+growth%2C+wound+repair%2C+and+radioprotection%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Nonmicrobial activation of TLRs controls intestinal growth, wound repair, and radioprotection.</a> Frontiers in Immunology. 11 (3591), 617510(2021).</li>
<li>Riehl, T. E., Ee, X., Stenson, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyaluronic+acid+regulates+normal+intestinal+and+colonic+growth+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Gastrointestinal+and+Liver+Physiology%22%5BJournal%5D)">Hyaluronic acid regulates normal intestinal and colonic growth in mice.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 303 (3), 377-388 (2012).</li>
<li>Riehl, T. E., Santhanam, S., Foster, L., Ciorba, M., Stenson, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD44+and+TLR4+mediate+hyaluronic+acid+regulation+of+Lgr5%2B+stem+cell+proliferation%2C+crypt+fission%2C+and+intestinal+growth+in+postnatal+and+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Gastrointestinal+and+Liver+Physiology%22%5BJournal%5D)">CD44 and TLR4 mediate hyaluronic acid regulation of Lgr5+ stem cell proliferation, crypt fission, and intestinal growth in postnatal and adult mice.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 309 (11), 874-887 (2015).</li>
<li>Hill, D. R., Kessler, S. P., Rho, H. K., Cowman, M. K., de la Motte, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific-sized+hyaluronan+fragments+promote+expression+of+human+beta-defensin+2+in+intestinal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Specific-sized hyaluronan fragments promote expression of human beta-defensin 2 in intestinal epithelium.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (36), 30610-30624 (2012).</li>
<li>Fernando, E. H., Gordon, M. H., Beck, P. L., MacNaughton, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+intestinal+epithelial+wound+healing+through+protease-activated+receptor-2+activation+in+Caco2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacology+and+Experimental+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Inhibition of intestinal epithelial wound healing through protease-activated receptor-2 activation in Caco2 cells.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 367 (2), 382-392 (2018).</li>
<li>Nyegaard, S., Christensen, B., Rasmussen, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+method+for+accurate+quantification+of+cell+migration+using+human+small+intestine+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolic+Engineering+Communications%22%5BJournal%5D)">An optimized method for accurate quantification of cell migration using human small intestine cells.</a> Metabolic Engineering Communications. 3, 76-83 (2016).</li>
<li>Roodsant, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human+2D+primary+organoid-derived+epithelial+monolayer+model+to+study+host-pathogen+interaction+in+the+small+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A human 2D primary organoid-derived epithelial monolayer model to study host-pathogen interaction in the small intestine.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 272(2020).</li>
<li>Singh, A., Poling, H. M., Spence, J. R., Wells, J. M., Helmrath, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastrointestinal+organoids%3A+a+next-generation+tool+for+modeling+human+development%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Gastrointestinal+and+Liver+Physiology%22%5BJournal%5D)">Gastrointestinal organoids: a next-generation tool for modeling human development.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 319 (3), 375-381 (2020).</li>
<li>Foulke-Abel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+enteroids+as+an+ex-vivo+model+of+host-pathogen+interactions+in+the+gastrointestinal+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Human enteroids as an ex-vivo model of host-pathogen interactions in the gastrointestinal tract.</a> Experimental Biology and Medicine. 239 (9), 1124-1134 (2014).</li>
<li>Foulke-Abel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+enteroids+as+a+model+of+upper+small+intestinal+ion+transport+physiology+and+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Human enteroids as a model of upper small intestinal ion transport physiology and pathophysiology.</a> Gastroenterology. 150 (3), 638-649 (2016).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar ni conflictos de intereses.

El tracto gastrointestinal de un recién nacido prematuro está bajo presión regenerativa continua por exposiciones repetidas a insultos ambientales asociados con disbiosis, metabolitos y toxinas bacterianas inflamatorias, e hipoxia intermitente23,24. Desafortunadamente, el epitelio intestinal del recién nacido prematuro es incapaz de establecer rápidamente la integridad funcional23, lo que resulta en disfunción de barrera, aumento de la per...

La enterocolitis necrosante (ECN) es una de las urgencias gastrointestinales más frecuentes en lactantes prematuros1. La enfermedad se caracteriza por una inflamación intestinal severa que puede deteriorarse rápidamente a necrosis intestinal, sepsis y potencialmente la muerte. Aunque la etiología no está clara, la evidencia sugiere que la ECN es multifactorial y el resultado de una compleja interacción de alimentación, colonización bacteriana anormal y epitelio intestinal inmaduro 2,3. Los lactantes prematuros tienen mayor permeabilidad intestinal, colonización bacteriana anormal y baja capacidad regenerativa de enterocitos4,5, lo que aumenta el riesgo de disfunción de la barrera intestinal, translocación bacteriana y desarrollo de NEC. Por lo tanto, identificar estrategias o intervenciones para acelerar la maduración epitelial intestinal y promover la regeneración o curación del epitelio intestinal es fundamental para prevenir esta enfermedad mortal.
Los estudios han demostrado que la leche materna (HM) protege contra la ECN en lactantes prematuros 6,7,8,9,10,11. Tanto los estudios en humanos como en animales han demostrado que la fórmula de base bovina aumenta la permeabilidad intestinal y es directamente tóxica para las células epitelialesintestinales 2,12. Aunque no está completamente dilucidado, la evidencia sugiere que los efectos protectores de HM están mediados por componentes bioactivos como lactoferrina, inmunoglobulina A (IgA) y oligosacáridos HM13. HM también es rico en hialuronano (HA), un glicosaminoglicano no sulfatado único con ácido D-glucurónico repetitivo y N-acetil-D-glucosamina disacáridos14,15. Es importante destacar que hemos demostrado que el HA oral de 35 kDa (HA35), un imitador de HM HA, atenúa la gravedad de la lesión intestinal, previene la translocación bacteriana y disminuye la mortalidad en un modelo murino de lesión intestinal similar a NEC16,17. 
Aquí, los efectos de HA35 en la curación intestinal y la regeneración in vitro se investigan más a fondo. Actualmente, el ensayo in vitro más utilizado para heridas intestinales y reparación es un ensayo de herida por rasguño realizado en monocapas de células de cáncer colorrectal (CCR). La relevancia fisiológica de tal modelo para el intestino del lactante prematuro es limitada, ya que la reparación de heridas de las células del CCR depende en gran medida de la naturaleza altamente proliferativa de las células cancerosas en lugar de los procesos de reparación impulsados por células madre18. Para superar esta limitación, aquí se describe el establecimiento de un modelo de herida por rasguño enteroide 2D, incluido el procedimiento de aislamiento y mantenimiento de enteroides intestinales delgados derivados de células madre primarias de primates prematuros no humanos (NHP). Dado que la ECN prematura se informa con mayor frecuencia en el intestino delgado distal, el uso de organoides de células epiteliales primarias en un modelo de daño y reparación intestinal proporciona un modelo in vitro más fisiológicamente traducible en comparación con los modelos existentes que utilizan monocapas colorrectales tradicionales18,19.

<table><tbody><tr><td>10 mL Pipeta serológica</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-675-49</td><td></td></tr><tr><td>100x21mm Plato, Nunclon Delta</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>172931</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Tubo cónico</td><td>VWR</td><td>89039-666</td><td></td></tr><tr><td>24 pocillos, tratado con TC, placa de fondo plano</td><td>Corning</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>37 &micro; M Filtro de células reversible</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>27215</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Tubo cónico</td><td>VWR</td><td>89039-658</td><td></td></tr><tr><td>70 &micro; m Filtros de células estériles</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB22-363-548</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina, Bovino (BSA)</td><td>VWR</td><td>0332-100G</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter-Glo Ensayo de viabilidad celular 3D</td><td>Promega</td><td>G9681</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Adiestrado de águila modificado/nutriente Mezcla de jamón F-12 (DMEM-F12) con tampón HEPES de 15 mM</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>36254</td><td></td></tr><tr><td>Gentle Cell Reactivo de disociación</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>100-0485</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>imagej.nih.gov/ij/</td><td></td></tr> <tr><td>Incucyte S3 Instrumento de análisis de células vivas</td><td>Sartorius</td><td>4647</td><td></td></tr><tr><td>Módulo de software de análisis de heridas por arañazo de incucyte</td><td>Sartorius</td><td>9600-0012</td><td></td></tr><tr><td>IntestiCult Medio de crecimiento de organoides (humano)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>06010</td><td>Esto es HOGMY, pero sin el Y-27632 ni antibióticos. También se utiliza como base para HOGM, pero luego solo faltan los antibióticos.</td></tr><tr><td>Lipopolisacáridos de Escherichia coli O111:B4, purificados por cromatografía de filtración en gel</td><td>Millipore Sigma</td><td>L3012-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Matriz de membrana basal reducida (GFR) con factor de crecimiento (GFR), sin rojo de fenol</td><td>Corning</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>Nunc MicroWell de 96 pocillos, Nunclon con tratamiento Delta, microplaca de fondo plano</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>136101</td><td></td></tr><tr><td>PBS (solución salina tamponada con fosfato), 1X [-] Calcio, magnesio, pH 7.4</td><td>Corning</td><td>21-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>Primocin</td><td>Invivogen</td><td>ant-pm-1</td><td>Se trata de antibióticos de amplio espectro</td></tr><tr><td>Hialuronato de sodio, grado de investigación, HA20K</td><td>Lifecore Biomedical</td><td>HA20K-1</td><td></td></tr><tr><td>TC20 Contador de células automatizado</td><td>Compañía: Bio-Rad</td><td>1450102</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA 1X, 0.25% Tripsina</td><td>Fisher Scientific MT25053CI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Tecnologías STEMCELL</td><td>72302</td><td></td></tr></tbody></table>

efecto del ácido hialurónico 35 kda en un modelo in vitro de lesión prematura del intestino delgado y curación utilizando monocapas derivadas de enteroides

Effect of Hyaluronic Acid 35 kDa on an In Vitro Model of Preterm Small Intestinal Injury and Healing Using Enteroid-Derived Monolayers

Los ensayos de heridas por rasguño in vitro se utilizan comúnmente para investigar los mecanismos y características de la curación epitelial en una variedad de tipos de tejidos. Aquí, describimos un protocolo para generar una monocapa bidimensional (2D) a partir de enteroides de primates no humanos tridimensionales (3D) derivados de criptas intestinales del íleon terminal. Estas monocapas derivadas de enteroides se utilizaron en un ensayo in vitro de herida por rasguño para probar la capacidad del hialuronano 35 kDa (HA35), un imitador de HA de la leche humana, para promover la migración y proliferación celular a lo largo del borde de la herida epitelial. Después de que las monocapas se cultivaron hasta la confluencia, se rayaron manualmente y se trataron con HA35 (50 μg / ml, 100 μg / ml, 200 μg / ml) o control (PBS). La migración celular y la proliferación en la brecha se obtuvieron imágenes utilizando un microscopio de luz transmitida equipado para imágenes de células vivas. El cierre de la herida se cuantificó como porcentaje de cicatrización de heridas utilizando el complemento Wound Healing Size en ImageJ. El área de rasguño y la tasa de migración celular y el porcentaje de cierre de la herida se midieron durante 24 h. HA35 in vitro acelera la cicatrización de heridas en monocapas enteroides del intestino delgado, probablemente a través de una combinación de proliferación celular en el borde de la herida y migración al área de la herida. Estos métodos pueden usarse potencialmente como modelo para explorar la regeneración intestinal en el intestino delgado humano prematuro.

Los efectos de la AH en la reparación de tejidos y la cicatrización de heridas en diversos tejidos y órganos están bien documentados; sin embargo, actualmente se desconocen los efectos específicos del AH con un peso molecular de 35 kDa sobre la cicatrización y regeneración fetal o neonatal del intestino delgado. Para probar la capacidad de HA35 para promover la cicatrización de heridas en un modelo del intestino delgado fetal o neonatal, generamos enteroides intestinales 3D a partir de tejido ileal NHP y disociamos aún m...

Este protocolo describe un método para establecer y realizar un ensayo de herida por rasguño en monocapas bidimensionales (2D) derivadas de enteroides tridimensionales (3D) aislados del íleon de primates no humanos.

Efecto del ácido hialurónico 35 kDa en un modelo in vitro de lesión prematura del intestino delgado y curación utilizando monocapas derivadas de enteroides

In vitro scratch wound assays are commonly used to investigate the mechanisms and characteristics of epithelial healing in a variety of tissue types. ...

Este protocolo amplía el ensayo muy común de herida por rasguño utilizado para estudios de regeneración con monocapas derivadas de enteroides que representan todos los tipos principales de células del intestino delgado. Esta técnica permite la visualización en tiempo real del cierre de la herida en un modelo monocapa enteroide 2D prematuro de regeneración intestinal. Nuestra técnica se puede aplicar al estudio del intestino prematuro de mamíferos, que generalmente está mal modelado utilizando líneas celulares de cáncer colorrectal transformadas.Comience descongelando 96 microlitros de matriz extracelular, o BME de hidrogel basado en ECM, durante la noche en hielo a dos a ocho grados centígrados. Diluir el hidrogel a base de ECM y el PBS helado sin calcio ni magnesio en una proporción de uno a 50. Cubra cada pocillo de una placa de cultivo de tejido de 24 pocillos con 200 microlitros de hidrogel diluido a base de ECM helado e incube la placa recubierta durante un mínimo de una hora a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono.Luego aspire los medios de la placa de cultivo de 24 pocillos que contiene los enteroides 3D destinados a monocapas y reemplácelos con 500 microlitros de reactivo de disociación celular por pocillo. Interrumpa manualmente las cúpulas de hidrogel basadas en ECM pipeteando hacia arriba y hacia abajo de ocho a 12 veces y transfiriendo el contenido de 12 pocillos a un tubo cónico de 15 mililitros. Lave los 12 pocillos vacíos con 250 microlitros de reactivo de disociación celular para asegurarse de que se hayan eliminado todos los enteroides y transfiera el contenido a tubos cónicos de 15 mililitros.Centrifugar los tubos cónicos a 300 g durante cinco minutos a cuatro grados centígrados y desechar el sobrenadante. Agregue 10 mililitros de tampón de lavado DMEM / F-12 helado a los tubos cónicos y suspenda los gránulos enteroides invirtiendo los tubos. Centrifugar a 300 g durante cinco minutos a cuatro grados centígrados y retirar el sobrenadante.Resuspenda los gránulos celulares en 12 mililitros de tripsina-EDTA a 37 grados centígrados y coloque los tubos en un baño de agua de 37 grados centígrados durante 10 minutos o hasta que las células parezcan solubles. Agregue tres mililitros de tampón de lavado DMEM / F-12 a cada tubo para diluir la tripsina-EDTA. Mezclar invirtiendo los tubos y colocar sobre hielo.Filtre los enteroides disociados a través de un filtro de células de malla de 37 micrómetros. Recoja el contenido en tubos cónicos limpios de 15 mililitros y centrifugue los tubos a 300 g durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Retire el sobrenadante de los tubos cónicos y vuelva a suspender los gránulos celulares con seis mililitros de HOMGY.A continuación, retire la placa recubierta de hidrogel a base de ECM de la incubadora y aspire cualquier exceso de solución de hidrogel a base de ECM sin rayar la superficie recubierta ni secar completamente la placa. Agregue 500 microlitros de la suspensión combinada de células HOMGY de 12 mililitros en cada pocillo de la placa de 24 pocillos recubierta con hidrogel a base de ECM. Agite la placa con la tapa puesta para asegurar una distribución uniforme de las células dentro de los pocillos.Incubar la placa a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono, intercambiando medios HOMGY cada dos días hasta que las monocapas alcancen más del 90% de confluencia. Una vez que las monocapas alcancen más del 90% de confluencia, aspire el medio para eliminar cualquier célula que no se adhiera. Tratar las células con 500 microlitros de HA35 o PBS disueltos en HOMGY durante 24 horas.Después de eso, retire el medio sin interrumpir la superficie de la monocapa. Usando una punta de pipeta de 200 microlitros, haga un rasguño lineal en todo el diámetro de la superficie de la monocapa en cada pocillo, teniendo cuidado de no dejar que las monocapas se sequen. Lave las monocapas rayadas una vez con 500 microlitros de 1X PBS y agregue 500 microlitros de HA35 o PBS disueltos en HOMGY.Transfiera la placa al instrumento de análisis de células vivas dentro de una incubadora de 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. En el icono Schedule (Programado) en el software de análisis de células activas, haga clic en el icono Launch Add New Vessel Wizard (Iniciar agregar nuevo recipiente). Seleccione Escanear según lo programado, luego haga clic en Siguiente.Seleccione Nuevo en Crear recipiente y haga clic en Siguiente, luego seleccione Todo bien en Tipo de escaneo y haga clic en Siguiente. Elija Fase para los canales de imagen y 4x para el objetivo. Seleccione el fabricante de la placa y el número de catálogo de la lista proporcionada y haga clic en Siguiente.Seleccione una ubicación de recipiente vacía seguida del patrón de escaneo deseado. Introduzca el nombre de la placa en Nombre y, a continuación, seleccione más para crear un diseño de placa. Seleccione pequeño signo más para crear un nombre de tratamiento.Escriba el nombre corto y, a continuación, OK. Resalte los pocillos de placa correspondientes a ese tratamiento y golpee grande más para designar pozos con ese tratamiento. Introduzca la concentración compuesta y haga clic en Aceptar. Cuando la placa esté completa, seleccione Aceptar, Siguiente. Seleccione Aplazar el análisis hasta más tarde, seguido de Crear nueva programación con escaneos a intervalos de cuatro horas.Deje de escanear en un día, cero horas. Asegúrese de que el resumen sea correcto y, a continuación, agréguelo a la programación. En el software de análisis de células vivas, seleccione Ver en la parte superior de la pantalla.En el menú Nombre del buque, desplácese hasta el análisis de 24 horas completado y haga doble clic en el nombre del buque. Seleccione el icono Exportar imágenes y películas a la izquierda seguido de la opción Como se muestra. Resalte los pozos de interés y, a continuación, seleccione los puntos de tiempo de interés y la serie de imágenes tal como se muestran.Asegúrese de que el tipo de secuencia y los escaneos sean correctos. Seleccione la ubicación de la carpeta de destino deseada. Elija JPEG en el menú desplegable y luego Exportar.Abra el software ImageJ y cargue la imagen del ensayo de la herida por arañazo. Seleccione Imagen y, a continuación, escriba 8 bits para cambiar la imagen de RGB de 24 bits. Seleccione Plugins, Macros, Install, Wound_healing_size plugin para instalar el plugin Wound Healing Size.Después de eso, establezca el radio de la ventana de varianza en 20, el valor del umbral en 100, el porcentaje de píxeles saturados en 0.001. Sí para Establecer escala global y luego haga clic en Aceptar. Verifique que el área delineada sea el área de la herida y repita para rasguños adicionales. Finalmente, calcule el porcentaje de curación de heridas en el área de rasguño de las células migratorias o proliferantes durante 24 horas utilizando la ecuación que se muestra en la pantalla.Aquí, T0 es el área en horas cero y TC es el área en cero horas, cuatro horas, 12 horas o 24 horas. La generación de enteroides y el procedimiento de ensayo de cicatrización de heridas monocapa derivado de enteroides se muestran en estas imágenes. Se utiliza un cultivo de enteroides intestinales de primates tridimensionales no humanos para disociarse en monocapas bidimensionales.Las monocapas se cultivaron a más del 90% de confluencia en una placa de 24 pocillos y luego se trataron con HA35 o PBS durante 24 horas. Las monocapas se rayaron con una punta de pipeta P200. Aquí se muestran las imágenes representativas de HA35 en tratamientos de control de monocapas enteroides de primates no humanos.Las imágenes se obtuvieron a las cero horas, cuatro horas, 12 horas y 24 horas después de realizar un rasguño con una punta de pipeta P200. El efecto de HA35 en las monocapas andoides de cicatrización de heridas se muestra aquí. El cambio en la cicatrización de heridas a lo largo del tiempo en monocapas enteroides depende de la concentración del tratamiento con HA35.HA35 aumentó significativamente la cicatrización de heridas después de cuatro horas y 12 horas a 100 microgramos por mililitro y 200 microgramos por mililitro en comparación con el control, pero las tasas de curación convergieron entre los tratamientos en 24 horas. Una de las cosas más importantes para recordar con este procedimiento es que las monocapas enteroides intestinales son de corta duración. Por lo tanto, una vez que son 90% confluidos, los investigadores deben buscar usarlos rápidamente.Esta técnica se ha convertido en nuestro modelo de referencia para la regeneración intestinal prematura in vitro, especialmente si estamos interesados en una lesión más mecánica que inflamatoria.

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Este video demuestra el desarrollo de la enfermedad de enterocolitis necrotizante en un modelo de enteroide neonatal derivado de humanos inducido por el tratamiento con lipopolisacáridos. Este modelo ayuda a estudiar la fisiopatología intestinal.

Inducción de enterocolitis necrotizante en modelo enteroide epitelial humano

Este protocolo describe la medición de la permeabilidad de la barrera epitelial en el tratamiento farmacológico siguiente en tiempo real en humanos organitas intestinal mediante microscopía fluorescente y vivo microscopia celular.

Medición en tiempo real de la permeabilidad de la barrera epitelial en organoides Intestinal humano

Enteroids se perfila como un modelo novedoso en el estudio de las enfermedades humanas. El protocolo describe cómo simular un modelo enteroide de enterocolitis necrosante humana tratamiento de lipopolisacárido (LPS) de enteroids generados a partir de tejido neonatal. Enteroids recogidos demuestran cambios inflamatorios similares a los observados en humana enterocolitis necrotizante.

Un modelo de enteroide epitelial humano novedoso de Enterocolitis necrosante

Los organoides intestinales derivados de células madre pluripotentes inducidas por humanos (hiPSC) ofrecen oportunidades emocionantes para modelar enfermedades entérica in vitro. Demostramos la diferenciación de los hiPSCs en los organoides intestinales (iHOs), la estimulación de estos iHOs con citoquinas, y la microinyección de Salmonella typhimurium en el lumen IHO, permitiendo el estudio de una invasión epitelial por este Patógeno.

Usando organoides intestinales derivados de células madre pluripotentes inducidos por humanos para estudiar y modificar la protección de células epiteliales contra Salmonella y otros patógenos

Aquí, describimos la preparación de monocapas epiteliales intestinales derivadas de organoides humanos para estudiar la función de barrera intestinal, la permeabilidad y el transporte. Como los organoides representan la respuesta original del tejido epitelial a los estímulos externos, estos modelos combinan las ventajas de la capacidad de expansión de las líneas celulares y la relevancia y complejidad del tejido primario.

Monocapa epitelial derivada de organoides: un modelo in vitro clínicamente relevante para la función de barrera intestinal

Este protocolo describe un modelo apical-out necrotizante enterocolitis (ECN) en un plato que utiliza enteroides del intestino delgado con polaridad invertida, lo que permite el acceso a la superficie apical. Proporcionamos un protocolo de tinción inmunofluorescente para detectar la disrupción epitelial relacionada con NEC y un método para determinar la viabilidad de enteroides apicales sometidos al protocolo NEC en un plato.

In vitro Modelo enteroide apical de enterocolitis necrosante

Este protocolo detalla el establecimiento de enteroides, un modelo intestinal tridimensional, a partir del tejido intestinal fetal. Se utilizaron imágenes inmunofluorescentes de biomarcadores epiteliales para la caracterización del modelo. La exposición apical de lipopolisacáridos, una endotoxina bacteriana, mediante la técnica de microinyección indujo la permeabilidad epitelial de una manera dependiente de la dosis medida por la fuga de dextrano fluorescente.

Prueba de permeabilidad epitelial en enteroides derivados de tejido fetal

Aquí describimos la construcción de un sistema modelo básico tridimensional (3D) de líneas celulares intestinales y un protocolo de inclusión de parafina para la evaluación microscópica óptica de equivalentes intestinales fijos. La tinción de proteínas seleccionadas permite el análisis de múltiples parámetros visuales de un solo experimento para su uso potencial en estudios preclínicos de detección de fármacos.

Sistema Modelo Intestinal Tridimensional Básico (3D) con un Componente Inmune

Este protocolo describe un modelo in vitro de enterocolitis necrotizante (ECN), que puede utilizarse para estudios mecanicistas de patogénesis de la enfermedad. Cuenta con un chip microfluídico sembrado con enteroides intestinales derivados del intestino neonatal humano, células endoteliales y el microbioma intestinal de un neonato con ECN grave.

Modelo microfluídico de enterocolitis necrotizante que incorpora enteroides, enteroides, intestinos neonatales humanos y un microbioma disbiótico

Este protocolo tiene como objetivo evaluar péptidos biofuncionales autoensamblables para la adhesión celular, la morfología de organoides y la expresión génica mediante inmunotinción. Utilizaremos una línea celular de cáncer colorrectal para proporcionar una forma rentable de obtener organoides para pruebas intensivas.

Fabricación y caracterización de organoides de cáncer colorrectal de la línea celular SW1222 en matriz de péptidos autoensamblables ultracortos

Este estudio presenta un protocolo para la generación de monocapas 2D intestinales bovinas a partir de organoides, ofreciendo un mejor acceso para el estudio de las interacciones huésped-patógeno. Incluye métodos para evaluar la integridad y funcionalidad de la membrana, avanzando en modelos in vitro que imitan la fisiología gastrointestinal del ganado. Este enfoque promete importantes beneficios biomédicos y agrícolas, incluidas estrategias de tratamiento mejoradas.

Avances en la tecnología de organoides bovinos mediante interfaces monocapa de intestino delgado y grueso

Aprende el ensayo de herida por arañazo en monocapas derivadas de enteroides para estudiar la regeneración intestinal prematura. Este método permite visualizar el cierre de heridas en tiempo real usando células del intestino delgado.

Efecto del ácido hialurónico 35 kDa en un modelo in vitro de lesión prematura del intestino delgado y curación utilizando monocapas derivadas de enteroides (Video) | JoVE Journal

Efecto del ácido hialurónico 35 kDa en un modelo in vitro de lesión prematura del intestino delgado y curación utilizando monocapas derivadas de enteroides

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