Name: Generación de esferas 3D y cultivos de interfaz aire-líquido 2D de células epiteliales alveolares pluripotentes inducidas por humanos derivadas de células madre pluripotentes de tipo 2 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 2 s
Description: Aprende a generar esferas 3D y cultivos de interfase aire-líquido con células epiteliales alveolares tipo 2 derivadas de iPSC humanas. Este método permite investigar la biología pulmonar en homeostasis y enfermedad.

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Agradecemos sinceramente a los miembros de los laboratorios Wilson, Kotton y Hawkins por sus útiles discusiones. También estamos muy agradecidos a Greg Miller (CReM Laboratory Manager) y Marianne James (iPSC Core Manager) por su invaluable apoyo. Agradecemos a Brian Tilton y al BumC Flow Cytometry Core por su asistencia técnica con la clasificación celular (respaldada por la subvención de los NIH #1S10OD021587-01A1). Este trabajo fue apoyado por una beca CJ Martin Early Career Fellowship del Consejo Nacional de Salud e Investigación Médica de Australia otorgada a RBW; Subvención de los NIH F30HL147426 a KMA; un Premio al Investigador Junior I.M. Rosenzweig de la Fundación de Fibrosis Pulmonar y un Premio de Subvención Piloto Integrada a través del Instituto de Ciencias Clínicas y Traslacionales de la Universidad de Boston (1UL1TR001430) a KDA; Fundación Nacional Suiza para la Ciencia (P2ELP3_191217) a ABA; NIH otorga U01HL148692, U01HL134745, U01HL134766 y R01HL095993 a DNK; y las subvenciones de los NIH U01TR001810, R01DK101510 y R01DK117940 otorgadas a AAW; El mantenimiento, la banca y el uso compartido de iPSC están respaldados por la subvención NO1 75N92020C00005 de los NIH. La figura 1 se creó utilizando Biorender.com.

Todos los experimentos que involucran la diferenciación de líneas iPSC humanas se realizaron de acuerdo con la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Boston (protocolo H33122). Los fibroblastos dérmicos, adquiridos para su reprogramación a iPSC, se obtuvieron de un donante con consentimiento informado por escrito, bajo la aprobación de la Oficina de Protección de Investigación Humana de la Facultad de Medicina de la Universidad de Washington, St. Louis, MO. Se generaron iPSC reprogramados en el Centro de Medicina Regenerativa de la Universidad de Boston y el Centro Médico de Boston, Boston, MA.
1. Disociación de la alveoloesfera
<ol><li>Preparar medios de diferenciación completos sin suero (cSFDM) según la composición mencionada en la Tabla 1.</li>
	<li>Prepare los medios CK + DCI en la base cSFDM preparada según la Tabla 2.</li>
	<li>Descongelar la matriz 2D (calificada para células madre embrionarias humanas) y / o 3D (factor de crecimiento reducido) en hielo según sea necesario para las necesidades experimentales.</li>
	<li>Aspirar todo el medio CK + DCI utilizando una pipeta o pipeta aspiradora con vacío de las gotas de la matriz 3D que contienen alveoloesferas, derivadas de la diferenciación dirigida19, en una placa de 12 pocillos.</li>
	<li>Añadir 1 ml de dispasa (2 mg/ml) por gota. Pipetee suavemente la gota en la dispasa usando una pipeta P1000. Incubar a 37 °C durante 1 h, pipeteando hacia arriba y hacia abajo una vez después de 30 min.</li>
	<li>Transfiera los organoides disociados (del paso 1.5) de una gota de matriz en la dispasa a un tubo cónico de 15 ml. Para lavar, agregue 10 ml del Medio Dulbecco Modificado de Iscove (IMDM, ver Tabla de Materiales).</li>
	<li>Centrifugar a 300 x g durante 5 min a temperatura ambiente. Aspire el sobrenadante usando una pipeta o aspirando pipeta con vacío, dejando el menor sobrenadante posible. NOTA: Es importante eliminar toda la dispasa, ya que cualquier dispasa restante puede disolver la matriz en la que posteriormente se sembrarán las células. Si se ve una neblina clara sobre el pellet, la dispasa no ha disuelto completamente la matriz, y se puede agregar más dispasa al pellet durante otros 20-30 min a 37 ° C.</li>
	<li>Resuspend las células en 1 ml de tripsina al 0,05% por gota y transferir de nuevo a la placa de 12 pocillos. Incubar a 37 °C durante 12-15 min. Observe la disociación bajo un microscopio. Evite el exceso de pipeteo de las células en esta etapa. NOTA: Al final de la incubación, las células necesitan lograr una suspensión de una sola celda después de pipetear 3-5 veces con una pipeta P1000. Para el paso de iAT2 a ALI (Paso 3), el tiempo de tripsinización debe minimizarse (máximo 12 min), de modo que las células estén en grupos de 2-3 células en lugar de suspensión de una sola célula cuando estén listas para el revestimiento en el inserto de cultivo celular.</li>
	<li>Detenga la acción de la tripsina con un volumen igual de medio que contenga FBS (10% de FBS calificado por ES en DMEM). Centrifugar a 300 x g durante 5 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lavar las células con 10 ml de IMDM. Centrifugar a 300 x g durante 5 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Vuelva a suspender las celdas en un volumen apropiado para contar y, a continuación, cuente las células con un hemocitómetro (consulte la Tabla de materiales). NOTA: De una gota de matriz confluente de 50 μL sembrada a 400 células/μL, el rendimiento esperado es de 500.000 a 1,5 x 106 células por gota.</li>
	<li>Utilice la suspensión unicelular de células iAT2 para generar alveoloesferas mediante el recubrimiento en la matriz 3D (Paso 2) y/o el recubrimiento en insertos de cultivo celular para cultivo ALI (Paso 3).</li>
</ol>2.3D de iAT2s
<ol><li>Después de contar (Paso 1.11), determine el número de células deseadas para replatar en la matriz 3D (400 células/μL de la matriz con 50-100 μL de gotas de matriz 3D por pocillo de una placa de 12 pocillos). Centrifugar las células a 300 x g durante 5 min a temperatura ambiente. Retire la mayor cantidad posible de sobrenadante con una pipeta.</li>
	<li>Resuspendir las celdas en la matriz 3D. Resuspenda rápidamente y en hielo, si es necesario, para evitar que la matriz se polimerice (lo que ocurre cuando está caliente).</li>
	<li>Use una pipeta P200 para dispensar una gota de matriz 3D por pozo en una placa de 12 pocillos precalentada. Pipete con cuidado para evitar la creación de burbujas en la gota de la matriz. No permita que la suspensión celular se asiente mientras dispensa múltiples gotas.</li>
	<li>Coloque la placa en una incubadora de 37 °C durante 20-30 minutos para permitir que las gotas de la matriz se polimericen.</li>
	<li>Agregue 1 ml de CK + DCI + 10 μM de medio Y-27632 (ver Tabla de materiales) por pozo para cubrir la gota de matriz.</li>
	<li>Después de 72 h, cambie el medio a CK + DCI sin 10 μM de Y-27632.</li>
	<li>Reemplace el medio con CK + DCI fresco cada 48-72 h. NOTA: Los iAT2 generalmente deberán pasarse aproximadamente cada 10-14 días, dependiendo de la línea celular y la densidad de revestimiento.</li>
</ol>3. Paso de iAT2 a ALI
<ol><li>Prepare insertos de cultivo celular de 6,5 mm recién recubiertos 1 h antes de su uso diluyendo la matriz 2D en la mezcla de medio/nutriente F-12 (DMEM/F12) Modified Eagle de Dulbecco a una solución de trabajo según las instrucciones del fabricante para la matriz 2D (consulte la Tabla de materiales). Luego, agregue 100 μL de la matriz diluida por inserto de cultivo celular de 6.5 mm. Deje polimerizar la matriz en una incubadora de 37 °C durante 30 min o a temperatura ambiente durante 1 h.</li>
	<li>Aspire el exceso de matriz de los insertos de cultivo celular utilizando una pipeta o pipeta aspiradora con vacío y enjuague una vez con DMEM/F12. Aspire este lavado inmediatamente antes de agregar las células.</li>
	<li>Después de contar, determine el número de células requeridas para sembrar el número deseado de células en los insertos de cultivo (520,000 células vivas / cm2, equivalente a 172,000 células vivas por inserto de cultivo celular de 6.5 mm). Centrifugar las células a 300 x g durante 5 min a temperatura ambiente. Retire la mayor cantidad posible de sobrenadante.</li>
	<li>Resuspendir las células en el volumen apropiado para sembrar con 100 μL de CK + DCI + 10 μM Y-27632 por inserto de cultivo celular (la suspensión celular debe ser de 1.720 células/μL). Añadir 100 μL al compartimento apical del inserto de cultivo celular. Agitar suavemente la placa en un patrón cruzado para garantizar una distribución uniforme de las células a través del inserto de cultivo celular, y confirmar esto verificando bajo un microscopio en el objetivo 4x. NOTA: La densidad de siembra es crítica y puede requerir optimización, que oscila entre 160,000 y 300,000 células por inserto de cultivo celular de 6.5 mm. El colorante permeable a las células verde calceína (ver Tabla de Materiales) se puede agregar a las células y se puede ver en un microscopio fluorescente invertido para visualizar las células después de la siembra.</li>
	<li>Añadir 500 μL de CK + DCI + 10 μM de Y-27632 al compartimento basolateral de cada inserto de cultivo celular.</li>
	<li>Aspirar apical CK + DCI + 10 μM de Y-27632 medio 48 h después de la siembra utilizando una pipeta para iniciar ALI (conocido como "air-lift"). NOTA: Las celdas deben ser 100% confluentes en este punto. Si las celdas no son 100% confluentes, los pasos 3.7-3.8 aún deben realizarse en los puntos de tiempo indicados; las monocapas de células confluentes pueden tardar más en formarse.</li>
	<li>Cambie el CK basolateral + DCI + 10 μM del medio Y-27632 después de 72 h a CK + DCI sin 10 μM Y-27632. NOTA: Debe haber una "fuga" mínima, si es que hay alguna, del medio al lado apical. Sin embargo, si esto ocurre en los primeros días, continúe aspirando el lado apical diariamente hasta que no haya más fugas.</li>
	<li>Reemplace el medio basolateral con CK + DCI fresco cada 48-72 h. NOTA: Los iAT2 utilizados en los cultivos ALI se maduran al máximo a los 5-14 días después del emplatado.</li>
	<li>Mantenga las células con un monitoreo cuidadoso durante un máximo de 28 días después del revestimiento, si es necesario, para una experimentación más prolongada. NOTA: Se pueden observar signos visibles de falla de ALI, como el descamación de las células lejos del borde del inserto o la formación de agujeros en la monocapa, después de un tiempo sobreextendido en cultivo, momento en el cual el ALI ya no es utilizable para experimentos.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Los AT2 mantienen la homeostasis pulmonar, y la disfunción de estas células alveolares clave puede causar y resultar de diversas enfermedades pulmonares. Debido a la dificultad de acceder y aislar at2 humanos primarios, se generan iAT2. Al aplicar los métodos de diferenciación dirigida descritos en otra parte25 y la expansión y siembra celular descritas aquí, las iPSC generadas a partir de cualquier individuo pueden diferenciarse en iAT2 sólidamente autorrenovables, proporcionando así células específicas del paciente para la investigación biomédica, incluidos los estudios de desarrollo de investigación biomédica básica, el modelado de enfermedades, las terapias basadas en células o las pruebas de detección de medicamentos. El presente protocolo detalla un método para disociar iAT2s a una suspensión unicelular, que luego puede ser replatada en Matrigel 3D para generar alveolosferas para la expansión celular o replatada en cultivo 2D ALI para experimentos posteriores.
El protocolo tiene varios pasos críticos para garantizar el paso y el rechapado exitosos en las culturas 3D y ALI. La trituración mecánica debe minimizarse, ya que el pipeteo excesivo puede disminuir la viabilidad de la célula. Además, la densidad de siembra de iAT2s en cultivos ALI 3D y 2D es crítica; para el cultivo 3D, en general, 400 células/μL de Matrigel 3D es óptimo para la mayoría de las líneas iPSC. Sin embargo, un rango de densidades de 100-500 células / μL, a veces, ha tenido éxito, y la optimización de la densidad puede ser necesaria para diferentes líneas celulares. Para el cultivo de ALI, la optimización de la densidad de siembra de iAT2s en los insertos de cultivo celular también es esencial para lograr una monocapa confluente de células 48 h después de la siembra (es decir, el día de la elevación de aire). Algunas líneas iAT2 requieren más celdas por inserto; por lo tanto, si se requiere la solución de problemas, se recomienda un rango de 160,000-300,000 celdas / inserto para insertos de cultivo celular de 24 pocillos. Los cultivos 3D también se pueden escalar a placas de 24 y 48 pocillos manteniendo la densidad de siembra en 400 células / μL de matriz 3D y reduciendo el tamaño de la gota de matriz a 25 μL y 20 μL, respectivamente. Los cultivos ALI se pueden escalar a insertos de cultivo celular de 96 pocillos recubriendo cada inserto con 30 μL de la matriz, chapando 80,000 células en 30 μL por inserto y alimentándose con 150 μL de medios basolaterales por pozo. La densidad de siembra y los volúmenes de matriz y medios deben escalarse y optimizarse en consecuencia para otros formatos de placas.
Una limitación de este protocolo es que las células utilizadas para el recubrimiento ali tienen que estar lo suficientemente purificadas para ser NKX2-1+ y SFTPC+19,20,21,23 para formar iAT2 ALIs, y la formación de cultivos ALI puede variar de una línea a otra. Además, este protocolo permite la expansión y generación de cultivos solo AT2, proporcionando un sistema modelo reduccionista basado en un único tipo de célula alveolar clave. Es importante destacar que otros tipos de células alveolares relevantes, como las células alveolares tipo 1, faltaban en estas plataformas. Otros grupos han tenido éxito cultivando AT2 humanos primarios como esferoides o cultivos organotípicos con o sin fibroblastos 1,14,15,16,17; sin embargo, los AT2 humanos primarios tienden a perder su expresión de surfactantes clave cuando se cultivan en cultivo 2D normal sin condiciones ALI26. Además, trabajos recientes han demostrado que los iAT2 expresan marcadores proliferativos más altos y marcadores de maduración AT2 más bajos que los AT2 primarios humanos frescos e incultos27. A pesar de estas diferencias entre los iAT2 y los AT2 humanos primarios frescos, encontramos que incluso los AT2 primarios cultivados mostraron diferencias transcriptómicas con respecto a los AT2 primarios frescos e incultos27, y por lo tanto concluimos que estos modelos in vitro tienen varias fortalezas y limitaciones para modelar la biología pulmonar in vivo.
La plataforma iAT2 se puede aplicar para estudiar mutaciones genéticas a partir de iPSCs derivadas de pacientes19,20. El sistema también podría ampliarse sustancialmente para adaptarse a la detección de drogas de alto rendimiento. Además, las IALE iAT2 son adecuadas para exposiciones ambientales como infecciones virales o bacterianas o exposición al humo del cigarrillo, vapor de cigarrillo electrónico u otros aerosoles23. En resumen, este protocolo para generar cultivos ALI 3D y 2D de iAT2 permite el cultivo a largo plazo de un tipo de célula relevante para la enfermedad y proporciona una plataforma fisiológica y escalable que permite el uso de estas células en muchas aplicaciones.

En el pulmón, las células epiteliales de las vías respiratorias y alveolares son las primeras en encontrar exposiciones ambientales inhaladas, incluidos los patógenos transmitidos a través de aerosoles inhalados y estímulos nocivos como el humo del cigarrillo. Las células epiteliales alveolares tipo 2 (AT2) son esenciales para mantener la homeostasis pulmonar, ya que son los progenitores facultativos del epitelio pulmonar distal, producen surfactantes para aliviar la tensión superficial alveolar y montan la respuesta inmune innata a las exposiciones inhaladas 1,2. Sin embargo, la disfunción de AT2 puede ser el resultado de lesiones pulmonares o mutaciones en genes que se expresan selectivamente en AT2, como SFTPC, SFTPB y ABCA3 3,4,5. Los enfoques anteriores para estudiar estas mutaciones genéticas se han basado en modelosde ratón 6 o vectores diseñados que contienen mutaciones introducidos en líneas celulares inmortalizadas7. Por lo tanto, se necesitan plataformas que puedan modelar los efectos de las perturbaciones genéticas y ambientales en los AT2 en los tipos de células fisiológicamente relevantes y en un sistema productivo in vitro para comprender mejor el papel que desempeñan los AT2 en la salud y la enfermedad.
En términos de modelado de exposiciones en el aire, los cultivos de interfaz aire-líquido (ALI) de células epiteliales primarias de las vías respiratorias se han utilizado con éxito para revelar respuestas moleculares clave al humo del cigarrillo8 y para modelar la infección de las vías respiratorias 9,10. Un sistema de cultivo ALI comparable para el epitelio alveolar, un sitio clave de infección o lesión en la enfermedad, está mucho menos desarrollado en comparación con el sistema modelo epitelial de las vías respiratorias. Las líneas celulares inmortalizadas se han cultivado en ALI como un proxy para el epitelio alveolar11,12, pero estas líneas celulares son transcriptómicamente distintas de las células epiteliales alveolares primarias13 y carecen de maquinaria celular clave, como la capacidad de secretar surfactantes o formar uniones estrechas en ALI12. Los AT2 humanos primarios se pueden cultivar en esferas 3D en presencia de fibroblastos1,14, pero están sujetos a limitaciones, incluida la accesibilidad limitada desde los pulmones de explante y su tendencia a senescenciar o perder fenotipo celular en la mayoría de los cultivos hasta la fecha. Estas características presentan barreras para la adopción generalizada de estudios primarios AT2 in vitro, aunque recientemente se han logrado avances en la optimización de cultivos 3D sin alimentación para la expansión de AT2 primarios 15,16,17,18.
Se han desarrollado protocolos de diferenciación dirigida para recapitular in vivo hitos del desarrollo para generar células madre pluripotentes inducidas por humanos (iPSC) derivadas de células epiteliales alveolares (iAT2s)19. Los iAT2 crecen como esferas autorrenovadoras en cultivo libre de suero 3D en un medio definido que contiene CHIR99021, KGF, dexametasona, cAMP y 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX), denominado "CK + DCI"19, en ausencia de alimentadores de fibroblastos y puede cultivarse para pasajes >2020,21. Además, los iAT2 comparten un programa transcriptómico con los AT2 primarios adultos humanos, forman cuerpos lamelares y producen y empaquetan el surfactante 19,21,22. Este protocolo detalla el paso en serie de iAT2 disociando las células a una suspensión de una sola célula. En este punto, los iAT2 se pueden replantear y expandir aún más en cultivo 3D o enchapar en cultivo ALI2D 23. Estos métodos se pueden utilizar para estudiar la biología intrínseca de los AT2 en la homeostasis y la enfermedad 20,22 y para interrogar los efectos de los compuestos o estímulos en una plataforma escalable y fisiológicamente relevante 23,24, como se ha demostrado anteriormente.

<table><tbody><tr><td>3-isobutil-1-metilxantina (IBMX)</td><td>Sigma</td><td>I5879</td><td>para CKDCI</td></tr><tr><td>Placa de cultivo celular de 12 pocillos</td><td>Placas Corning</td><td>3513</td><td>para el cultivo de</td></tr><tr><td>1-Tioglicerol (MTG)</td><td>M6145</td><td>Sigma</td><td>para CKDCI</td></tr><tr><td>2D Matrigel (matriz) - Matrigel Matriz calificada por hESC</td><td>Corning</td><td>8774552</td><td>Para recubrir ALI Transwells</td></tr><tr><td>3D Matrigel (matriz) - Crecimiento Matrigel de factor reducido</td><td>Corning</td><td>356230</td><td>Para cultivar esferas de iAT2 en</td></tr><tr><td>8-bromoadenosina 30,50-monofosfato cíclico sal sódica (cAMP)</td><td>Sigma</td><td>B7880</td><td>para CKDCI</td></tr><tr><td>Ácido ascórbico</td><td>A4544</td><td>Sigma</td><td>para CKDCI</td></tr><tr><td>B27 sin ácido retinoico</td><td>Life Technologies</td><td>12587-010</td><td>para CKDCI</td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA) (7.5%)</td><td>Thermo Fisher</td><td>15260037</td><td>Para CKDCI</td></tr><tr><td>Calcein blue</td><td>Life Technologies</td><td>C1429</td><td>Para la discriminación de vivos/muertos en la citometría de flujo</td></tr><tr><td>Calcein green</td><td>Life Technologies</td><td>C1430</td><td>Visualización opcional de células en el inserto de cultivo celular</td></tr><tr><td>Insertos de cultivo celular - Costar 6,5 mm Clear Transwells con 0,4 y micro; m tamaño de poro</td><td>Millipore-Sigma</td><td>CLS3470-48EA</td><td>ALI transwells</td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Tocris</td><td>4423</td><td>Para CKDCI</td></tr><tr><td>Dexametasona</td><td>Sigma</td><td>D4902</td><td>Para CKDCI</td></tr><tr><td>Dispasa (2 mg/mL)</td><td>Thermo Fisher</td><td>354235</td><td>Para disolver la matrigel</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Thermo Fisher</td><td>11995</td><td>Para realizar la inactivación de tripsina medios (10% FBS en DMEM)</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mix F-12 (DMEM/F12)</td><td>Thermo Fisher</td><td>A4192002</td><td>Para lavar</td></tr><tr><td>la solución salina tamponada con fosfato (PBS) de DulbeccoThermo</td> <td>Fisher</td><td>14190</td><td>Para análisis de citometría de flujo</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS) (Hyclone caracterizado)</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30071.03</td><td>Para fabricar medios de inactivación de tripsina (10% FBS en DMEM)</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td>para CKDCI</td></tr><tr><td>Mezcla de nutrientes F-12 para jamón CKDCI (F12)</td><td>Cellgro</td><td>10-080-CV</td> para <td></td></tr><tr><td>hemocitómetro</td> CKDCI <td>Fisher</td><td>02-671-6</td><td>para recuento de células</td></tr><tr><td>Invivogen&nbsp; Primocina 1 G (50 mg/mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9392943</td><td>para CKDCI</td></tr><tr><td>Medio de Dulbecco modificado de Iscove (IMDM)</td><td>Thermo Fisher</td><td>12440053</td><td>para CKDCI</td></tr><tr><td>Voltohmeter Millicell ERS-2</td><td>Millipore</td><td>MERS00002</td><td>Para medir la resistencia eléctrica transepitelial</td></tr><tr><td>N2 suplemento</td><td>Life Technologies</td><td>17502-048</td><td>para CKDCI</td></tr><tr><td>KGF humano recombinante</td><td>R& D Systems</td><td>251-KG-010</td><td>Para CKDCI</td></tr><tr><td>Ácido retinoico</td><td>Sigma</td><td>R2625</td><td>Para CKDCI</td></tr><tr><td>Azul de tripán</td><td>Thermo Fisher</td><td>15250061</td><td>Para el recuento de células durante el paso</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0.05%)</td><td>Gibco</td><td>25-300-062</td><td>Para disociar esferas iAT2</td></tr><tr><td>Y-27632 diclorhidrato</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td>Agregar a las celdas después del paso</td></tr></tbody></table>

generación de esferas 3d y cultivos de interfaz aire-líquido 2d de células epiteliales alveolares pluripotentes inducidas por humanos derivadas de células madre pluripotentes de tipo 2

Generating 3D Spheres and 2D Air-Liquid Interface Cultures of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Type 2 Alveolar Epithelial Cells

En el pulmón, el epitelio alveolar es una barrera física contra los estímulos ambientales y desempeña un papel esencial en la homeostasis y la enfermedad. Las células epiteliales alveolares tipo 2 (AT2) son los progenitores facultativos del epitelio pulmonar distal. La disfunción y la lesión de los AT2 pueden ser el resultado y contribuir a diversas enfermedades pulmonares. Una mejor comprensión de la biología de AT2 es, por lo tanto, fundamental para comprender la biología pulmonar y la enfermedad; sin embargo, los AT2 humanos primarios son generalmente difíciles de aislar y de suministro limitado. Para superar estas limitaciones, se pueden generar células epiteliales pluripotentes (iPSC) derivadas de células madre pluripotentes inducidas por humanos (iPSC) a través de un protocolo de diferenciación dirigida que recapitula el desarrollo pulmonar in vivo . Los iAT2 crecen en condiciones libres de alimentación, comparten un programa transcriptómico con AT2 primarios adultos humanos y ejecutan funciones clave de AT2 como la producción, el envasado y la secreción de surfactante. Este protocolo detalla los métodos para mantener iAT2 autorrenovadores a través del paso en serie en cultivo tridimensional (3D) o la adaptación de iAT2 a la cultura de interfaz aire-líquido (ALI). Se genera una suspensión unicelular de iAT2s antes del recubrimiento en matriz de membrana basal solubilizada en 3D (en adelante denominada "matriz"), donde se autoensamblan en esferas epiteliales monocapa. Los iAT2 en cultivo 3D se pueden disociar en serie en suspensiones unicelulares para ser pasadas o chapadas en cultivo 2D ALI. En el cultivo ALI, los iAT2 forman una monocapa polarizada con la superficie apical expuesta al aire, lo que hace que esta plataforma sea fácilmente susceptible a las exposiciones ambientales. Por lo tanto, este protocolo genera un suministro inagotable de iAT2, produciendo más de 1 x 1030 células por celda de entrada en 15 pasajes mientras se mantiene el programa AT2 indicado por la expresión de SFTPCtdTomato . Las células resultantes representan una plataforma reproducible y relevante que se puede aplicar para estudiar mutaciones genéticas, modelar exposiciones ambientales o detectar medicamentos.

Los iAT2 se pasaron a una suspensión unicelular y luego se volvieron a colocar en matriz 3D o en 2D en insertos de cultivo celular para cultivo ALI (Figura 1). Después de la disociación unicelular, los iAT2 fueron analizados por citometría de flujo. Brevemente, las células resuspendidas en suero bovino fetal al 1% (FBS) en solución salina tamponada con fosfato (PBS) con colorante de viabilidad azul de calceína (1:1000) se analizaron en un citómetro de flujo, buscando no fragmentos, singletes y tdTomato. Aquí, como ejemplo, está la línea SPC2 (clon SPC2-ST-B220), que tiene un reportero tdTomato dirigido al locus endógeno SFTPC para facilitar la visualización y el seguimiento del programa AT2 a lo largo del tiempo en cultivo (Figura 2A). La expresión de iAT2 SFTPC-tdTomato se mantuvo cuando se volvió a platear en la matriz 3D como esferas (Figura 2B) y cuando se enchapó en insertos de cultivo celular (Figura 2C). La resistencia eléctrica transepitelial (TEER) se puede medir para determinar la integridad del cultivo ALI (Figura 2D). Para medir el TEER, se utilizó un volutmómetro (ver Tabla de Materiales), con 100 μL de medio CK + DCI añadido a la cámara apical. Los insertos de cultivo celular recubiertos con Matrigel en ausencia de células sembradas se trataron como espacios en blanco. Las lecturas se tomaron en tres lugares en cada pozo.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63875/63875fig01v2.jpg"> Figura 1: Representación esquemática del flujo de trabajo del protocolo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63875/63875fig01largev2.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63875/63875fig02.jpg"> Figura 2: Resultados representativos del protocolo. (A) Resultados representativos de la citometría de flujo para SFTPC-tdTomato en células madre pluripotentes derivadas de células madre pluripotentes tipo 2 inducidas por humanos (iAT2s) cultivadas en 3D. El control negativo mostrado es el endodermo no pulmonar (CD47lo). (B) Imágenes representativas de células vivas de iAT2 cultivados en 3D en varios días después del paso (dpp) (SFTPC-tdTomato, barra de escala = 50 μm). (C) Imágenes representativas de células vivas de iAT2 chapados en la interfaz aire-líquido (SFTPC-tdTomato, barra de escala = 500 nm). (D) Resistencia eléctrica transepitelial representativa de iAT2 chapados en la interfaz aire-líquido. n = 3, las barras de error indican desviación estándar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63875/63875fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Reactivos</td>
			<td>Volumen para 500 mL</td>
			<td>Concentración final</td>
		</tr>
<tr>
<td>Medio modificado de Dulbecco de Iscove (IMDM)</td>
			<td>375 ml</td>
			<td>75%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mezcla de nutrientes F-12 del jamón (F12)</td>
			<td>125 ml</td>
			<td>25%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Suplemento B-27 (con AR)</td>
			<td>5 ml</td>
			<td>1%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Suplemento N-2</td>
			<td>2,5 ml</td>
			<td>0.50%</td>
		</tr>
<tr>
<td>BSA (7,5% de acciones)</td>
			<td>3,3 ml</td>
			<td>0.05%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Primocina (50 mg/ml de caldo)</td>
			<td>1 ml</td>
			<td>100 μg/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>Glutamax (100x stock)</td>
			<td>5 ml</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ácido ascórbico (50 mg/ml de caldo)</td>
			<td>500 μL</td>
			<td>50 μg/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>1-Tioglicerol (MTG) (a partir de 26 μL en 2 ml de IMDM)</td>
			<td>1,5 ml</td>
			<td>4,5 x 10-4 M</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1: Composición del medio de diferenciación libre de suero completo (cSFDM).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Reactivo</td>
			<td>Concentración final</td>
		</tr>
<tr>
<td>CHIR99021</td>
			<td>3 μM</td>
		</tr>
<tr>
<td>rhKGF</td>
			<td>10 ng/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dexametasona</td>
			<td>50 nM</td>
		</tr>
<tr>
<td>8-bromoadenosina 30,50-sal sódica monofosfato cíclico (cAMP)</td>
			<td>0,1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>3-Isobutilo-1-metilxantina (IBMX)</td>
			<td>0,1 mM</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 2: Composiciones de los medios CK + DCI.

El presente protocolo describe células alveoidales alveoidales pluripotentes derivadas de células madre pluripotentes inducidas por humanos (iAT2). Estas células pueden cultivarse como esferas autorrenovadoras en cultivo 3D o adaptarse al cultivo de interfaz aire-líquido (ALI).

Generación de esferas 3D y cultivos de interfaz aire-líquido 2D de células epiteliales alveolares pluripotentes inducidas por humanos derivadas de células madre pluripotentes de tipo 2

In the lung, the alveolar epithelium is a physical barrier from environmental stimuli and plays an essential role in homeostasis and disease. Type 2 ...

Este protocolo describe un método para cultivar y pasar una población celular importante en el pulmón y establece una plataforma fisiológicamente relevante para la exposición ambiental. La principal ventaja de esta técnica es que se puede utilizar para investigar la biología pulmonar en el contexto de la homeostasis y la enfermedad. Este método puede proporcionar información, especialmente sobre las enfermedades pulmonares que afectan a los alvéolos pulmonares, incluidas las causadas por variantes genéticas, exposiciones ambientales, agentes infecciosos o una combinación de estos factores.Demostrando el procedimiento seremos yo y Rhiannon Werder, asistidos por Kristy Abo, md, estudiante de doctorado, y Olivia Hix, gerente de laboratorio de nuestros laboratorios. Primero, aspire todo el medio CK DCI de las gotas de la matriz 3D que contienen alveoloesferas derivadas de la diferenciación dirigida en la placa de 12 pocillos. Añadir un mililitro de dispase por gota.Pipetee suavemente la gota en la dispasa usando una pipeta P-1000. Después de la incubación, transfiera los organoides disociados de una gota de matriz en la dispasa a un tubo cónico de 15 mililitros. Agregue 10 mililitros de Medium modificado de Dulbecco de Iscove y centrífuga a 300 x g durante cinco minutos a temperatura ambiente.Aspirar el sobrenadante tanto como sea posible. Resuspender las células en un mililitro de tripsina al 0,05% por gota y transferirla de nuevo a la placa de 12 pocillos. Incubar esto a 37 grados centígrados durante 12 a 15 minutos antes de observar la disociación bajo el microscopio y evitar el sobrecanalido de las células.Al final de la incubación se obtiene una suspensión de una sola célula. Detenga la acción de la tripsina con un volumen igual de suero fetal bovino que contenga medio, seguido de una centrífuga a 300 x g durante cinco minutos. Lave las células con 10 mililitros de IMDM antes de la próxima centrifugación.Vuelva a suspender las celdas en un volumen apropiado para contar. Y luego cuente las células usando un hemocitómetro. Genere alveoloesferas mediante el recubrimiento de suspensión unicelular de células iAT2 en la matriz 3D o en insertos de cultivo celular para cultivo de interfaz aire-líquido.Después de contar las células, determine el número de células deseadas para reproducir en la matriz 3D y centrífuga las células a 300 x g durante cinco minutos a temperatura ambiente. Retire la mayor cantidad posible de sobrenadante con una pipeta y vuelva a suspender rápidamente las celdas en la matriz 3D. Dispense una gota de matriz 3D en un pozo de placa de 12 pocillos precalentada usando una pipeta P-200 sin crear burbujas en la gota de matriz, y sin permitir que la suspensión celular se asiente mientras dispensa múltiples gotas.Coloque la placa en una incubadora de 37 grados Celsius durante 20 a 30 minutos para permitir que las gotas de la matriz se polimericen, luego agregue un mililitro de micromolar CK DCI 10 de medio Y-27632 por pozo para cubrir la gota de la matriz. Cambie el medio a CK DCI sin 10 micromolares de Y-27632 después de 72 horas y reemplácelo con CK DCI fresco cada 48 a 72 horas. Prepare insertos de cultivo celular de 6,5 milímetros recién recubiertos una hora antes del uso diluyendo la matriz 2D en la mezcla de medio /nutriente F-12 Modified Eagle de Dulbecco en la solución de trabajo.Luego agregue 100 microlitros de la matriz diluida por inserto de cultivo celular de 6.5 milímetros. Permita que la matriz polimerice en una incubadora de 37 grados Celsius durante 30 minutos o a temperatura ambiente a partir de una hora. Aspire el exceso de matriz de los insertos de cultivo celular utilizando una pipeta.Enjuáguelo con DMEM F-12 e inmediatamente aspire este lavado antes de agregar las células. Centrifugar las células a 300 x g durante cinco minutos y retirar la mayor cantidad posible de sobrenadante. Resuspender las células en el volumen apropiado para sembrar con 100 microlitros de CK DCI 10 micromolares Y-27632 por inserto de cultivo celular y agregar 100 microlitros al compartimento apical del inserto de cultivo celular.Agita suavemente la placa en un patrón cruzado para garantizar la distribución uniforme de las células y compruébala bajo un microscopio con el objetivo 10X. Agregue 500 microlitros de micromolar CK DCI 10 de Y-27632 al compartimiento basolateral de cada inserto de cultivo celular, y 48 horas después de la siembra, aspire el medio apical usando una pipeta para iniciar la interfaz aire-líquido. Después de 72 horas, cambie el medio basolateral a CK DCI sin 10 micromolares Y-27632, seguido de reemplazar el medio basolateral con CK DCI fresco cada 48 a 72 horas durante un máximo de 28 días después del revestimiento.Los resultados representativos de la citometría de flujo demuestran la facilidad de visualización para la línea SPC2 que tiene un reportero tdTomato dirigido al locus endógeno de la proteína C surfactante y el seguimiento de las células epiteliales alveolares tipo 2 programa a lo largo del tiempo en cultivo. La expresión de la proteína surfactante celular alveolar tipo 2 derivada de IPSC C tdTomato se mantuvo cuando se volvió a platear en la matriz 3D como esferas y cuando se enchapó en insertos de cultivo celular. La resistencia eléctrica transepitelial se puede medir para determinar la integridad del cultivo de interfaz aire-líquido.Al intentar este procedimiento, evite la disociación excesiva mediante pipeteo mecánico o digestión enzimática, ya que esto puede conducir a una baja viabilidad celular y una supervivencia deficiente. Los métodos adicionales realizados después de este procedimiento son las mediciones de la resistencia eléctrica transepitelial a la integridad de la barrera del ensayo, la adición de virus o compuestos para estimular las células, la inmunofluorescencia y la recolección de ARN, proteínas o sobrenadantes. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores exploren nuevas preguntas sobre biología pulmonar y enfermedades, como cómo virus como el SARS COVID-2 o compuestos como los vapores de cigarrillos electrónicos afectan el epitelio alveolar.

generating-3d-spheres-2d-air-liquid-interface-cultures-human-induced

Research

Investigación

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