Name: Medición del número de copias de ADN mitocondrial unicelular y la heteroplasmia mediante la reacción en cadena de la polimerasa de gotitas digitales (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-12T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: Aprende a medir el número de copias de ADN mitocondrial y la heteroplasmia por deleción en células individuales mediante PCR de gotitas digitales. Este método preciso beneficia la investigación de función mitocondrial.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Gracias al Dr. L Bozhilova por su asesoramiento sobre el análisis estadístico de los datos de PCR de generación de gotas. Gracias al Dr. H Zhang por proporcionar los ovocitos utilizados para generar datos en la Figura 3C y la Figura 4B. Este trabajo fue llevado a cabo por SPB en la Unidad de Biología Mitocondrial del Consejo de Investigación Médica (MC_UU_00015/9), Universidad de Cambridge, y financiado por una beca de investigación principal de Wellcome Trust en poder de PFC (212219 / Z / 18 / Z).

<ol><li>Taanman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial+genome%3A+structure%2C+transcription%2C+translation+and+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial genome: structure, transcription, translation and replication.</a> Biochimica Biophysica Acta. 1410 (2), 103-123 (1999).</li>
<li>Wai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+mitochondrial+DNA+copy+number+in+mammalian+fertility%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">The role of mitochondrial DNA copy number in mammalian fertility.</a> Biology of Reproduction. 83 (1), 52-62 (2010).</li>
<li>D'Erchia, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+mtDNA+abundance+from+exome+data+and+its+correlation+with+mitochondrial+transcription%2C+mass+and+respiratory+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific mtDNA abundance from exome data and its correlation with mitochondrial transcription, mass and respiratory activity.</a> Mitochondrion. 20, 13-21 (2015).</li>
<li>Stewart, J. B., Chinnery, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamics+of+mitochondrial+DNA+heteroplasmy%3A+implications+for+human+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Genetics%22%5BJournal%5D)">The dynamics of mitochondrial DNA heteroplasmy: implications for human health and disease.</a> Nature Reviews: Genetics. 16 (9), 530-542 (2015).</li>
<li>Durham, S. E., Samuels, D. C., Cree, L. M., Chinnery, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+levels+of+wild-type+mitochondrial+DNA+maintain+cytochrome+c+oxidase+activity+for+two+pathogenic+mitochondrial+DNA+mutations+but+not+for+m.3243A--%3EG%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Normal levels of wild-type mitochondrial DNA maintain cytochrome c oxidase activity for two pathogenic mitochondrial DNA mutations but not for m.3243A-->G.</a> American Journal of Human Genetics. 81 (1), 189-195 (2007).</li>
<li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wild-type+mitochondrial+DNA+copy+number+in+urinary+cells+as+a+useful+marker+for+diagnosing+severity+of+the+mitochondrial+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Wild-type mitochondrial DNA copy number in urinary cells as a useful marker for diagnosing severity of the mitochondrial diseases.</a> PloS One. 8 (6), 67146(2013).</li>
<li>Filograna, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+mtDNA+copy+number+ameliorates+the+pathological+consequences+of+a+heteroplasmic+mtDNA+mutation+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Modulation of mtDNA copy number ameliorates the pathological consequences of a heteroplasmic mtDNA mutation in the mouse.</a> Science Advances. 5 (4), (2019).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+increase+of+mitochondrial+DNA+content+in+endometrial+adenocarcinoma+cells%3A+a+quantitative+study+using+laser-captured+microdissected+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Gynecologic+Oncology%22%5BJournal%5D)">The increase of mitochondrial DNA content in endometrial adenocarcinoma cells: a quantitative study using laser-captured microdissected tissues.</a> Gynecologic Oncology. 98 (1), 104-110 (2005).</li>
<li>Boulet, L., Karpati, G., Shoubridge, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+and+threshold+expression+of+the+tRNA%28Lys%29+mutation+in+skeletal+muscle+of+patients+with+myoclonic+epilepsy+and+ragged-red+fibers+%28MERRF%29%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Distribution and threshold expression of the tRNA(Lys) mutation in skeletal muscle of patients with myoclonic epilepsy and ragged-red fibers (MERRF).</a> American Journal of Human Genetics. 51 (6), 1187-1200 (1992).</li>
<li>Lee, J., Hyeon, D. Y., Hwang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+multiomics%3A+technologies+and+data+analysis+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Single-cell multiomics: technologies and data analysis methods.</a> Experimental and Molecular Medicine. 52 (9), 1428-1442 (2020).</li>
<li>Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+Digital+PCR+versus+qPCR+for+gene+expression+analysis+with+low+abundant+targets%3A+from+variable+nonsense+to+publication+quality+data%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Droplet Digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: from variable nonsense to publication quality data.</a> Scientific Reports. 7 (1), 2409(2017).</li>
<li>Hindson, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absolute+quantification+by+droplet+digital+PCR+versus+analog+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Absolute quantification by droplet digital PCR versus analog real-time PCR.</a> Nature Methods. 10 (10), 1003-1005 (2013).</li>
<li>Herbst, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+PCR+quantitation+of+muscle+mitochondrial+DNA%3A+age%2C+fiber+type%2C+and+mutation-induced+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Journals+of+Gerontology.+Series+A%3A+Biological+Sciences+and+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Digital PCR quantitation of muscle mitochondrial DNA: age, fiber type, and mutation-induced changes.</a> Journals of Gerontology. Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 72 (10), 1327-1333 (2017).</li>
<li>O'Hara, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+mitochondrial+DNA+copy+number+determination+using+droplet+digital+PCR+with+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Quantitative mitochondrial DNA copy number determination using droplet digital PCR with single-cell resolution.</a> Genome Research. 29 (11), 1878-1888 (2019).</li>
<li>Diaz, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+mitochondrial+DNA+with+large+deletions+repopulates+organelles+faster+than+full-length+genomes+under+relaxed+copy+number+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Human mitochondrial DNA with large deletions repopulates organelles faster than full-length genomes under relaxed copy number control.</a> Nucleic Acids Research. 30 (21), 4626-4633 (2002).</li>
<li>Krishnan, K. J., Bender, A., Taylor, R. W., Turnbull, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multiplex+real-time+PCR+method+to+detect+and+quantify+mitochondrial+DNA+deletions+in+individual+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A multiplex real-time PCR method to detect and quantify mitochondrial DNA deletions in individual cells.</a> Analytical Biochemistry. 370 (1), 127-129 (2007).</li>
<li>Lowes, H., Pyle, A., Duddy, M., Hudson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+mitochondrial+DNA+in+progressive+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">Cell-free mitochondrial DNA in progressive multiple sclerosis.</a> Mitochondrion. 46, 307-312 (2019).</li>
<li>Perier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accumulation+of+mitochondrial+DNA+deletions+within+dopaminergic+neurons+triggers+neuroprotective+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Accumulation of mitochondrial DNA deletions within dopaminergic neurons triggers neuroprotective mechanisms.</a> Brain. 136, Pt 8 2369-2378 (2013).</li>
<li>Cossarizza, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+the+use+of+flow+cytometry+and+cell+sorting+in+immunological+studies+%28second+edition%29%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies (second edition).</a> European Journal of Immunology. 49 (10), 1457(2019).</li>
<li>Espina, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-capture+microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Laser-capture microdissection.</a> Nature Protocols. 1 (2), 586-603 (2006).</li>
<li>Cree, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reduction+of+mitochondrial+DNA+molecules+during+embryogenesis+explains+the+rapid+segregation+of+genotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">A reduction of mitochondrial DNA molecules during embryogenesis explains the rapid segregation of genotypes.</a> Nature Genetics. 40 (2), 249-254 (2008).</li>
<li>Belmonte, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+PCR+methods+improve+detection+sensitivity+and+measurement+precision+of+low+abundance+mtDNA+deletions%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Digital PCR methods improve detection sensitivity and measurement precision of low abundance mtDNA deletions.</a> Scientific Reports. 6, 25186(2016).</li>
<li>Samuels, D. C., Schon, E. A., Chinnery, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+direct+repeats+cause+most+human+mtDNA+deletions%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Two direct repeats cause most human mtDNA deletions.</a> Trends in Genetics. 20 (9), 393-398 (2004).</li>
<li>Nissanka, N., Minczuk, M., Moraes, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+mitochondrial+DNA+deletion+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of mitochondrial DNA deletion formation.</a> Trends in Genetics. 35 (3), 235-244 (2019).</li>
<li>Macaulay, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+and+parallel+sequencing+of+the+genomes+and+transcriptomes+of+single+cells+using+G%26T-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Separation and parallel sequencing of the genomes and transcriptomes of single cells using G&T-seq.</a> Nature Protocols. 11 (11), 2081-2103 (2016).</li>
<li>Ludwig, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+tracing+in+humans+enabled+by+mitochondrial+mutations+and+single-cell+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Lineage tracing in humans enabled by mitochondrial mutations and single-cell genomics.</a> Cell. 176 (6), 1325-1339 (2019).</li>
<li>Rooney, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR+based+determination+of+mitochondrial+DNA+copy+number+in+multiple+species%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">PCR based determination of mitochondrial DNA copy number in multiple species.</a> Methods in Molecular Biology. 1241, 23-38 (2015).</li>
<li>Kamitaki, N., Usher, C. L., McCarroll, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+droplet+digital+PCR+to+analyze+allele-specific+RNA+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Using droplet digital PCR to analyze allele-specific RNA expression.</a> Methods in Molecular Biology. 1768, 401-422 (2018).</li>
<li>Maeda, R., Kami, D., Maeda, H., Shikuma, A., Gojo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+single+cell+analysis+of+mitochondrial+heteroplasmy+in+mitochondrial+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">High throughput single cell analysis of mitochondrial heteroplasmy in mitochondrial diseases.</a> Scientific Reports. 10 (1), 10821(2020).</li>
<li>Quan, P. L., Sauzade, M., Brouzes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((dPCR%3A+A+Technology+Review%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">dPCR: A Technology Review.</a> Sensors (Basel). 18 (4), (2018).</li>
<li>Lin, X., Huang, X., Urmann, K., Xie, X., Hoffmann, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+loop-mediated+isothermal+amplification+on+a+commercial+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Sensors%22%5BJournal%5D)">Digital loop-mediated isothermal amplification on a commercial membrane.</a> ACS Sensors. 4 (1), 242-249 (2019).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fully+integrated+microfluidic+devices+for+qualitative%2C+quantitative+and+digital+nucleic+acids+testing+at+point+of+care%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Fully integrated microfluidic devices for qualitative, quantitative and digital nucleic acids testing at point of care.</a> Biosensors and Bioelectronics. 177, 112952(2021).</li>
</ol>

No hay conflictos de intereses que revelar.

El protocolo descrito aquí es aplicable a una amplia gama de tipos de células y especies, además de los discutidos anteriormente, aunque la optimización cuidadosa de los nuevos diseños de ensayo será clave para garantizar que la precisión y la repetibilidad del método se mantengan cuando se aleje de las combinaciones de cebador / sonda previamente validadas. Cuando se trabaja con células individuales, es vital garantizar que la recolección de muestras se realice con la mayor precisión posible (por ejemplo, utilizando par...

El ADN mitocondrial (mt) de mamíferos es un pequeño (aprox. 16,5 Kb) genoma circular de ADN que reside en la matriz mitocondrial que codifica 37 genes, que comprende dos ARNr, 22 ARNt y 13 genes codificadores de proteínas1. A diferencia del genoma nuclear, que contiene una (haploide) o dos copias (diploides) de cada gen por célula, el ADNmt está presente en múltiples copias en las mitocondrias de cada célula, que van desde decenas de copias (por ejemplo, espermatocitos maduros) hasta cientos de miles de copias (por ejemplo, ovocitos)2,3. Una consecuencia de esta naturaleza de múltiples copias es que las mutaciones en el genoma del ADNmt, que pueden existir como polimorfismos de un solo nucleótido (SNP), deleciones o duplicaciones, pueden estar presentes en niveles variables en cualquier célula dada, lo que representa entre el 0% y el 100% de la población total de ADNmt de la célula. La existencia de genomas de ADNmt de tipo salvaje y mutantes en la misma célula se denomina heteroplasmia, y las mutaciones heteroplásmicas patógenas de ADNmt son una causa importante de enfermedad mitocondrial, con varios síndromes neurológicos comunes relacionados con mutaciones de ADNmt heteroplásmicas subyacentes4.
Dos parámetros clave que contribuyen a la probabilidad de que una mutación heteroplásmica del ADNmt cause enfermedad clínica son el nivel de heteroplasmia y el número de copias de ADNmt. Muchas mutaciones heteroplásmicas muestran un efecto umbral, con fenotipos bioquímicos y clínicos que solo se manifiestan por encima de un cierto nivel de heteroplasmia, típicamente alrededor del 80%5, y posteriormente empeoran a medida que la heteroplasmia aumenta aún más4. Sin embargo, también es importante considerar el número de copias de ADNmt presentes en la célula, ya que esto influirá en el número de genomas de ADNmt de tipo salvaje (es decir, "sanos") que están presentes en un nivel de heteroplasmia dado. Estudios en pacientes con enfermedad mitocondrial han destacado la importancia de esta interacción entre la heteroplasmia y el número de copias5,6, y Filograna et al. informaron recientemente un aumento en el número de copias de ADNmt aliviando los síntomas a pesar de la heteroplasmia inalterada en un modelo de ratón de enfermedad mitocondrial7.
Si bien se ha hecho mucho en los últimos años para mejorar la comprensión de la patogénesis y la transmisión de enfermedades causadas por la heteroplasmia de ADNmt, la mayor parte de este trabajo se ha realizado a nivel de tejidos en lugar de células, comparando los niveles medios de heteroplasmia tisular y las mediciones del número de copias adquiridas a partir de biopsias de tejido a granel y muestras de sangre. Algunas técnicas bien establecidas, como la microdisección por captura láser, permiten tales mediciones a nivel celular 8,9; sin embargo, la reciente explosión de métodos de análisis de células individuales de alto rendimiento, o los llamados "Single-cell Omics"10, ha creado un requisito para métodos que puedan medir con precisión estos parámetros cruciales de ADNmt a nivel de una sola célula.
El método de PCR de generación de gotas aprovecha los avances recientes en la tecnología microfluídica para mejorar los métodos existentes de cuantificación de concentraciones desconocidas de ADN a través de la amplificación por PCR de amplicones diana específicos en la muestrade ADN 11. A diferencia de la qPCR, donde el ADN de la muestra se amplifica en una sola reacción, con la tasa relativa de acumulación del producto de PCR actuando como lectura, este método divide la muestra inicial en miles de gotitas individuales, compartimentando así las moléculas de ADN de la muestra en reacciones espacialmente separadas12. La reacción de PCR posterior procede en cada gota individual, y el producto de PCR solo se acumula en gotitas que contienen el ADN objetivo. El resultado de esta reacción es una salida digital en forma de un conjunto de gotitas que contienen una copia del ADN objetivo y el producto de PCR amplificado, o no contienen ADN objetivo. Usando sondas de ADN fluorescente o un tinte de unión de ADN de doble cadena (ds), se pueden contar las gotas que contienen producto amplificado, y la proporción de gotas "positivas" a "negativas" se puede usar para calcular el número absoluto de copias de ADN que estaban presentes en la muestra inicial. Esta medición absoluta, a diferencia de la medición relativa adquirida de una reacción de qPCR, es el factor clave que permite utilizar esta metodología para la medición precisa del número de copias de ADNmt y la heteroplasmia en células individuales11, y varios estudios recientes ya han utilizado la tecnología de PCR de generación de gotas para este propósito13,14 . Este artículo presenta un método para medir el número de copias de ADNmt y la heteroplasmia de deleción en células individuales de tejido humano y de ratón.

<table><tbody><tr><td>Solución 50% Tween-20</td><td>Novex</td><td>3005</td><td></td></tr><tr><td>Aceite generador de gotas automatizado&nbsp;</td><td>Bio Rad</td><td>1864110</td><td>Formulación comercial de aceite utilizada para generar la emulsión de aceite/gota (utilizada en el Paso 4.1 del Protocolo)</td></tr><tr><td>Máquina de PCR C1000 con bloque de pozo profundo</td><td>Bio Rad</td><td>1851197</td><td>termociclador de PCR equipado con un bloque de calentamiento de pozo profundo, utilizado para la lisis celular (Paso de protocolo 2.1.2.) y el ciclo de PCR (Paso de protocolo 5)</td></tr><tr><td>Bloque de enfriamiento de placa de recolección</td><td>Bio Rad</td><td>12002819</td><td>Bloque de enfriamiento que mantiene las muestras refrigeradas durante la generación de gotas (utilizado en el paso 4.3 del Protocolo)</td></tr><tr><td>ddPCR placas de 96 pocillos&nbsp;</td><td>Bio Rad</td><td>12001925</td><td>puntas de pipeta de placas de 96 pocillos diseñadas para su uso en el generador de gotas QX200 AutoDG, utilizadas para la preparación de muestras (paso de protocolo 3.4) y la recolección de gotas (paso de protocolo 4.3)</td></tr><tr><td>ddPCR aceite de lector de gotas&nbsp;</td><td>Bio Rad</td><td>1863004</td><td>Formulación comercial de aceite utilizada por el lector de gotas (utilizada en el paso 6.1 del protocolo)</td></tr><tr><td>ddPCR Supermix para sondas (sin dUTP)</td><td>Bio Rad</td><td>1863023</td><td>Supermix comercial para uso en experimentos de ddPCR que utilizan sondas (utilizada en el paso 3.3 del protocolo)</td></tr><tr><td>Cartuchos generadores de gotas automatizados DG32&nbsp;</td><td>Bio Rad</td><td>1864108</td><td>Cartuchos microfluídicos utilizados en el generador de gotas QX200 AutoDG para generar la emulsión de aceite/gota (utilizados en el paso 4.3 del protocolo)</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td>Suero fetal bovino calificado</td></tr><tr><td>Cubiertas de placas de aluminio&nbsp;</td><td>Bio Rad</td><td>1814040</td><td>Cubiertas de placas de aluminio utilizadas para sellar las placas de recolección de gotas después de la generación de gotas (utilizadas en el paso 4.6 del protocolo)</td></tr><tr><td>Células HEK 293T</td><td>Takara</td><td>632180</td><td>Subclon comercial de la línea celular de riñón embrionario humano transformado, HEK 293, que expresa las células HeLa del antígeno SV40 Large-T</td></tr><tr><td></td><td>ECACC</td><td>93021013</td><td>Células de carcinoma epiteloide de cuello uterino humano</td></tr><tr>DMEM Gibco<td>de alta glucosa</td><td></td><td>13345364</td><td>4,5 g/L de D-glucosa, con L-glutamina y piruvato de sodio</td></tr><tr><td>Cíbridos humanos</td><td>Fibroblastos embrionarios de ratón de la Universidad de Miami</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Universidad de Newcastle</td><td>Inmortalizado a partir de ratones</td><td></td>C57Bl/6</tr><tr><td>Agua sin nucleasas</td><td>Sellos</td> de placa PCR Ambion <td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>Pierce</td><td></td><td>SP-0027</td><td>Sellos de placa adhesiva transparente, solo se usan antes de la generación de gotas (se debe usar el sello de aluminio en el paso 4.6)</td></tr><tr><td>Contenedores de basura con punta de pipeta</td><td>Bio Rad</td><td>1864125</td><td>Contenedor de recolección desechable utilizado para recoger puntas desechadas en el generador de gotas QX200 AutoDG (utilizado en el paso de protocolo 4.3)</td></tr><tr><td>Puntas de pipeta para el sistema AutoDG&nbsp;</td><td>Bio Rad</td><td>1864120</td><td>Puntas de pipeta filtradas diseñadas para su uso en el generador de gotas QX200 AutoDG (utilizado en el paso 4.3 del protocolo)</td></tr><tr><td>Células primarias de fibroblastos dérmicos humanos Imprimaciones</td>/sondas <td>del Biobanco</td><td></td><td></td>Newcastle</tr><tr><td></td><td>IDT</td><td>N/A</td><td>Las secuencias exactas del cebador/sonda dependerán del ensayo. Los cebadores y sondas utilizados en este estudio se dan en la Tabla 1</td></tr><tr><td>Solución de proteinasa K 20 mg/mL</td><td>Ambion</td><td>AM2546</td><td></td></tr><tr><td>PX1 Sellador de placas PCR</td><td>Bio Rad</td><td>1814000</td><td>Aplica sellos de aluminio a las placas de muestra ddPCR después de la generación de gotas (utilizado en el paso 4.6 del protocolo)</td></tr><tr><td>Software QX Manager</td> Bio <td>Rad</td><td>12012172</td><td>Software de configuración y análisis del lector de gotas (utilizado en los pasos 6 y 7 del protocolo)</td></tr><tr><td>QX200 Generador de gotas AutoDG</td><td>Bio Rad</td><td>1864101</td><td>Generador de gotas microfluídico automatizado (utilizado en el Paso 4 del Protocolo)</td></tr><tr><td>Lector de gotas QX200</td><td>Bio Rad</td><td>1864003</td><td>Lector de gotas (utilizado en el Paso 6 del Protocolo)</td></tr><tr><td>Cristales preestablecidos Trizma pH 8.3</td><td>Sigma</td><td>T8943-100G</td><td></td></tr></tbody></table>

medición del número de copias de adn mitocondrial unicelular y la heteroplasmia mediante la reacción en cadena de la polimerasa de gotitas digitales

Measuring Single-Cell Mitochondrial DNA Copy Number and Heteroplasmy Using Digital Droplet Polymerase Chain Reaction

El ADN mitocondrial (mt) de mamíferos es una molécula de ADN intramitocondrial pequeña, circular, de doble cadena, que codifica 13 subunidades de la cadena de transporte de electrones. A diferencia del genoma nuclear diploide, la mayoría de las células contienen muchas más copias de ADNmt, que van desde menos de 100 a más de 200.000 copias dependiendo del tipo de célula. El número de copias de ADNmt se utiliza cada vez más como biomarcador para una serie de afecciones y enfermedades degenerativas relacionadas con la edad y, por lo tanto, la medición precisa del número de copias de ADNmt se está convirtiendo en una herramienta clave tanto en entornos de investigación como de diagnóstico. Las mutaciones en el ADNmt, que a menudo ocurren como polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) o deleciones, pueden existir en todas las copias del ADNmt dentro de la célula (denominada homoplasmia) o como una mezcla de copias mutadas y WT de ADNmt (denominadas heteroplasmia). Las mutaciones heteroplásmicas de ADNmt son una causa importante de patología mitocondrial clínica, ya sea en enfermedades raras o en un número creciente de enfermedades comunes de aparición tardía, como la enfermedad de Parkinson. La determinación del nivel de heteroplasmia presente en las células es un paso crítico en el diagnóstico de enfermedades mitocondriales raras y en la investigación dirigida a comprender los trastornos comunes de aparición tardía donde las mitocondrias pueden desempeñar un papel. El número de copias de ADNmt y la heteroplasmia se han medido tradicionalmente mediante ensayos cuantitativos (q)PCR o secuenciación profunda. Sin embargo, la reciente introducción de la tecnología ddPCR ha proporcionado un método alternativo para medir ambos parámetros. Ofrece varias ventajas sobre los métodos existentes, incluida la capacidad de medir el número absoluto de copias de ADNmt y la sensibilidad suficiente para realizar mediciones precisas de células individuales incluso con números bajos de copias. Aquí se presenta un protocolo detallado que describe la medición del número de copias de ADNmt en células individuales utilizando ddPCR, denominado PCR de generación de gotas en adelante, con la opción de medición simultánea de heteroplasmia en células con deleciones de ADNmt. También se discute la posibilidad de ampliar este método para medir la heteroplasmia en células con SNP de ADNmt.

Después de la generación de gotas, una capa transparente de gotas opacas es visible flotando sobre la fase petrolera en cada pozo (Figura 1B). La formación de gotitas puede verse afectada negativamente por la presencia de detergentes en el lisado de entrada cuando se realizan experimentos en células individuales. Utilizando el protocolo de lisis descrito en 2.1.2., se alcanzan rutinariamente rendimientos de gotitas por encima del nivel recomendado de 10.000, a pesar de la presencia de una pe...

Aquí presentamos un protocolo para medir el número absoluto de copias de ADN mitocondrial (mt) y los niveles de heteroplasmia de deleción de ADNmt en células individuales.

Medición del número de copias de ADN mitocondrial unicelular y la heteroplasmia mediante la reacción en cadena de la polimerasa de gotitas digitales

The mammalian mitochondrial (mt)DNA is a small, circular, double-stranded, intra-mitochondrial DNA molecule, encoding 13 subunits of the electron ...

Este protocolo se puede utilizar para medir con precisión el número de copias de ADN mitocondrial presentes en células individuales y el nivel de ciertos tipos de mutación del ADN mitocondrial. Los métodos anteriores pueden realizar con precisión estas mediciones en muestras de tejido que contienen muchas células. La principal ventaja de esta técnica es que podemos hacer las mismas mediciones en células individuales.Este método es particularmente útil para aquellos que estudian las mitocondrias y tendrá amplias aplicaciones en este campo. El aislamiento efectivo y la lisis de células individuales es clave para esta técnica. La experiencia previa con la clasificación de células individuales sería muy útil.Para comenzar, prepare la mezcla maestra para la PCR sin la muestra de ADN en hielo, como se describe en el texto. Después del vórtice brevemente, distribuya el volumen requerido de la mezcla maestra preparada a cada pocillo de una placa de 96 pocillos PCR de generación de gotas, organizando las muestras en columnas completas. A continuación, agregue la mezcla maestra a cualquier pozo vacío en columnas incompletas para usarlas como controles que no sean de plantilla.Luego agregue el ADN de entrada a cada pozo para hacer que el volumen total de cada pozo sea de 22 microlitros. Selle la placa con un sello adhesivo y colóquela en un agitador a 2000 RPM durante un minuto. Luego centrifugar la placa a 1000 veces G durante un minuto a cuatro grados centígrados antes de colocarla en hielo.Para la generación de gotas, primero asegúrese de que el generador de gotas esté encendido y verifique si una botella de aceite generador de gotas está cargada en la posición E de la plataforma de instrumentos. A continuación, haga clic en Configurar placa de muestra en la pantalla táctil. Después de seleccionar todas las columnas de la placa de muestra que contienen las muestras o espacios en blanco, haga clic en Aceptar para confirmar la configuración de la placa.A continuación, cargue los cartuchos del generador de gotas en la posición B en la plataforma de instrumentos para que todas las luces se vuelvan verdes y coloque un canal de residuos de punta vacío en la posición C. Luego cargue las cajas de puntas del filtro con las tapas retiradas para colocar D en el escenario de instrumentos para que todas las luces se vuelvan verdes. A continuación, retire el sello adhesivo antes de cargar la placa de muestra para colocar F de la plataforma de instrumentos para que la luz se vuelva verde. También cargue una placa vacía de recolección de gotas de 96 pocillos colocada en un bloque frío, preenfriada a menos 20 grados centígrados, en la posición G para que la luz se vuelva verde.Haga clic en Iniciar generación de gotas en la pantalla táctil del instrumento y la tapa del generador de gotas se cerrará automáticamente. Una vez que se complete la generación de gotas, verifique visualmente la placa de recolección de muestras para confirmar que hay una capa de emulsión de gotas por encima de la fase de aceite en cada pozo. A continuación, encienda el sellador de placas y ajuste la temperatura a 180 grados centígrados y el tiempo de sellado a cinco segundos.Permita que la máquina alcance la temperatura de funcionamiento. Luego coloque la placa de recolección de muestras en el soporte de la placa del sellador de placas y coloque un sello de aluminio nuevo en la parte superior de la placa con la línea roja hacia arriba. Cuando el sellador de placas haya alcanzado su temperatura de funcionamiento, pulse expulsar en la pantalla táctil del instrumento.Después de colocar el soporte de la placa en el cajón del sellador de placas, presione el sello para cerrar el cajón. Una vez que se complete el sellado, el cajón se abrirá automáticamente. Retire la placa sellada y colóquela sobre el bloque frío.Luego apague el sellador de placas. Para ejecutar la PCR, coloque la placa de recolección de gotas sellada en una máquina de PCR con un bloque de pozo profundo de 96. Una vez completada la PCR, encienda el lector de gotas y la computadora conectada.Cargue la placa con las muestras post-PCR en el soporte de la placa del lector de gotas. Mientras mantiene la tapa de aluminio en la placa de muestra, coloque la cubierta en la parte superior del soporte y asegúrela en su lugar con clips de bloqueo negros. A continuación, para abrir la tapa del lector de gotas, presione el botón de abrir/cerrar.Luego cargue el soporte de la placa del lector de gotas con la placa de muestra en la cámara del lector y colóquela de forma segura sobre la base magnética. Vuelva a pulsar el botón de apertura/cierre para cerrar la tapa. Abra la interfaz del software de análisis.Seleccione la pestaña Agregar placa, haga clic en Agregar placa y, a continuación, en Configurar placa. En la pestaña Información de placa, ingrese un nombre de placa, seleccione Supermix for Probes, No DUTP en el menú desplegable Supermix e ingrese un nombre de archivo en Save Data File As.In la pestaña Well Selection (Selección de pozos), resalte los pozos que se analizarán y haga clic en Include Selected Wells (Incluir pozos seleccionados). Luego, en la pestaña Información del pozo, seleccione los pozos que desea anotar.Seleccione Cuantificación directa en el menú desplegable Tipo de experimento. A continuación, rellene los cuadros Descripción de muestra, Tipo de muestra y Nombre de destino, y agregue notas de pozo o notas de placa según sea necesario. A continuación, haga clic en Aplicar.Una vez completada la configuración de la placa, haga clic en Iniciar ejecución. Para el análisis de resultados, seleccione la ficha Análisis de datos y abra el archivo que se va a analizar en el menú Mis archivos de datos. A continuación, haga clic en la ficha Amplitud 1D para experimentos de un solo color o en la ficha Amplitud 2D para experimentos de dos colores.A continuación, seleccione los pozos que requieren umbral. Utilice la herramienta Modo de línea de umbral para aplicar manualmente el umbral en el espacio libre entre las poblaciones positiva y negativa en la gráfica de amplitud, asegurándose de que la cruz se coloque de tal manera que las cuatro poblaciones de gotas estén claramente separadas. Una vez aplicado el umbral para todas las muestras, exporte los resultados como un archivo csv para su posterior análisis haciendo clic en la pestaña Tabla de datos, Importar/Exportar y seleccionando Exportar datos visibles a CSV.Introduzca un nombre de archivo adecuado y haga clic en Guardar. Los procedimientos de PCR y lectura de gotitas utilizados en este protocolo demostraron la presencia de poblaciones claramente separadas de gotitas positivas y negativas, tanto en los canales fam como hexadecimal. Las poblaciones de ADN mitocondrial positivas para ambas sondas también podrían distinguirse de los lisados unicelulares.Este método también mostró que para las muestras con deleciones en el ADN mitocondrial, está presente una población mixta de gotitas doblemente positivas y gotitas positivas solo para la porción no eliminada del ADN. Este método se ha utilizado con éxito para contar el número de copias de ADN mitocondrial por célula en una variedad de células de mamíferos, incluidos ovocitos de ratón y células embrionarias primarias de ratón. Además, en células con heteroplasmia de alta deleción, se encontró que la población positiva para una sola sonda era significativamente mayor que la población doble positiva.Sin embargo, en células con heteroplasmia de baja deleción, ambas poblaciones eran de tamaño similar. Por lo tanto, los resultados precisos siempre aseguran que la generación de gotas haya sido exitosa y que el umbral se haya aplicado adecuadamente utilizando la vista de amplitud 1D o 2D. El lisado no utilizado se puede usar para otros ensayos de células individuales, como la pirosecuenciación, que puede medir la heteroplasmia de polimorfismo de nucleótido único.El desarrollo de esta técnica nos ha permitido realizar mediciones precisas del número de copias de ADN mitocondrial y la heteroplasmia de deleción en células individuales, lo que antes no era posible.

measuring-single-cell-mitochondrial-dna-copy-number-heteroplasmy

Research

Investigación

JoVE Journal

Medicine

Medicina

En este video, presentamos un procedimiento paso a paso para generar nano-gotas emulsionadas para detectar ácidos nucleicos objetivo mediante la reacción en cadena de la polimerasa digital o dPCR.

Reacción en cadena de la polimerasa digital en gotasas: un método para generar reacciones de PCR con nanogotas para detectar mutaciones tumorales raras

En este video, demostramos la técnica de PCR digital dúplex (ddPCR), una modificación de la técnica de PCR tradicional que es útil para detectar dos marcadores genéticos diferentes simultáneamente. Una sola reacción de PCR se divide en gotas emulsionadas del tamaño de un nanolitro que se amplifican de forma independiente, y la detección de señales de amplificación de fluorescencia de diferentes colores a partir de la fracción de gotas se utiliza para calcular la concentración inicial de las...

PCR digital dúplex para la cuantificación simultánea de marcadores genéticos duales

Este video demuestra la técnica de reacción en cadena de la polimerasa por gotas multiplex para la cuantificación simultánea de regiones de ADN metiladas en diferentes poblaciones de glóbulos blancos como biomarcador temprano para el diagnóstico clínico y el pronóstico.

Reacción en cadena de la polimerasa por gotas multiplex para detectar la metilación del ADN en leucocitos

Se describe un método sensible y preciso para la cuantificación de microRNAs libres de células utilizando una química basada en colorantes y tecnología de PCR digital en gotas.

Que circula MicroARN Cuantificación Usando ADN vinculante tinte Química y gotita de PCR digital

Aquí describimos un método favorable para cuantificar simultáneamente y ribonucleótidos del mapa del genoma de ADN altamente intacto en la resolución del solo-nucleótido, combinando hendidura enzimática del ADN genómico con hidrólisis alcalina y posterior 5´-final secuencia.

Asignación simultánea y la cuantificación de ribonucleótidos en el ADN mitocondrial humano

Aquí, presentamos un protocolo para permitir la cuantificación exacta de la metilación de la DNA (mtDNA) mitocondrial. En este protocolo, describimos una digestión enzimática del ADN con BamHI juntada con una tubería de análisis bioinformáticos que se puede utilizar para evitar la sobreestimación de los niveles de metilación de mtDNA causada por la estructura secundaria del ADNmt.

Metodología para la detección exacta de la metilación del ADN mitocondrial

Aquí, presentamos un protocolo para cuantificar con precisión múltiples alteraciones genéticas de una región de destino en una sola reacción usando ddPCR de bajada y un único par de sondas de hidrólisis.

Reacción en cadena polimerasa Digital sola gota para la detección integral y simultánea de mutaciones en las regiones de Hotspot

Los marcadores epigenéticos se utilizan para la subtipificación de glóbulos blancos (CMB) mediante la cuantificación de los patrones de metilación del ADN. Este protocolo presenta un método de reacción en cadena de la polimerasa de gotas múltiples (mdPCR) utilizando un dispositivo microfluídico basado en elastómero termoplástico (TPE) para la generación de gotas que permite la cuantificación objetivo precisa y múltiplex específica de metilación de los recuentos diferenciales del CMB.

Metilización Específica Multiplex Droplet PCR usando el Dispositivo Generador de Gotas de Polímero para Diagnóstico Hematológico

Los ensayos de pirosecuenciación permiten el genotipado robusto y rápido de polimorfismos de nucleótido único de ADN mitocondrial en células o tejidos heteroplásmicos.

Genotipado de polimorfismos de nucleótido único en el genoma mitocondrial mediante pirosecuenciación

Se describe un procedimiento para estudiar la dinámica del metabolismo del ADN mitocondrial (ADNmt) en las células utilizando un formato de placa de múltiples pocillos e imágenes de inmunofluorescencia automatizadas para detectar y cuantificar la síntesis y distribución del ADNmt. Esto se puede utilizar aún más para investigar los efectos de varios inhibidores, tensiones celulares y silenciamiento génico en el metabolismo del ADNmt.

Cuantificación basada en imágenes de alto rendimiento de la síntesis y distribución del ADN mitocondrial

Este estudio presenta un método rápido de ddPCR para cuantificar la biomasa microbiana del suelo y las proporciones entre hongos y bacterias. Aunque el carbono microbiano derivado de ddPCR muestra solo una correlación débil con las estimaciones de fumigación con cloroformo, el método proporciona un enfoque molecular sensible y escalable para evaluar la abundancia microbiana sin muestreos adicionales del suelo ni el uso de métodos agresivos.

Determinación de biomasa microbiana en suelo mediante PCR digital de gotas (ddPCR)

Aprende a medir el número de copias de ADN mitocondrial y la heteroplasmia por deleción en células individuales mediante PCR de gotitas digitales. Este método preciso beneficia la investigación de función mitocondrial.

Medición del número de copias de ADN mitocondrial unicelular y la heteroplasmia mediante la reacción en cadena de la polimerasa de gotitas digitales (Video) | JoVE Journal

Medición del número de copias de ADN mitocondrial unicelular y la heteroplasmia mediante la reacción en cadena de la polimerasa de gotitas digitales

Explorar más videos