Name: Inyecciones intravítreas en el ojo ovino (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 3 min 37 s
Description: Aprende a realizar inyecciones intravítreas en ojos de oveja como modelo para terapia génica ocular en humanos. Este protocolo permite tratar la degeneración retinal de forma menos invasiva.

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Los autores desean agradecer al Dr. Steve Heap (BVSc, CertVOphthal) por su ayuda en el establecimiento de este protocolo y la realización de las inyecciones descritas por Murray et al.15. Los autores también reconocen la financiación de CureKids New Zealand, la Fundación de Investigación Médica de Canterbury, Neurogene Inc y la Asociación de Apoyo e Investigación de la Enfermedad de Batten.

Todos los protocolos experimentales fueron aprobados por el Comité de Ética Animal de la Universidad de Lincoln y están en línea con las directrices de los Institutos Nacionales de Salud de los Estados Unidos para el cuidado y uso de animales en la investigación y la Ley de Bienestar Animal de Nueva Zelanda (1999). Las ovejas Borderdale fueron diagnosticadas al nacer14 años y mantenidas en granjas de investigación de la Universidad de Lincoln. Tres ovejas homocigotas de 3 meses de edad (CLN5-/-) recibieron una sola inyección de IVT en el ojo izquierdo, con el ojo derecho no tratado actuando como control interno. Los datos de electrorretinografía y patología se compararon con los datos históricos de control sanos y afectados. El vector viral utilizado en este estudio fue un virus adenoasociado autocomplementario serotipo 9, que contiene el promotor de la acción beta del pollo (CBh) y CLN5 ovino optimizado para codón (scAAV9 / CBh-oCLN5opt). El vector viral fue proporcionado por la Universidad de Carolina del Norte Vector Core, NC, EE.UU.
1. Precirugía
<ol><li>Autoclave del kit quirúrgico (Figura 1).</li>
	<li>Ayunar las ovejas durante 24 h antes de la cirugía.</li>
	<li>Registre los pesos vivos antes de la cirugía.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63823/63823fig01.jpg"> Figura 1: Botiquín de cirugía intravítrea. Los instrumentos necesarios para la cirugía de IVT incluyen (1) un espéculo para mantener los párpados abiertos y (2) un par de pinzas de nariz curva para agarrar la conjuntiva bulbar y rotar el ojo. (3) También se incluye un hemostático de nariz recta como instrumento alternativo para agarrar la conjuntiva bulbar y mantener el ojo en su lugar si ha retrocedido a la órbita del ojo. Este kit se esteriliza en autoclave antes de la cirugía. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63823/63823fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
2. Procedimiento quirúrgico
<ol><li>Sujete al animal y, usando cortapelos electrónicos, afeite la lana de un lado del cuello sobre la vena yugular.</li>
	<li>Ocluya la vena yugular aplicando presión en la base del surco yugular y visualice la vena elevada.</li>
	<li>Extraiga la cantidad adecuada de diazepam (0,3 mg/kg) y ketamina (7,5 mg/kg) en una jeringa estéril y coloque una aguja estéril de 20 G. Inserte la aguja en la vena yugular y retire suavemente el émbolo para asegurarse de que la sangre ingrese al cubo y la aguja esté dentro de la vena. Una vez confirmado, inducir a través de la administración intravenosa (yugular).</li>
	<li>Inmediatamente después de la inducción, coloque al animal en decúbito dorsal, extienda el cuello y sostenga la lengua hacia arriba y hacia adelante, usando un laringoscopio para visualizar la laringe. Realizar la intubación endotraqueal insertando suavemente un tubo endotraqueal (tamaño 6.0-9.0 dependiendo del tamaño de la oveja) entre las cuerdas vocales cuando el animal exhala. Infle el manguito endotraqueal inmediatamente y asegure el tubo con un lazo alrededor de la mandíbula inferior. Confirme el flujo de aire a través del tubo.</li>
	<li>Transfiera la oveja a la mesa quirúrgica y colóquela en decúbito lateral.</li>
	<li>Conecte inmediatamente el tubo endotraqueal a las mangueras de la máquina anestésica para la administración de isoflurano en oxígeno al 100%. Inicialmente comience con 3% -4% de isoflurano y luego reduzca a 2% -3% para el mantenimiento. Observar la ventilación espontánea de las ovejas.</li>
	<li>Controle la frecuencia cardíaca (pulso), la frecuencia respiratoria, la saturación de oxígeno, los niveles deCO2 al final de la espiración y la temperatura corporal rectal durante todo el procedimiento. Ver Tabla 1 para los valores fisiológicos para estos parámetros en ovejas anestesiadas (variable, pero usar como guía).</li>
	<li>Coloque una cortina grande, estéril y cuadrada en un carro quirúrgico, seguido de los instrumentos estériles.</li>
	<li>Coloque una cortina quirúrgica estéril y fenestrada sobre el ojo que se inyectará.</li>
	<li>Desinfecte asépticamente el ojo con una jeringa estéril de 20 ml para irrigar el ojo con una solución de povidona yodada al 1-5%.</li>
	<li>Aplique 1-2 gotas de solución oftálmica Alcaine 0.5% W/V, como anestésico local, en el ojo.</li>
	<li>Coloque un espéculo de ojo de Nopa Barraquer-Colibrí (10 mm) en los párpados para mantener el ojo abierto.</li>
	<li>Agarre la conjuntiva bulbar en la cara dorsolateral del ojo con fórceps y gire el globo ocular ventromedialmente.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>Consciente</td>
			<td>Anestesiado</td>
			<td>Punto crítico de intervención recomendado</td>
		</tr><tr><td>Frecuencia cardíaca (latidos/min)</td>
			<td>50-80 (descanso) a 280 (activo)</td>
			<td>50-80</td>
			<td>&lt;50, &gt;100</td>
		</tr><tr><td>Frecuencia respiratoria (respiraciones/min)</td>
			<td>15-40 (reposo) a 350 (sobrecalentado)</td>
			<td>10-30</td>
			<td>&lt;8, &gt;40</td>
		</tr><tr><td>Saturación de oxígeno (mm Hg)</td>
			<td>95-100</td>
			<td>98-100</td>
			<td>&lt;90</td>
		</tr><tr><td>CO2 al final de la marea (mm Hg)</td>
			<td>35-45</td>
			<td>35-45</td>
			<td>&gt;55</td>
		</tr><tr><td>Temperatura corporal (°C)</td>
			<td>38.5-39.5</td>
			<td>38.5-39.5</td>
			<td>&lt;36, &gt;40</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 1: Valores fisiológicos de los parámetros a monitorizar en ovejas anestesiadas.
3. Preparación viral
<ol><li>Conservar las alícuotas vectoriales AAV a −80 °C hasta su uso.</li>
	<li>El día de la cirugía, descongele el número requerido de viales para la administración de IVT en hielo.</li>
	<li>Inmediatamente antes de la administración, vórtice la alícuota del vector viral y centrifugar a 400 × g durante 10 s para recoger el contenido.</li>
	<li>Diluir cada alícuota del vector viral en solución salina tamponada con fosfato (PBS) estéril filtrada 1x hasta la dosis deseada en un volumen final de 100 μL. Preparar diluciones vectoriales en un tubo estéril de microcentrífuga de baja unión a proteínas de 1,5 ml utilizando puntas de pipeta de filtro estériles. Deseche todos los consumibles que hayan estado en contacto con el vector viral en solución desinfectante (consulte la Tabla de materiales). NOTA: En la publicación original15 la dosis del agente terapéutico (AAV9. CLN5) fue 1,9 x 1010 genomas virales. La dosis recomendada variará dependiendo del agente terapéutico que se administre; Por lo tanto, no se ha incluido una dosis en el protocolo estándar presentado aquí.</li>
	<li>Extraiga los 100 μL completos de la preparación del vector AAV en una jeringa estéril de 1 ml de espacio muerto bajo con una aguja de 28 G x 1/2 en permanentemente unida para inyección inmediata. Asegúrese de que el tiempo transcurrido desde la preparación hasta la inyección sea inferior a 2 minutos.</li>
</ol>4. Administración viral
<ol><li>Inserte la aguja aproximadamente 7 mm posterior a la esclerótica en la cara lateral del ojo y en ángulo posterior para evitar la lente (Figura 2 y Figura 3). Administrar la inyección única de 100 μL como bolo lo más cerca posible de la retina sin alterar la superficie de la retina.</li>
	<li>Enjuague el ojo con aproximadamente 10-15 ml de solución de povidona yodada al 1-5% seguida de 10 ml de solución salina antes de retirar el espéculo y la cortina.</li>
	<li>Voltee las ovejas y repita con el otro ojo si es necesario.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63823/63823fig02.jpg"> Figura 2: Rotación ventromedial del globo ocular . (A) Agarre la conjuntiva bulbar con fórceps no dentados y (B) gire ventromedialmente (es decir, hacia abajo y hacia el hocico) para exponer la superficie dorsolateral del ojo para la inyección. Abreviaturas: V = ventral, D = dorsal, M = medial, L = lateral. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63823/63823fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63823/63823fig03.jpg"> Figura 3: Ubicación y profundidad de la inyección. La aguja se inyecta en la cara dorsolateral del globo ocular y la longitud completa del eje de la aguja (0,5 pulgadas/12,7 mm) se inserta en el ojo. Tenga en cuenta el ángulo de la aguja hacia la parte posterior del ojo para evitar la lente e inyecte lo más cerca posible de la retina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63823/63823fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
5. Manejo postoperatorio
<ol><li>Al finalizar el procedimiento, detenga la anestesia por inhalación de gas isoflurano, enjuague la línea con oxígeno al 100%, desconecte la manguera del tubo endotraqueal y transfiera las ovejas a la sala de recuperación.</li>
	<li>Coloque las ovejas en decúbito esternal, con las patas metidas debajo, y monitoree hasta su recuperación completa. Asegúrese de que la boca del animal esté libre de obstrucciones.</li>
	<li>Cuando se observe el reflejo de deglución, desinfle parcialmente el manguito del tubo endotraqueal y retire suavemente el tubo de la boca.</li>
	<li>Administre un antiinflamatorio no esteroideo intramuscular en el músculo bíceps femoral de la extremidad posterior, antibióticos subcutáneos en el lado del cuello o detrás del hombro y gotas oftálmicas de cloranfenicol al 0,5% en la superficie del globo ocular.</li>
	<li>Proporcione agua y comida (pellets de alfalfa y paja) una vez que las ovejas puedan pararse sin ayuda.</li>
	<li>Administrar gotas oftálmicas de cloranfenicol al 0,5% 2-3 por día durante 7 días después de la cirugía.</li>
	<li>Mantenga las ovejas en el interior durante la noche antes de regresar al prado al aire libre aproximadamente 24 h después de la cirugía.</li>
	<li>Registre las temperaturas rectales diariamente durante 3 semanas. Controle cualquier cambio en el pulso o la frecuencia respiratoria, el consumo de alimentos, el neurocomportamiento, la temperatura corporal, el peso, la postura, la salud ocular y los signos clínicos de mala salud. Busque tratamiento veterinario apropiado si hay indicios de eventos adversos.</li>
</ol>6. Evaluación de la eficacia in vivo
<ol><li>Si el objetivo de la inyección de IVT es preservar la visión, monitoree la eficacia in vivo mediante métodos como la prueba de laberinto o la electrorretinografía (ERG) para evaluar la función de las células de la retina o la tomografía de coherencia óptica (OCT) para evaluar la estructura de la retina. NOTA: Estas medidas de eficacia han sido bien descritas después de la terapia génica IVT11,15,16.</li>
</ol>7. Análisis de tejido postmortem
<ol><li>Realizar la eutanasia ovina por un método aprobado en un punto final apropiado después de la cirugía de inyección intravítrea. NOTA: Los métodos de eutanasia sugeridos, como los medicamentos de eutanasia veterinaria intravenosa o un perno cautivo penetrante en la columna cervical seguido de una rápida exanguinación, se detallan en otra parte15,16.</li>
	<li>Coseche globos oculares de oveja usando tijeras curvas quirúrgicas afiladas / romas. Corte el canto lateral y medial para aumentar la abertura de la cuenca del ojo y luego corte sistemáticamente a través de los pliegues conjuntivales, el tejido conectivo, los músculos y el nervio óptico para liberar el globo ocular de la cuenca.</li>
	<li>Fijación por inmersión de globos oculares intactos y enucleados en formalina al 10% durante 2 h, seguido de postfijación en la solución de Bouin durante 4 h, haciendo un corte pequeño (0,5 cm) en la esclerótica para permitir una perfusión suficiente. Alternativamente, fije por inmersión los globos oculares en la solución de Davidson durante 48 h.</li>
	<li>Procesar secciones de tejido ocular a través de la incrustación y seccionamiento rutinario de cera de parafina a 3-5 μm. NOTA: Los procedimientos de tinción para la tinción de hematoxilina y eosina (H&amp;E) y el análisis inmunohistoquímico se han descrito previamente15,16.</li>
	<li>Evaluar la eficacia en el tejido postmortem mediante medidas como el grosor total de la retina, el grosor de la capa retiniana, los recuentos de filas celulares de la capa nuclear externa y la tinción inmunohistoquímica para los tipos de células de la retina, la glía retiniana o las proteínas de interés. NOTA: Para los protocolos para estos análisis, ver publicaciones anteriores15,16.</li>
</ol>

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<li>Park, I., Park, H. S., Kim, H. K., Chung, W. K., Kim, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+measurement+of+intraocular+pressure+variation+during+automatic+intravitreal+injections%3A+An+ex-vivo+experimental+study+using+porcine+eyes%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Real-time measurement of intraocular pressure variation during automatic intravitreal injections: An ex-vivo experimental study using porcine eyes.</a> PloS One. 16 (8), 0256344(2021).</li>
<li>Willekens, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravitreally+injected+fluid+dispersion%3A+Importance+of+injection+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Intravitreally injected fluid dispersion: Importance of injection technique.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (3), 1434-1441 (2017).</li>
<li>Peynshaert, K., Devoldere, J., De Smedt, S. C., Remaut, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+ex+vivo+models+to+study+drug+delivery+barriers+in+the+posterior+segment+of+the+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">In vitro and ex vivo models to study drug delivery barriers in the posterior segment of the eye.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 126, 44-57 (2018).</li>
<li>Kiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vector+Considerations+for+Ocular+Gene+Therapy.+Adeno-associated+virus+vectors+offer+a+safe+and+effective+tool+for+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Retinal+Physician%22%5BJournal%5D)">Vector Considerations for Ocular Gene Therapy. Adeno-associated virus vectors offer a safe and effective tool for gene delivery.</a> Retinal Physician. 17, 40-45 (2020).</li>
<li>Kleine Holthaus, S. -M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+targeting+the+inner+retina+rescues+the+retinal+phenotype+in+a+mouse+model+of+CLN3+Batten+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Gene therapy targeting the inner retina rescues the retinal phenotype in a mouse model of CLN3 Batten disease.</a> Human Gene Therapy. 31 (13-14), 709-718 (2020).</li>
<li>Kleine Holthaus, S. -M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+brain-directed+gene+therapy+rescues+a+mouse+model+of+neurodegenerative+CLN6+Batten+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Neonatal brain-directed gene therapy rescues a mouse model of neurodegenerative CLN6 Batten disease.</a> Human Molecular Genetics. 28 (23), 3867-3879 (2019).</li>
</ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Las inyecciones intravítreas son uno de los procedimientos quirúrgicos más comunes en oftalmología humana y han demostrado ser eficaces en la administración de terapias génicas mediadas por AAV a la retina de las ovejas. Anteriormente habíamos demostrado la eficacia de AAV9. La terapia génica CLN5 administrada intravítreamente atenuando la disfunción retiniana y la degeneración en ovejas con CLN5 NCL15. Se espera que la traducción de esta vía de administración a pacientes humanos con NCL también r...

Se pueden usar varios métodos para administrar agentes terapéuticos a la retina, incluida la administración intravítrea (IVT), subretiniana, supracoroidea, periocular o tópica. Cada vía de administración implica superar barreras como la barrera sangre-retina o las membranas limitantes internas y externas y tiene tasas variables de eficacia dependiendo del fármaco que se administra y del objetivo retiniano específico 1,2.
La administración de fármacos IVT implica una inyección en el humor vítreo del ojo, una sustancia gelatinosa que ocupa la cámara posterior del ojo. La función principal del humor vítreo es mantener la forma del globo ocular y mantener los tejidos oculares, como el cristalino y la retina, en su lugar. El humor vítreo está compuesto principalmente de agua, con pequeñas cantidades de colágeno, ácido hialurónico y otras proteínas no colágenas3. La inyección de IVT es un procedimiento simple y común utilizado rutinariamente para tratar una amplia gama de afecciones oculares, incluida la degeneración macular relacionada con la edad, el edema macular diabético, la retinopatía diabética, la oclusión de la vena retiniana y varias distrofias retinianas hereditarias 4,5.
Lipofuscinosis neuronal ceroidea (NCL; Enfermedad de Batten) son un grupo de enfermedades mortales de almacenamiento lisosomal que causan una degeneración grave del cerebro y la retina. Actualmente hay 13 variantes conocidas de NCL resultantes de mutaciones en diferentes genes (CLN1-8, CLN10-14) que afectan predominantemente a los niños, pero tienen diferentes edades de inicio y gravedad de la enfermedad6. Las NCL comparten síntomas progresivos comunes, que incluyen deterioro cognitivo y motor, convulsiones y pérdida de la visión. No hay cura para la NCL; sin embargo, la terapia de reemplazo enzimático dirigida al cerebro se encuentra actualmente en ensayos clínicos para la enfermedad CLN27,8, y la terapia génica mediada por AAV ha demostrado ser muy prometedora en estudios preclínicos, con un ensayo clínico para la terapia génica CLN5 que se espera que comience en 2022 9,10.
Muchas otras especies desarrollan formas naturales de NCL, incluyendo gatos, perros, ovejas y vacas. Dos modelos ovinos de NCL están actualmente en estudio activo en Nueva Zelanda: un modelo de enfermedad CLN5 en ovejas de Borderdale y un modelo de enfermedad CLN6 en ovejas de South Hampshire. Las ovejas afectadas presentan muchas de las características clínicas y patológicas de la enfermedad humana, incluyendo atrofia retiniana y pérdida de visión10,11. Aunque la terapia génica CLN5 dirigida al cerebro en ovejas con enfermedad CLN5 puede prevenir o detener la atrofia cerebral y el deterioro clínico, las ovejas tratadas aún pierden su visión9. Esto puso de manifiesto la necesidad de tratar la retina para preservar la visión y mantener una mejor calidad de vida, lo que llevó al establecimiento de un protocolo para la terapia génica ocular en ovejas.
El ojo de oveja representa un buen modelo del ojo humano debido a su similitud en las dimensiones del globo ocular, volumen vítreo y estructura retiniana10,12,13. Este artículo detalla el protocolo quirúrgico para la administración de IVT de un pequeño volumen (≤100 μL) de vector viral terapéutico al ojo ovino.

<table><tbody><tr><td>Jeringa de seguridad de 1 mL de espacio muerto bajo con aguja de 0,5 pulgadas fijada permanentemente</td><td>Fisher Scientific, Auckland, Nueva Zelanda</td><td>05-561-28</td><td>Covidien Monoject Tuberculin Jeringa de seguridad o tubo de</td></tr><tr><td>microcentrífuga similar de 1,5 mL</td><td>Sigma Aldrich</td><td>HS4323</td><td>Tubos de autoclave para esterilizar antes de usar</td></tr><tr><td>Máquina de anestesia con banco de gas y monitor&nbsp;</td><td>Hyvet Anesthesia, Christchurch, Nueva Zelanda</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gotas oftálmicas antibióticas&nbsp;</td><td>Teva Pharma Ltd, Auckland, Nueva Zelanda</td><td></td><td>Nombre comercial: Chlorafast (0.5% cloranfenicol)</td></tr><tr><td>BrightMount plus medio de montaje anti-decoloración</td><td>Abcam, Cambridge, Reino Unido</td><td>ab103748</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4&prime; ,6-diamidino-2-fenilindol diclorhidrato)</td><td>Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri, Estados Unidos</td><td>10236276001</td><td></td></tr><tr><td>Sedante</td> <td>de diazepamIlium, Troy Laboratories Pty Ltd, Tauranga, Nueva Zelanda</td><td></td><td>5 mg/mL</td></tr><tr><td>Tubos endotraqueales</td><td>Flexicare Medical Ltd, Mountain Ash, Reino Unido</td><td></td><td>Estándar, con manguito. Tallas 7, 7,5 u 8 dependiendo del tamaño de la oveja</td></tr><tr><td>Espéculo ocular</td><td>Capes Medical Ltd, Tauranga, Nueva Zelanda</td><td>KP151/14</td><td>Nopa Barraquer-Colibri (10 mm)</td></tr><tr><td>Paño quirúrgico fenestrado</td><td>Amtech Medical Ltd, Whanganui, Nueva Zelanda</td><td>DI583</td><td>O similar&nbsp;</td></tr><tr><td>Consejos de filtro</td><td>Interlab, Auckland, Nueva Zelanda</td><td></td><td>10, 200 y 1,000 &micro; L&nbsp;</td></tr><tr><td>Solución de formaldehído (37%)</td><td>Fisher Scientific, Auckland, Nueva Zelanda</td><td>AJA809-2.5PL</td><td>Hacer hasta un 10% en agua destilada con 0.9% NaCl</td></tr><tr><td>Cabra anti-conejo Alexa Fluor 594</td><td>Invitrogen Carlsbad, CA, USA</td><td>&nbsp; A-11012</td><td>Uso en una dilución de 1:500</td></tr><tr><td>Anestésico de isoflurano</td><td>Attane, Bayer Animal Health, Auckland, Nueva Zelanda</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ketamina HCl anestésico/analgésico</td><td>PhoenixPharm Distributors Ltd, Auckland, Nueva Zelanda</td><td></td> Laringoscopio (veterinario) <td>100 mg/mL</td></tr> (<tr><td>veterinario)</td><td>KaWe Medical, Dinamarca</td><td></td><td>Cuchilla Miller C, tamaño 2</td></tr><tr><td>Agujas&nbsp;</td><td>Capes Medical Ltd, Tauranga, Nueva Zelanda</td><td>302025</td><td>BD Agujas hipodérmicas, o similares</td></tr><tr><td>Antiinflamatorios no esteroideos</td><td>Boehringer Ingelheim (NZ) Ltd, Auckland, Nueva Zelanda</td><td>49402/008</td><td>Nombre comercial: Metacam 20 (20 mg/mL meloxicam)</td></tr><tr><td>Pinzas no dentadas</td><td>Capes Medical Ltd, Tauranga, Nueva Zelanda</td><td>AB864/16</td><td>O similar&nbsp;</td></tr><tr><td>Hemostático no dentado</td><td>Capes Medical Ltd, Tauranga, Nueva Zelanda</td><td>AA150/12</td><td>O similar&nbsp;</td></tr><tr><td>Suero de cabra normal</td><td>Thermo Fisher Scientific, Christchurch, Nueva Zelanda</td><td>16210072</td><td></td></tr><tr><td>Oxígeno (médico)</td><td>BOC Gas, Christchurch, Nueva Zelanda</td><td></td><td>Cilindro D2, código de gas 180</td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific, Christchurch, Nueva Zelanda</td><td>10010023</td><td>Solución estéril y filtrada</td></tr><tr><td>de povidona yodada</td><td>Capes Medical Ltd, Tauranga, Nueva Zelanda</td><td>005835</td><td>Nombre comercial: Betadine (10% povidona-yodado)</td></tr><tr><td>Proteína ácida fibrilar glial anti-vaca de conejo (GFAP)</td><td>Dako, Glostrup, Dinamarca</td><td>Z0334</td><td>Uso en una dilución de 1:2.500</td></tr><tr><td>Virus adenoasociado autocomplementario serotipo 9, que contiene el promotor de la acción beta del pollo (CBh) y el codón optimizado ovino CLN5</td><td>Universidad de Carolina del Norte Vector Core, Carolina del Norte, EE. UU.</td><td>scAAV9 / CBh-oCLN5opt</td><td></td></tr><tr><td>Solución de cloruro de sodio 0.9% IV Capes</td><td>Medical Ltd, Tauranga, Nueva Zelanda</td><td>AHB1322</td><td>Nombre comercial: Solución salina &nbsp;</td></tr><tr><td>Antibióticos subcutáneos</td><td>Intervet Schering Plough Animal Health Ltd, Wellington, Nueva Zelanda</td><td></td><td>Nombre comercial: Duplocillin LA (150,000 UI/mL de penicilina procaína y 115,000 UI/mL de penicilina benzatínica)</td></tr><tr><td>Tijeras quirúrgicas afiladas y curvas romas&nbsp;</td><td>Capes Medical Ltd, Tauranga, Nueva Zelanda</td><td>SSSHBLC130</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa Terumo Luer Lock Amtech</td><td>Medical Ltd, Whanganui, Nueva Zelanda</td><td>SH159/SH160</td><td>Jeringas estériles; 10 mL para la extracción de medicamentos de inducción, 20 mL para la extracción de solución salina</td></tr><tr><td>Polvo desinfectante Virkon EBOS</td><td>Group Ltd, Christchurch, Nueva Zelanda</td><td>28461115</td><td></td></tr></tbody></table>

inyecciones intravítreas en el ojo ovino

Intravitreal Injections in the Ovine Eye

Existen varios métodos para la administración de agentes terapéuticos a la retina, incluida la administración intravítrea (IVT), subretiniana, supracoroidea, periocular o tópica. La administración de fármacos IVT implica una inyección en el humor vítreo del ojo, una sustancia gelatinosa que llena la cámara posterior del ojo y mantiene la forma del globo ocular. Aunque la vía IVT es menos específica que la administración subretiniana, es mucho menos invasiva y se usa ampliamente en entornos clínicos para una variedad de enfermedades oculares. 
Anteriormente demostramos la eficacia de la administración intravítrea de un producto de terapia génica mediado por virus adenoasociados (AAV) (AAV9). CLN5) en ovejas con una forma CLN5 natural de lipofuscinosis neuronal ceroidea (NCL). Las ovejas afectadas recibieron terapia génica IVT en un ojo, con el otro ojo no tratado sirviendo como control interno. La estructura y función de la retina se mantuvieron en el ojo tratado hasta 15 meses después del tratamiento, mientras que el ojo no tratado mostró una función progresivamente decreciente y atrofia severa durante el examen postmortem. Sobre la base de los estudios con ovejas, el producto de terapia génica CLN5 fue aprobado como un nuevo fármaco candidato en investigación (IND) por la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos en septiembre de 2021. Este artículo detalla el protocolo quirúrgico para la administración de IVT de un vector viral terapéutico al ojo ovino.

La eficacia de la administración de IVT de un vector de terapia génica CLN5 en la atenuación de la disfunción retiniana y la degeneración en ovejas con CLN5 NCL ha sido previamente demostrada por este grupo de investigación15. Las ovejas afectadas recibieron una única inyección IVT de 100 μL de CLN5 empaquetada en un vector AAV serotipo 9 (AAV9) (AAV9). CLN5) en un ojo, con el ojo contralateral sirviendo como un control interno no tratado. La visión se evaluó mensualmente desde la edad de inyecció...

Se realizaron inyecciones intravítreas en el ojo de oveja con el objetivo de administrar terapia génica mediada por virus a la retina.

Inyecciones intravítreas en el ojo ovino

There are several methods for the delivery of therapeutic agents to the retina, including intravitreal (IVT), subretinal, suprachoroidal, periocular, or ...

Las inyecciones intravítreas se pueden utilizar para administrar agentes terapéuticos a la retina. Aquí se presenta un protocolo para inyecciones intravítreas en el ojo de oveja, como modelo del ojo humano. Las inyecciones intravítreas son mucho menos invasivas que otras inyecciones oculares.Las inyecciones intravítreas se pueden usar con éxito para administrar un producto de terapia génica y tratar la degeneración retiniana en ovejas con lipofuscinosis ceroidea neuronal natural. Una vez anestesiada la oveja, comience a desinfectar asépticamente el ojo que se inyectará irrigándolo con una solución de povidona yodada al 1 a 5% utilizando una jeringa de 20 mililitros. Luego, coloque una cortina quirúrgica estéril y fenestrada sobre el ojo.Coloque un espéculo ocular en los párpados para mantener el ojo abierto. Agarre la conjuntiva bulbar en la cara lateral dorsal del ojo con fórceps y gire el globo ocular ventromedialmente. Inserte la aguja aproximadamente siete milímetros posterior a la esclerótica en la cara lateral del ojo, y en ángulo posterior para evitar la lente.Administrar la inyección única de 100 microlitros en forma de bolo, lo más cerca posible de la retina, sin alterar la superficie retiniana. Enjuague el ojo con aproximadamente 10 a 15 mililitros de solución de povidona yodada al 1 a 5% seguida de 10 mililitros de solución salina, antes de retirar el espéculo y la cortina. El análisis electrorretinográfico demostró la función retiniana preservada en el ojo tratado, mientras que el ojo no tratado disminuyó de manera similar a los animales afectados por CLN5.La histología retiniana estaba casi normalizada en el ojo tratado con un grosor retiniano total comparable al de los animales de control sanos en la retina central. Por el contrario, el grosor de la retina no tratada fue comparable al de los animales afectados por CLN5. La expresión de la proteína ácida fibrilar glial, o GFAP, un marcador de estrés retiniano y astroglia, fue menor en los ojos tratados que en los ojos no tratados, lo que indica que la inflamación asociada a la enfermedad se atenuó después del tratamiento.Con el establecimiento de un protocolo para las inyecciones intravítreas en el ojo de oveja, las ovejas ahora podrían usarse para probar la seguridad y eficacia de muchos agentes terapéuticos administrados por vía intravítrea.

Research

Investigación

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Inyección intravítrea es una técnica ampliamente utilizada en la investigación de las ciencias visuales de enfermedades oculares o en la aplicación directa del tratamiento local. Este vídeo demuestra un protocolo de inyección intravítrea con una jeringa de 1 ml con una pipeta de vidrio. Consejos útiles acerca de cómo evitar una hemorragia masiva y daños en el objetivo se les da.

Inyección intravítrea para el establecimiento de modelos Enfermedades Oculares

Fuente: Park, S. W., et al. Abordaje limbal-inyección subretiniana de vectores virales para terapia génica en el epitelio pigmentario de la retina de ratones. J. Vis. Exp. (2015)El video describe el método para la inyección subretiniana de vectores virales en el epitelio pigmentario de la retina (EPR) en un modelo de ratón. Detalla el procedimiento desde la anestesia y la preparación ocular hasta la administración precisa del vector lentiviral, asegurando la integración y expresión génica en el...

Inyección subretiniana de vectores virales en el epitelio pigmentario de la retina en un modelo de ratón

Los conejos son ampliamente utilizados para estudiar la farmacocinética de los fármacos intraoculares. Describimos un método para realizar estudios farmacocinéticos de fármacos intraoculares utilizando ojos de conejo.

El uso de ojos de conejo en el estudio farmacocinético de intraoculares Drogas

Aquí nos muestran un nuevo enfoque al uso de tomografía de coherencia óptica de dominio espectral de alta resolución (HR-SD-OCT) para facilitar la presentación de los agentes de terapia génica en el espacio subretinal, evaluar su cobertura areal y caracterizan la vitalidad del fotorreceptor.

Tomografía de coherencia óptica ultraalta resolución ratón para facilitar la inyección Intraocular en investigación de retina la terapia génica

Las células epiteliales del pigmento retiniano podrían servir como una terapia de reemplazo celular para la forma avanzada de la degeneración macular seca relacionada con la edad. Este protocolo describe la generación de un modelo de grandes ojos de atrofia geográfica y el transplante subretinal de células epiteliales del pigmento retiniano derivados de células madre embrionarias humanas en este modelo de la enfermedad.

Transplante subretinal de células epiteliales del pigmento retiniano derivado de células madre embrionarias humanas en un modelo de grandes ojos de atrofia geográfica

Aquí describimos un método de inyección intravítrea y posterior cuantificación bacteriana en el modelo de ratón de endoftalmitis bacteriana. Este protocolo se puede extender para medir las respuestas inmunitarias del huésped y la expresión génica bacteriana y del huésped.

Inyección intravítrea y cuantificación de parámetros de infección en un modelo de ratón de endoftlomitis bacteriana

En este manuscrito, la inyección subconjuntival se demuestra como un método válido de administración de vectores para tejidos oculares en ratones utilizando un sistema de inyección que consiste en una bomba de jeringa de infusión/extracción y una jeringa extraíble hermética al gas acoplada con agujas de microinyección. Este sistema de inyección también es adaptable para otras vías de administración intraocular.

Administración subconjuntival de vectores de virus adenoasociados en modelos de animales pequeños

Este protocolo describe una técnica para la inyección intracameral en ratas utilizando una incisión corneal central y un túnel largo hacia la cámara anterior. Este método de inyección minimiza el riesgo de inducir daño tisular involuntario y, por lo tanto, mejora la precisión y la reproducibilidad.

Inyección intracameral en ratas con bajo riesgo de efectos adversos

Este protocolo describe una técnica única que utiliza un abordaje transconjuntival para acceder al nervio óptico de rata para inyecciones.

Abordaje transconjuntival para inyección en el nervio óptico de la rata

Este estudio presenta una metodología para la administración de terapias en la retina y los nervios ópticos de la rata adulta. Además, se introduce un método único de recuperación de tejido para una colección en bloque de arriba hacia abajo del nervio óptico y la retina en una rata adulta.

Administración Terapéutica Ocular y Recuperación Avanzada de Tejido en Ratas Adultas

Aprende a realizar inyecciones intravítreas en ojos de oveja como modelo para terapia génica ocular en humanos. Este protocolo permite tratar la degeneración retinal de forma menos invasiva.

Inyecciones intravítreas en el ojo ovino

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