De alta resolución de medición del comportamiento de olor-Driven en larvas de Drosophila

Hola, mi nombre es Matt Lui. Soy becario postdoctoral en el laboratorio de Leslie Sal en la Universidad Rockefeller. Y hoy me gustaría hablaros de los experimentos que hemos estado haciendo para estudiar la quimiotaxis de las larvas.

El problema que nos interesa es bastante simple. De hecho, está representado aquí en esta configuración. Acabo de trasladar un grupo de larvas de Joseph en esta superficie de agros.

Este ambiente es bastante hostil y están a punto de morir de hambre. De alguna manera, estos animales necesitarán encontrar su camino hacia la fuente de alimento más cercana y aquí hay un olor que emite plátano que atraerá a las larvas. Este ambiente no es el ideal para estudiar el comportamiento de la quimiotaxis, por lo que la primera mejora será reemplazar el plátano por un producto químico.

Este producto químico es el acetato iso y es uno de los sabores que predomina en el plátano. Así que este es nuestro sabor artificial y al usarlo tenemos un control mucho mejor del estímulo olfativo. La siguiente mejora es utilizar un entorno cerrado y tratar de prevenir de tal manera la fluctuación en la otra distribución.

Así que aquí está el ensayo que hemos estado usando en el laboratorio durante bastante tiempo. Se trata de una placa de Petri con una superficie de agarro en la parte inferior. El agarro es ideal para los ataques de larvas a la quimioterapia porque las mantiene hidratadas.

En los dos lados de la placa, encuentras otra tapa que está hecha de teflón y lo que vamos a hacer ahora es introducir acetato o isam en un lado y no order en el otro lado. Una vez hecho esto, la idea es cerrar la placa de petro, esperar un poco de tiempo para que elolor se difunda y luego abrir la placa. Introducimos un animal aquí, y dejamos que el animal se mueva durante un cierto período de tiempo.

Este ensayo se basa en la suposición de que al introducir el olor en un lado del plato, tenemos un gradiente que se establece con bastante rapidez y permanecerá estable durante el período de la prueba. Ahora bien, el principal problema es que nadie ha demostrado nunca que el gradiente exista en la placa. Podría muy bien ser que muy rápidamente después de la adición del olor, tenga una distribución homogénea del olor en la placa de tal manera que el gradiente sería muy superficial o podría ser que se requieran varios minutos para que se establezca el gradiente.

Esto, por supuesto, dependerá principalmente de la presión de vapor del olor que se esté utilizando. La segunda cuestión está relacionada con lo que se cuantifica durante el experimento. Imaginemos que un animal parte de aquí, la X y después de tres minutos se encuentra en esta placa final, la X roja. Ahora bien, hay dos enfoques posibles.

Una cosa que puedes hacer es registrar la posición final del animal solo después de un cierto período de tiempo, tres o cinco minutos. Entonces la única información que capturarías es la posición de salida y, creemos que es importante tener una buena resolución sobre el comportamiento del animal a lo largo del tiempo. Por ejemplo, un animal difícilmente podría haberse movido de la posición inicial a la posición final, como aquí, o podría muy bien haber visitado la región que rodea al olor durante una parte significativa del tiempo y devolverlo antes del final de la prueba.

La conclusión que sacaríamos de estas dos situaciones es muy diferente. En un caso, es posible que el animal no haya respondido al estímulo, mientras que en el otro caso sí lo ha hecho. Las dos mejoras que intentamos lograr son, en primer lugar, controlar la forma y la estabilidad del otro degradado en la arena.

En segundo lugar, rastrear el comportamiento del animal en tiempo real y guardar toda esta información. En la siguiente secuencia, Sylvia le presentará cómo preparamos la dilución de pedidos. Mi nombre es S ti.

Soy asistente de investigación en el laboratorio de VA trabajando para material lui. Hoy os voy a enseñar cómo preparar los materiales para el sistema de cámaras que utilizamos para el seguimiento de los animales. El problema principal con nuestro sistema de cámaras es que estamos usando el olor disperso en el aire.

Esto significa que, por ejemplo, si las placas agrícolas que utilizamos no son planas, es posible que se produzcan fluctuaciones y concentración entre experimentos, lo que introducirá ruido en el sistema. Así que te mostraré y te daré pequeños consejos para intentar reducir el ruido en el sistema. Por lo tanto, los materiales para preparar la dilución de olores son un frasco de vidrio, preferiblemente vidrio oscurecido en caso de que esté utilizando olores reactivos ligeros con una alícuota del olor que le interesa.

Pipetas de vidrio para preparar esta alícuota y una ayuda mecánica de pipeta adecuada. A continuación, las puntas de pipeta de aceite de parafina, el pipetero estándar y pequeños viales para la dilución. Una vez más, estos deben ser de vidrio y preferiblemente oscurecidos y luego una báscula para hacer mediciones precisas y reducir el ruido entre experimentos.

Dado que los olores son altamente volátiles y algunos de ellos son tóxicos, se hacen dentro de una capucha. El primer paso para reparar una dilución de olor es alícuota el olor que vas a diluir. Para preparar diluciones precisas y minimizar la variación entre experimentos, es necesario pesar todo.

Así que comience por etiquetar, haciendo una concentración de un molar de butirato de etilo. Primero, preparas el aceite de parafina. El aceite de parafina es muy viscoso, por lo que es importante tratar de sumergir la punta de la pipeta lo menos posible en el aceite de parafina, lo suficiente para poder aspirar el aceite de parafina sin generar burbujas.

Luego, es bueno limpiar el aceite de paren extra en el costado de la botella. Una vez más, debido a que el aceite de paren es viscoso, es muy importante dejarlo salir lentamente en el vial. Una vez que hayas pipeteado el aceite para en la botella, no tires la punta inmediatamente porque se acumulará más en la parte inferior de la punta.

Es bueno preparar una hoja de cálculos antes de comenzar a diluir donde ya haya medido el volumen de aceite de paren que va a agregar y también el peso, y luego haga lo mismo con su olor con también el peso. De esa manera puedes comprobar en la báscula que tienes, todo el aceite de parafina que necesitas y todo el olor también. Si es necesario, vierta más aceite de paren y vuelva a medir hasta que tenga el peso correcto.

Una vez que tenga el peso correcto del aceite de paren, todo lo que necesita hacer es agregar odorante usando los mismos principios. Muy bien. Aquí voy a mostrar cómo preparar las larvas para el seguimiento.

Por lo general, usamos larvas que tienen seis días de edad. Hacemos esto porque son lo suficientemente grandes como para que nuestro software las recoja fácilmente y también siguen siendo muy activas para saber si sus larvas son demasiado viejas para usarlas en el seguimiento, solo tiene que verificar si hay larvas trepando por las paredes. Si hay larvas trepando por la pared, entonces son demasiado viejas y no serán particularmente activas.

El primer paso para preparar las larvas es sumergirlas en sacarosa al 15%. La razón por la que usamos 15% de sacarosa es que las larvas serán Boyd en esta solución y el alimento se disolverá parcialmente en ella o caerá hasta el fondo. Viertes suficiente sacarosa para que quede, sé, a un poco menos de una pulgada de la parte superior de tu botella o frasco.

Luego tomas una espátula. Ya puedes ver las larvas flotando y cavas suavemente en la comida para desalojar a los animales que están cavando en la comida, gírala un poco para separarla de la comida y luego simplemente siéntala durante un par de minutos. Una vez que la comida y las larvas se hayan separado adecuadamente, tome una placa de Petri preetiquetada y viértalas en la parte del beeper.

Mantenga la parte superior de la placa de Petri, ya que la llenará con agua y la usará como receptáculo para las larvas rastreadas para que pueda separar las que ha rastreado y las que no. Ahora que has vertido las larvas en la placa de Petri, tienes que esperar 30 minutos para que se adapten a la sacarosa y alcancen un estado de inanición. Esto significa que se comportarán mejor en la configuración de seguimiento durante los 30 minutos a los que se está adaptando la larva.

La sacarosa es un buen momento para preparar las placas para el seguimiento. Así que estas son las tapas de las placas de 96 pocillos. Puedes comprarlos por separado y esta es una solución 3%aros que ya se ha calentado.

Usamos 3% porque evita que las larvas caven, pero también es lo suficientemente denso como para que puedan caminar sobre él y permanecer húmedas en la parte superior de cada placa. Desea pipetear 25 milésimas de pulgada de agros. Es importante tratar de evitar la formación de burbujas grandes en el gel.

También es importante colocar las placas sobre una superficie plana, de lo contrario se pueden producir geles que se encuentran en una pendiente y pueden afectar el comportamiento de las larvas. Una vez que los aros se hayan endurecido, apilamos las tapas y las envolvemos en una envoltura de soran para evitar que se sequen. Esto debería mantenerlos en un buen estado para el seguimiento durante varios días.

En esta secuencia, voy a presentarles nuestro ensayo de comportamiento, que difiere ligeramente del ensayo del plato de gasolina, del que les hablé anteriormente. Lo que necesitará son cables de placas de 96 pocillos, así como aquellos que contengan la capa de agro. Los ensayos se componen de tres tapas, que se apilan.

El primer labio no contiene nada, está vacío y solo se utiliza para aislar el sistema de la superficie sobre la que se encuentra. La segunda capa contiene la superficie Diego agro. Aquí se colocarán los animales en la superficie y ahora como os mostraré a continuación, introducimos elolor en el plato.

Es importante usar una tapa nueva y nueva cada vez que cargue el olor. Esto es para evitar cualquier contaminación de un experimento a otro. También necesitará otra dilución.

Normalmente no usamos un tinte para cargar elolor, pero aquí lo usaré por el bien de la ilustración. Esta es una alta concentración de olor. Si bien este está muy diluido, mi objetivo será crear un degradado a lo largo de una línea.

Digamos esta línea y queremos que la concentración aumente de izquierda a derecha. Para lograr esto, utilizaré varias gotas de orden colocadas en el anillo de condensación con concentración creciente. Empiezo por la concentración más alta, que se colocará en la extremidad.

Es importante dispersarlo en el anillo. Ahora procedo con la siguiente concentración, que se diluye dos veces en comparación con la primera, y la coloco en este anillo. Así que ahí No, tengo seis gotas.

El primero contiene una concentración de, digamos, uno. La segunda concentración de 0,5, el doble que la primera. El tercero es la concentración, 0,25, y así sucesivamente.

Así que tenemos una serie geométrica a lo largo de la línea. El siguiente paso consiste en invertir este párpado sobre la superficie del AAL y ahora por tensión superficial, todas las gotas quedan suspendidas de la parte superior del párpado. Ideamos una técnica basada en la espectroscopia infrarroja para medir toda la concentración en la placa.

Al aplicar esta técnica, pudimos demostrar que si tienes una serie geométrica a lo largo de la línea del desodorante aquí, terminas con una concentración de olor a lo largo de la longitud que aumenta exponencialmente como se muestra aquí y a lo largo del ancho de la placa. Tenemos un perfil que alcanzó su punto máximo justo debajo de la línea de odorante. Así es como se ve la geometría real del degradado.

Si se tiene en cuenta la concentración delolor en el aire, lo bueno es que pudimos demostrar que el gradiente su geometría es estable durante al menos 15 minutos. Tras la introducción de la tapa superior, esperamos 30 segundos para permitir que se establezca el gradiente. Luego introducimos al animal en la arena.

El animal se introduce por debajo de la otra línea final entre la posición tres y cuatro, utilizamos un pequeño alfiler para transferir las larvas de la solución de sacarosa a la superficie agrícola. La transferencia se realiza pescando una larva alrededor de la cabeza de la uña. Abrimos rápidamente la tapa, la larva se deposita en la superficie del agarro.

Luego cerramos la tapa. Es importante minimizar el tiempo que la tapa permanece abierta. A continuación, se registra el movimiento del animal durante tres o cinco minutos.

Se realiza la grabación real. Con esta configuración de seguimiento, tenemos una cámara que está conectada a una computadora. El software de seguimiento de imágenes que utilizamos es Aton vision de Nordis para recopilar la información sobre el movimiento del animal y almacenarla como un archivo digital.

Ahora estamos a punto de comenzar el experimento conductual. Tenemos la tapa con la capa aro. Tenemos las diluciones.

Diego está atrapado en la primera tapa. Antes de cargar elolor, es importante vórtice cada vial. Usamos nuestra dilución con la más pequeña a la izquierda y la más alta aquí a la derecha.

Las seis gotas se cargarán en la placa al mismo tiempo. Para evitar la pérdida de olor, estamos utilizando aquí un pipeter multicanal de seis inmersiones, se toman 10 microlitros del olor de cada muestra de dilución y el olor se carga al mismo tiempo. Al cargar, la tapa ahora está invertida en la superficie de los agros.

El degradado se ha creado en la placa durante los últimos 30 segundos como te mostré antes. Ahora voy a presentar un animal en la superficie de Diego. Tan pronto como el animal ha sido introducido, comienzo la grabación.

El animal está aquí y ahora se está rastreando su movimiento. Como se puede ver, el animal sigue la línea del odorante y se dirige hacia el punto de concentración más alto del gradiente. Recuerda que la concentración aumenta de izquierda a derecha con una forma exponencial.

Como puede ver, la dirección del movimiento se corrige constantemente. Con respecto al estímulo, el animal ha alcanzado el punto de concentración más alto del gradiente, y lo retiramos de la placa. El animal se descarta en otra placa para asegurarnos de que no rastreamos al mismo individuo dos veces directamente.

Después de introducir una nueva larva y comenzar una nueva grabación, estas son las reglas que seguimos para el seguimiento. Detenemos el seguimiento tan pronto como el animal ha alcanzado la fila de concentración más alta de la placa, que corresponden a esta, esta de aquí. Además, si un animal golpea la pared, el seguimiento se interrumpe porque queremos evitar cualquier interferencia.

La primera pregunta que abordamos fue bastante potable. Lo que queríamos saber era si un animal podía o no oler el olor a una determinada concentración. Para hacer una prueba de este tipo, lo que normalmente hacemos es tener una sola fuente de olor en lugar de tener varias.

Esto le permite tener un grado de libertad para cambiar la concentración en la gota final del olor. Aquí, por ejemplo, tienes una gota de alta concentración, y aquí tienes una gota de baja concentración. Lo que normalmente hacemos es introducir al animal en la superficie de Diego, justo debajo de la gota de Theodor, y ver si el animal es capaz de detectar su presencia y permanecer en su vecindad.

Ahora me gustaría hacer un uso más avanzado de nuestro ensayo. Imagina que tienes una gota de orden y registras varias trayectorias que están superpuestas aquí, y tienes tres de ellas. Hay un individuo que genera esta pista verde.

Tienes esta pista naranja que está menos en el centro, y luego tienes esta trayectoria rosa que representa un animal que aparentemente gira alrededor de la fuente. Creemos que hay mucha información para comenzar sobre los detalles de las trayectorias. Por esta razón, importamos la trayectoria como series de posesión a matlab, y realizamos el análisis después del análisis con matlab.

Aquí está la distancia a la fuente, probablemente en función del tiempo. Para las tres trayectorias que se mostraron anteriormente, tiene la trayectoria verde, que permanece muy cerca de la fuente. Tiene la trayectoria naranja, que muestra significativamente más ruido.

Y luego tienes esta trayectoria púrpura, que curiosamente mostró que el animal abandonó la fuente para mantenerse a una distancia, lo que probablemente correspondía a una concentración que era óptima. Aquí se ve la ilustración de 10 trayectorias, animales que no pueden oler. Se trata de mutantes o tres mutantes B, que son non ellers.

Y como puedes ver, todas estas trayectorias ilustran que los animales no lograron detectar la fuente del olor y simplemente la abandonaron. Ahora, en contraste de estrellas, registramos aquí 10 trayectorias consecutivas para animales de grifo blanco. Estos animales, por supuesto, son capaces de oler y, como puedes ver, todos ellos se acumulan justo debajo de la fuente de desodorante.

Las 20 trayectorias, que se acaban de presentar, fueron adquiridas sin conocer la identidad de los animales. Esto demuestra la eficiencia y fiabilidad de nuestro ensayo. Al determinar si algunos mutantes son capaces o no de oler aquí utilizando un gradiente exponencial, generamos varias pistas y queremos tener una idea de lo bien que los animales son capaces de seguir el otro estímulo final.

Así que voy a mostrarles ahora 15 trayectorias registradas por separado, y como pueden ver, los animales hacen un excelente trabajo al seguir el estímulo debajo de la otra línea terminal. Ahora nos gustaría proceder con un control simple. Es muy posible que los animales en el gradiente exponencial siguieran la línea porque había algún estímulo independientemente de su concentración, simplemente los animales iban en línea recta.

Así que con el fin de mostrar que de hecho están calculando la concentración o algo relacionado con la concentración y haciendo uso de ella para dirigir su movimiento, tenemos ahora esta geometría, que está cerca de un tejado. La larva se introduce aquí como de costumbre, y lo que esperamos es que se mueva a lo largo de la línea y luego detecte que la concentración está bajando a partir de este punto y regrese a ella. Así que realizamos la prueba con cinco animales.

Recogimos las trayectorias, y ahora las estamos representando superpuestas en esta diapositiva. Y como se puede ver, los animales partieron de aquí, se desplazaron a lo largo de la línea, luego exploraron la región correspondiente a la mayor concentración y principalmente se quedaron allí. Esto sugiere fuertemente que son capaces de calcular otras concentraciones en tiempo real utilizando el ensayo de fuente única.

Pudimos hacer principalmente una gran pregunta. ¿Puede un olfato de animal detectar un olor a una determinada concentración mediante el uso de un dispositivo de múltiples fuentes? Tenemos más flexibilidad para cambiar la forma del gradiente y determinar si un animal es capaz o no de hacer uso de esta información.

Me gustaría ilustrar esta idea realizando un experimento sencillo. En los degradados que configuramos hasta ahora, teníamos una forma exponencial a lo largo de la lente. Ahora la pregunta es, si desafiamos más al hacer que la concentración aumente linealmente a lo largo de la lente, ¿todavía pueden encontrar su camino debajo de la otra línea final?

Este gráfico representa los dos tipos de gradiente. Probamos el exponencial en morado y el gradiente lineal en verde. Este es el gradiente lineal, y voy a escribir las diferentes concentraciones de aceite de paren diluyente de acetato de isam.

Se trata de una serie aritmética. Tenemos un gradiente lineal que se establecerá y, como puede ver, la pendiente es bastante poco profunda en comparación con el gradiente exponencial aquí, donde la concentración de las extremidades también es de 0.5, pero sube a 0.03. La pregunta es, ¿son los navi capaces de sufrir ataques de quimioterapia cuando se enfrentan a un gradiente tan superficial?

Aquí, la concentración real de acetato utilizada en las seis gotas para el gradiente exponencial y para el gradiente lineal. Como puede ver, aunque las concentraciones más altas son las mismas en ambos casos para el gradiente lineal, la concentración más baja aquí es bastante alta. Realizamos el experimento con el gradiente lineal, y aquí se representan 15 trayectorias de animales de tipo salvaje, y creemos que está bastante claro que estos animales fueron capaces de detectar el gradiente lineal y seguir esta señal a lo largo de la línea del desodorante.

Por lo tanto, creo que nuestro punto es claro. Antes de terminar aquí, me gustaría hablar brevemente sobre las direcciones futuras para esta configuración de seguimiento. Aunque esta configuración de seguimiento le permite hacer muchas cosas interesantes, por ejemplo, ver el comportamiento complejo de las larvas durante un período de tiempo más largo y más largo, tiene algunas limitaciones.

Por ejemplo, está limitado al tamaño de su plato, por lo que limita el tiempo que puede rastrear y los comportamientos complejos que puede observar. Así que sería bueno si pudiéramos desarrollar un sistema en el que la placa sea más grande o no esté limitado por los límites de una placa en absoluto. Otro problema es que con el software que tenemos ahora mismo, es difícil rastrear a más de un animal al mismo tiempo, por lo que no es posible observar los comportamientos de la población en tiempo real.

Otro aspecto interesante del comportamiento que no podemos probar a través de esta configuración son los movimientos tridimensionales reales de las larvas en el espacio. A medida que rastrea a los animales, verá que, por ejemplo, cuando llegan a una gota de olor, pueden levantar la cabeza o pueden barrer la cabeza tratando de detectar cambios en la concentración. Posiblemente esto no sea posible con nuestra configuración particular en este momento, por lo que sería bueno desarrollar algo que nos permitiera hacer esto.