Preparación de proteómica unicelular para análisis de espectrometría de masas utilizando lisis por congelación y calor y un portador isobárico

SCoPE2 puede cuantificar miles de proteínas de miles de células de mamíferos individuales sin anticuerpos. Este protocolo puede ayudar a descubrir la heterogeneidad del proteoma que de otro modo sería invisible para los análisis masivos. La proteómica de células individuales, utilizando el enfoque SCoPE2, fue diseñada para ser accesible a los investigadores con una gama de recursos, desde solo una pipeta, hasta robótica de manejo de líquidos.

SCoPE2 es ampliamente aplicable a muchas áreas de investigación, incluyendo el cáncer y la inmunología, al proporcionar información sobre cómo las proteínas son diferenciales en abundancia entre células individuales de la misma población. Para comenzar, comience el procedimiento de lisis celular colocando una placa de 384 pocillos con celdas individuales clasificadas en el termociclador, calentándola durante 10 minutos a 90 grados centígrados y luego enfriándola a 12 grados centígrados. Gire la placa brevemente en un hilandero de placa de sobremesa a 18 a 22 grados centígrados.

Sonicar la placa durante cinco minutos en un sonicador de baño de agua a 18 a 22 grados centígrados. Luego, colócalo en hielo. Para proceder con la digestión de tripsina, prepare 100 microlitros de la mezcla maestra y agregue 0.2 microlitros de la mezcla maestra a cada pocillo de la placa de 384 pocillos utilizando un manipulador de líquidos.

Selle la placa, el vórtice durante cinco segundos y gire hacia abajo en un spinner de placa de mesa a 18 a 22 grados centígrados. Caliente la placa de 384 pocillos durante tres horas a 37 grados centígrados con la temperatura de la tapa ajustada a 52 grados centígrados. Para establecer una reacción de etiquetado de masa en tándem, tome las 85 existencias milimolares de etiquetas de masa en tándem del congelador de menos 80 grados centígrados.

Antes de abrirlos, caliente los tubos a temperatura ambiente y diluya las etiquetas a 22 milimoles en acetonitrilo anhidro. Usando esta estrategia de etiquetado, agregue 0.5 microlitros de etiquetas de masa tándem diluidas a cada pocillo de la placa de 384 pocillos, utilizando un robot dispensador de líquidos o una pipeta manual. Selle la placa, el vórtice durante cinco segundos y gire hacia abajo en un spinner de placa de mesa a 18 a 22 grados centígrados.

Deje que la reacción de etiquetado proceda a 18 a 22 grados centígrados durante una hora. Para enfriar la reacción de marcado de masa en tándem, agregue 0.2 microlitros de hidroxilamina al 0.5%, diluida en agua de grado HPLC, a cada pocillo de la placa de 384 pocillos utilizando un manipulador de líquidos. Selle la placa, haga un vórtice durante cinco segundos y gire hacia abajo en un hilandero de placa de sobremesa antes de mantener la placa a 18 a 22 grados centígrados durante 30 minutos.

La preparación del análisis LC-MS se inicia retirando el portador combinado o el material de referencia del congelador de menos 80 grados centígrados. Para cada serie, pipetear un microlitro de portador y material de referencia en el primer pozo, será parte de un solo conjunto. Pipetear el volumen completo desde el primer pozo hasta el pozo siguiente.

Continúe pipeteando el volumen completo de un pozo a otro hasta que todos los pozos incluidos en un solo conjunto se hayan combinado en el pozo final. Para cada juego, agregue cinco microlitros de acetonitrilo al 50% diluido en agua de grado HPLC para el primer pocillo de celda individual que se incluirá en cada conjunto. Pipetear el volumen completo desde el primer pozo hasta el pozo siguiente.

Continuar pipeteando el volumen completo de una celda a la siguiente, hasta que todos los pozos incluidos en un solo conjunto se hayan combinado en el pozo final. Ahora transfiera cada juego a sus insertos de vidrio de muestreador automático. Seque las muestras una vez que todos los juegos estén combinados y colocados en inserciones de vidrio.

Antes del análisis LC-MS-MS, agregue 1.2 microlitros de ácido fórmico al 0.1% a cada conjunto para resuspender los péptidos marcados. Coloque los insertos del muestreador automático en viales de muestreador automático de vidrio y cierre cada muestra con una tapa. Vortex cada vial durante cinco segundos para asegurarse de que la resuspensión esté completa, y luego gire hacia abajo en un spinner de vial a 18 a 22 grados centígrados.

Asegúrese de que cada muestra esté en la parte inferior del inserto en lugar de salpicada en los lados. Coloque los viales en la bandeja del muestreador automático y, para cada serie, inyecte una muestra de un microlitro para el análisis LC-MS-MS. La digestión y la eficiencia de etiquetado de las células individuales pueden no ensayarse directamente como con el portador, pero el software DO-MS proporciona gráficos que estiman la eficiencia de digestión y etiquetado.

La mala digestión está indicada por una alta proporción de la intensidad de los péptidos diferidos a sus contrapartes completamente escindidas. Otro factor a considerar en los conjuntos es la fracción de datos faltantes en la intensidad media del ion reportero en cada canal de etiquetado de masa en tándem. Cuando las células individuales se preparan con éxito, los datos faltantes por celda y el control positivo son mucho menores que las muestras de control negativo.

El manejo cuidadoso del líquido durante la preparación de muestras LC-MS-MS es fundamental para la máxima recuperación de péptidos. Se pueden preparar pequeñas muestras de aproximadamente 100 picogramos a 100 nanogramos por pocillo para el análisis proteómico utilizando un portador isobárico. SCoPE2 hace que las mediciones de proteómica unicelular sean accesibles para investigadores de todo el mundo utilizando solo reactivos comunes y equipos disponibles comercialmente.

Es susceptible de procesamiento manual o automatización de alto rendimiento mediante el manejo robótico de líquidos.