De alta resolución de medición del comportamiento de olor-Driven en larvas de Drosophila

Hola, mi nombre es Matt Lui. Soy investigador posdoctoral en el laboratorio de Leslie Sal en la Universidad Rockefeller. Y hoy me gustaría contarles sobre los experimentos que hemos estado realizando para estudiar la quimiotaxis larval.

El problema en el que estamos interesados es bastante sencillo. De hecho, está representado aquí en este montaje. Acabo de transferir un grupo de larvas de Joseph a esta superficie de agros.

Este ambiente es bastante hostil y los animales están al borde de la inanición. De algún modo, estos animales tendrán que encontrar el camino hacia la fuente de alimento más cercana, y aquí hay un olor proveniente de un plátano que atraerá a las larvas. Este ambiente no es ideal para estudiar el comportamiento de quimiotaxis, por lo que la primera mejora consistirá en reemplazar el plátano por una sustancia química.

Este producto químico es el acetato de isoamilo y es uno de los compuestos aromáticos predominantes en el plátano. Por lo tanto, este es nuestro aroma artificial y, al usarlo, tenemos un control mucho mejor del estímulo olfativo. La siguiente mejora consiste en utilizar un entorno cerrado e intentar de este modo prevenir las fluctuaciones en la distribución del olor.

Así que aquí está el ensayo que hemos estado utilizando en el laboratorio durante bastante tiempo. Este es un plato de Petri con una superficie de agarro en el fondo. El agarro es ideal para que las larvas realicen quimioataques porque las mantiene hidratadas.

En los dos lados de la placa, encontrará otra tapa hecha de teflón y lo que vamos a hacer ahora es introducir acetato de isamilo en un lado y nada en el otro lado. Una vez hecho esto, la idea consiste en cerrar la placa de Petri, esperar un breve tiempo para que el isamilo se difunda, y luego abrir la placa. Introduzca un animal aquí y dejamos que el animal se mueva durante un período de tiempo determinado.

Este ensayo se basa en la suposición de que al introducir el teodor en un lado del recipiente, se establece rápidamente un gradiente que permanecerá estable durante el período de la prueba. Ahora bien, el principal problema es que nadie ha demostrado jamás que el gradiente exista en la placa. Podría ser perfectamente que, muy poco tiempo después de la adición del teodor, se produzca una distribución homogénea del teodor en toda la placa, de tal manera que el gradiente sería muy poco pronunciado, o bien podría suceder que se requieran varios minutos para que el gradiente se establezca.

Esto dependerá, por supuesto, principalmente de la presión de vapor del teodor que se esté utilizando. El segundo aspecto está relacionado con lo que se cuantifica durante el experimento. Imagine que un animal parte de aquí, la X, y después de tres minutos se encuentra en esta placa final, la X roja. Ahora existen dos enfoques posibles.

Una cosa que puede hacerse es registrar únicamente la posición final del animal tras un determinado período de tiempo, tres o cinco minutos. Entonces, la única información que se obtendría sería la posición inicial y final, y consideramos que es importante disponer de una buena resolución sobre el comportamiento del animal a lo largo del tiempo. Por ejemplo, un animal podría haberse desplazado muy poco desde la posición inicial hasta la final, como aquí, o podría haber visitado ampliamente la región que rodea a theodor durante una parte significativa del tiempo y regresar antes del final del ensayo.

La conclusión que extraeríamos de estas dos situaciones es muy diferente. En un caso, el animal puede no haber respondido al estímulo, mientras que en el otro caso ciertamente lo ha hecho. Las dos mejoras que intentamos lograr son, en primer lugar, controlar la forma y la estabilidad del otro gradiente en la arena.

En segundo lugar, rastree el comportamiento del animal en tiempo real y guarde toda esta información. En la siguiente secuencia, Sylvia les mostrará cómo preparamos la dilución en orden. Mi nombre es S ti.

Soy un ayudante de investigación en el laboratorio de VAs, trabajando con el material lui. Hoy les mostraré cómo preparar los materiales para el sistema de cámara que utilizamos para rastrear animales. El problema principal con nuestro sistema de cámara es que estamos utilizando olores dispersos en el aire.

Esto significa que, por ejemplo, si las placas de agros que utilizamos no están planas, podrían presentarse fluctuaciones y variaciones de concentración entre experimentos, lo cual introduciría ruido en el sistema. Por ello, les mostraré y daré algunos consejos prácticos para intentar reducir el ruido en el sistema. Los materiales necesarios para preparar la dilución del olor son un frasco de vidrio, preferiblemente de vidrio oscuro en caso de que esté utilizando olores reactivos a la luz, junto con una alícuota del olor de interés.

Pipetas de vidrio para preparar esta alícuota y un pipeteador mecánico adecuado. Luego puntas de pipeta con aceite de parafina, su pipeteador estándar y viales pequeños para la dilución. Una vez más, estos deben ser de vidrio y preferiblemente oscurecidos, y luego una balanza para realizar mediciones precisas y reducir el ruido entre experimentos.

Dado que los olores son altamente volátiles y algunos de ellos son tóxicos, se manipulan dentro de una campana. El primer paso para preparar una dilución de olor es alícuotar el olor que se va a diluir. Para preparar diluciones precisas y minimizar la variación entre experimentos, es necesario pesar todos los componentes.

Entonces, comience por etiquetar y preparar una concentración de un molar de butirato de etilo. Primero, prepare el aceite de parafina. El aceite de parafina es muy viscoso, por lo que es importante tratar de sumergir la punta de la pipeta lo menos posible en el aceite de parafina, solo lo suficiente para poder aspirar el aceite sin generar burbujas.

Luego es recomendable eliminar el exceso de aceite de parafina en el costado del frasco. Nuevamente, debido a que el aceite de parafina es viscoso, es muy importante dejarlo salir lentamente hacia el vial. Una vez que haya pipeteado el aceite de parafina en su frasco, no deseche la punta inmediatamente porque más líquido se acumulará en la parte inferior de la punta.

Es recomendable preparar una hoja de cálculos antes de comenzar a diluir, en la que ya haya medido el volumen de aceite de parafina que va a añadir, así como el peso, y hacer lo mismo con su olor, incluyendo también el peso. De esta manera, puede verificar en la balanza todo el aceite de parafina que necesita y todo el olor también. Si es necesario, vierta más aceite de parafina y vuelva a medir hasta obtener el peso correcto.

Una vez que tenga el peso correcto del aceite para ojos, todo lo que necesita hacer es agregar el odorizante utilizando los mismos principios. Muy bien. Aquí voy a mostrar cómo preparar las larvas para el seguimiento.

Normalmente utilizamos larvas de seis días de edad. Hacemos esto porque son lo suficientemente grandes como para que nuestro software las detecte fácilmente, y además aún son muy activas. Para determinar si las larvas son demasiado viejas para su uso en el seguimiento, simplemente debe verificar si hay larvas trepando por las paredes. Si hay larvas trepando por la pared, entonces son demasiado viejas y no serán particularmente activas.

El primer paso para preparar sus larvas consiste en sumergirlas en sacarosa al 15%. La razón por la que utilizamos sacarosa al 15% es que las larvas flotarán en esta solución, mientras que el alimento se disolverá parcialmente en ella o caerá al fondo. Vierta suficiente sacarosa como para que quede aproximadamente, digamos, un poco menos de una pulgada desde la parte superior de su frasco o vial.

Luego tome una espátula. Ya puede ver las larvas flotando hacia arriba; suavemente, introduzca la espátula en el alimento para desalojar cualquier animal que esté cavando dentro de él, remueva un poco para separarlas del alimento y luego deje reposar durante unos minutos. Una vez que el alimento y las larvas se hayan separado adecuadamente, tome una placa de Petri previamente etiquetada y viértalos en la parte receptora.

Mantenga la tapa de la placa de Petri, ya que la llenará con agua y la usará como recipiente para las larvas rastreadas, de modo que pueda separar cuáles ya ha rastreado y cuáles no. Ahora que ha vertido las larvas en la placa de Petri, debe esperar 30 minutos para que se adapten a la sacarosa y alcancen un estado de inanición. Esto significa que se comportarán mejor en el montaje de rastreo durante los 30 minutos que las larvas se están adaptando.

El azúcar es un buen momento para preparar las placas para el seguimiento. Estas son las tapas de placas de 96 pocillos. Se pueden comprar por separado, y esta es una solución de agar al 3 % que ya ha sido calentada.

Utilizamos un 3% porque evita que las larvas excaven, pero también es lo suficientemente denso como para que puedan caminar sobre él y permanecer humedecidas en la parte superior de cada placa. Debe pipetearse 25 mililitros de agros. Es importante tratar de evitar la formación de burbujas grandes en el gel.

También es importante colocar las placas sobre una superficie plana, de lo contrario podrían obtenerse geles inclinados que afecten el comportamiento de las larvas. Una vez que el gel ha solidificado, apilamos las tapas y las envolvemos con film transparente para evitar que se sequen. Esto debería mantenerlas en buen estado para su seguimiento durante varios días.

En esta secuencia, les presentaré nuestro ensayo conductual, que difiere ligeramente del ensayo en placa de Petri del que les hablé anteriormente. Lo que necesitarán son placas de 96 pocillos, así como aquellas que contienen la capa de agar. Los ensayos constan de tres tapas, que se apilan unas encima de otras.

El primer labio no contiene nada, está vacío y solo se utiliza para aislar el sistema de la superficie sobre la cual descansa. La segunda capa contiene la superficie de agaro Diego. Aquí se colocarán los animales sobre la superficie y, como les mostraré a continuación, introduciremos teodor en la placa.

Es importante utilizar una tapa nueva y fresca cada vez que cargue el theodor. Esto previene cualquier contaminación entre un experimento y otro. También necesitará otra dilución.

Normalmente no usamos un colorante para cargar theodor, pero aquí lo utilizaré por motivos ilustrativos. Esta es una alta concentración de theodor. Mientras que esta otra está muy diluida, mi objetivo será crear un gradiente a lo largo de una línea.

Diga esta frase y deseamos tener una concentración que aumente de izquierda a derecha. Para lograrlo, utilizaré varias gotas ordenadas colocadas en el anillo de condensación con concentraciones crecientes. Comienzo con la concentración más alta, que se colocará en el extremo.

Es importante dispersarlo en el anillo. Ahora procedo con la siguiente concentración, que está diluida dos veces en comparación con la primera, y la coloco en este anillo. Entonces no, tengo seis gotas.

La primera contiene una concentración, digamos, de uno. La segunda tiene una concentración de 0,5, la mitad que la primera. La tercera tiene una concentración de 0,25, y así sucesivamente.

Entonces, tenemos una serie geométrica a lo largo de la línea. El siguiente paso consiste en invertir esta tapa sobre la superficie de AAL y, ahora por tensión superficial, todas las gotas permanecen suspendidas en la parte superior de la tapa. Diseñamos una técnica basada en espectroscopía infrarroja para medir toda la concentración en la placa.

Al aplicar esta técnica, pudimos demostrar que si se tiene una serie geométrica a lo largo de la línea de desodorante aquí, se obtiene una concentración de teodor a lo largo de la longitud que aumenta exponencialmente, como se muestra aquí, y a lo ancho de la placa. Tenemos un perfil que alcanza su máximo justo debajo de la línea de odorante. Así es como se ve la geometría real del gradiente.

Si se considera la concentración de teodor en el aire, lo positivo es que pudimos demostrar que el gradiente y su geometría son estables durante al menos 15 minutos. Tras la colocación de la tapa superior, esperamos 30 segundos para permitir que se establezca el gradiente. Luego introducimos el animal en la arena.

El animal se introduce bajo la otra línea terminal entre la posición tres y cuatro; utilizamos un alfiler pequeño para transferir las larvas desde la solución de sacarosa hasta la superficie de agar. La transferencia se realiza atrapando una larva alrededor de la cabeza del alfiler. Abrimos rápidamente la tapa y se deposita la larva sobre la superficie del agar.

Luego cerramos la tapa. Es importante minimizar el tiempo que la tapa permanece abierta. A continuación, registre el movimiento del animal durante tres o cinco minutos.

Se realiza la grabación real. Con esta configuración de seguimiento, contamos con una cámara conectada a una computadora. El software de seguimiento de imágenes que estamos utilizando es Aton Vision de Nordis para recopilar la información sobre el movimiento del animal y almacenarla como un archivo digital.

Ahora estamos a punto de comenzar el experimento conductual. Tenemos la tapa con la capa de aro. Tenemos las diluciones.

Diego está atascado en la primera tapa. Antes de cargar theodor, es importante vortexar cada vial. Usamos nuestra dilución con la más pequeña a la izquierda y la más alta aquí a la derecha.

Las seis gotas se cargarán en la placa al mismo tiempo. Para evitar la pérdida de olor, estamos utilizando aquí un pipetador multicanal de seis puntas; se toman 10 microlitros del olor de cada muestra de dilución, y el olor se carga simultáneamente. Tras la carga, la tapa se invierte ahora sobre la superficie del agar.

El gradiente se ha creado en la placa durante los últimos 30 segundos, como les mostré anteriormente. Ahora voy a introducir un animal en la superficie de Diego. En cuanto se introduce el animal, comienzo la grabación.

El animal está aquí y actualmente se está rastreando su movimiento. Como puede observarse, el animal está siguiendo la línea del odorífero y se dirige hacia el punto de mayor concentración del gradiente. Recuerde que la concentración aumenta de izquierda a derecha con una forma exponencial.

Como puede observarse, la dirección del movimiento se corrige constantemente. Con respecto al estímulo, el animal ha alcanzado ahora el punto de mayor concentración del gradiente, y lo retiramos de la placa. El animal se descarta en otra placa para asegurarnos de no rastrear al mismo individuo dos veces consecutivas.

Después de introducir una nueva larva e iniciar una nueva grabación, estas son las reglas que seguimos para el seguimiento. Detenemos el seguimiento tan pronto como el animal alcance la fila de mayor concentración de la placa, que corresponde a esta, esta aquí. Además, si un animal choca contra la pared, el seguimiento se interrumpe porque deseamos evitar cualquier interferencia.

La primera pregunta que abordamos fue bastante sencilla. Lo que queríamos saber era si un animal podía oler el teodor en una concentración determinada. Para realizar dicha prueba, lo que normalmente hacemos es utilizar una única fuente de olor en lugar de varias.

Esto le permite tener un grado de libertad para cambiar la concentración en la gota final de Theodor. Por ejemplo, aquí tiene una gota de alta concentración y aquí tiene una gota de baja concentración. Lo que normalmente hacemos es introducir el animal en la superficie de Diego justo debajo de la gota de Theodor y observar si el animal es capaz de detectar su presencia y permanecer en su vecindad.

Ahora me gustaría hacer un uso más avanzado de nuestro ensayo. Imagine que tiene una gota de orden y registra varias trayectorias que se superponen aquí, y tiene tres de ellas. Tiene un individuo que genera esta trayectoria verde.

Tiene esta pista naranja que está menos centrada, y luego tiene esta trayectoria rosa que representa a un animal que aparentemente da vueltas alrededor de la fuente. Creemos que hay mucha información por obtener sobre los detalles de las trayectorias. Por esta razón, importamos la trayectoria como una serie de posiciones en matlab, y realizamos el análisis tras el análisis con matlab.

Aquí se muestra la distancia hasta la fuente, probablemente como una función del tiempo. Para las tres trayectorias que se mostraron previamente, se tiene la trayectoria verde, que permanece muy cercana a la fuente. Se tiene la trayectoria naranja, que presenta significativamente más ruido.

Luego se observa esta trayectoria púrpura, que curiosamente mostró que el animal abandonó la fuente para mantenerse a una distancia, lo que probablemente correspondió a una concentración que era óptima. Aquí se muestra la ilustración de 10 trayectorias, animales que son incapaces de oler. Estos son mutantes o mutantes tres B, que son no olfativos.

Y como puede observarse, todas estas trayectorias ilustran que los animales no lograron detectar la fuente del olor y simplemente la abandonaron. Ahora bien, en marcado contraste, registramos aquí 10 trayectorias consecutivas de animales con grifo blanco. Estos animales, por supuesto, son capaces de oler, y como puede verse, todos ellos se acumulan justo debajo de la fuente del desodorante.

Las 20 trayectorias, que acaban de presentarse, se obtuvieron en realidad sin conocer la identidad de los animales. Esto demuestra la eficiencia y fiabilidad de nuestro ensayo. Al determinar si algunos Mutantes son capaces de oler aquí utilizando un gradiente exponencial, generamos varias trayectorias y deseamos tener una idea de qué tan bien los animales son capaces de seguir el estímulo del otro extremo.

Así que ahora les voy a mostrar 15 trayectorias registradas por separado, y como pueden ver, los animales realizan un excelente trabajo siguiendo el estímulo bajo la línea del extremo opuesto. Ahora nos gustaría continuar con un control sencillo. Es muy posible que los animales en el gradiente exponencial hayan seguido la línea porque había algún estímulo independientemente de su concentración, simplemente los animales avanzaron en línea recta.

Por lo tanto, con el fin de demostrar que efectivamente están calculando la concentración o algo relacionado con la concentración y utilizando esta información para dirigir su movimiento, ahora contamos con esta geometría, que es similar a un techo a dos aguas. La larva se introduce aquí como de costumbre, y lo que esperamos es que se desplacen a lo largo de la línea y luego detecten que la concentración disminuye después de este punto y regresen hacia él. Así, realizamos la prueba con cinco animales.

Recopilamos las trayectorias y ahora las estamos representando superpuestas en esta diapositiva. Como puede observarse, los animales partieron desde aquí, avanzaron a lo largo de la línea, luego exploraron la región correspondiente a la mayor concentración y principalmente permanecieron allí. Esto sugiere firmemente que son capaces de calcular otras concentraciones en tiempo real utilizando el ensayo de fuente única.

Pudimos plantear principalmente una gran pregunta. ¿Puede un animal detectar un olor a una concentración determinada utilizando un dispositivo de múltiples fuentes? Esto nos brinda mayor flexibilidad para modificar la forma del gradiente y determinar si el animal es capaz de aprovechar esta información.

Me gustaría ilustrar esta idea realizando un experimento sencillo. En los gradientes que hemos establecido hasta ahora, teníamos una forma exponencial a lo largo de la lente. Ahora surge la pregunta: si desafiamos más a las células al tener una concentración que aumenta linealmente a lo largo de la lente, ¿seguirán siendo capaces de encontrar su camino hacia el otro extremo?

Este gráfico representa los dos tipos de gradiente. Probamos el gradiente exponencial en color morado y el gradiente lineal en verde. Este es el gradiente lineal, y voy a escribir las diferentes concentraciones de acetato de isam diluyendo aceite entre paréntesis.

Esta es una serie aritmética. Tenemos un gradiente lineal que se establecerá y, como se puede observar, la pendiente es bastante suave en comparación con el gradiente exponencial aquí, donde la concentración en los extremos también es 0,5, pero aumenta hasta 0,03. La pregunta es: ¿pueden los navi realizar ataques quimiotácticos cuando se enfrentan a un gradiente tan poco pronunciado?

Aquí, la concentración real de acetato utilizada en las seis gotas para el gradiente exponencial y para el gradiente lineal. Como puede observarse, aunque la concentración más alta es la misma en ambos casos para el gradiente lineal, la concentración más baja aquí es bastante elevada. Realizamos el experimento con el gradiente lineal, y aquí se representan 15 trayectorias de animales de tipo salvaje, y creemos que es bastante claro que estos animales fueron capaces de detectar el gradiente lineal y seguir esta señal a lo largo de la línea de desodorante.

Así que creo que nuestro punto está claro. Antes de terminar aquí, me gustaría hablar brevemente sobre las direcciones futuras para este sistema de seguimiento. Aunque esta configuración de seguimiento permite realizar muchas cosas interesantes, por ejemplo, observar comportamientos complejos en larvas durante un período más largo y en un espacio mayor, tiene algunas limitaciones.

Por ejemplo, está limitado al tamaño de su placa, lo que limita el tiempo durante el cual puede realizar el seguimiento y los comportamientos complejos que puede observar. Por lo tanto, sería conveniente poder desarrollar un sistema en el que la placa sea más grande o en el que no esté limitado por los bordes de una placa en absoluto. Otro problema es que con el software que tenemos actualmente, resulta difícil rastrear más de un animal al mismo tiempo, por lo que no es posible observar los comportamientos de la población en tiempo real.

Otro aspecto interesante del comportamiento que no podemos probar mediante este montaje es el movimiento tridimensional real de las larvas en el espacio. A medida que rastrea los animales, verá que, por ejemplo, cuando llegan a una gota de olor, podrían levantar la cabeza o moverla de un lado a otro intentando detectar cambios en la concentración. Posiblemente esto no sea posible con nuestro montaje particular en este momento, por lo que sería conveniente desarrollar algo que nos permitiera hacerlo.