Inducción de la inflamación de la superficie ocular y recolección de tejidos afectados

Este protocolo describe secuencialmente los pasos involucrados en la inducción de la inflamación de la superficie ocular y la colección de órganos afectados asociados involucrados en la disfunción de la glándula de Meibomio. Este nuevo modelo de MGD permite la investigación del aspecto inmune innato de la enfermedad, particularmente la formación de trampas extracelulares de neutrófilos que ocluyen la glándula de Meibomio. La técnica exhibida en el protocolo puede extenderse para introducir intervenciones terapéuticas tópicas en una etapa preclínica.

Además, la colección de exudados oculares y órganos refleja la eficacia del tratamiento. Para realizar la inyección intraperitoneal de la solución inmunogénica, sostenga suavemente por la cola el ratón hembra C57 negro de siete a nueve semanas de edad con seis no anestesiadas mientras agarra la rejilla de la jaula. Luego sostenga firmemente la piel de la espalda y la región del cuello entre el pulgar y el índice y fije la cola y las extremidades inferiores entre el dedo anular y meñique contra la palma.

Manteniendo el ratón fijo con la cabeza hacia abajo, inyecte 100 microlitros de la solución de inmunógeno preparada en el cuadrante derecho o izquierdo de la cavidad abdominal inferior. Para realizar un desafío de superficie ocular después de la inmunización, aplique cinco microlitros de ovoalbúmina u óvulos o solución salina por ojo de un ratón anestesiado y espere cinco minutos para que el ojo absorba la gota. A continuación, recoge los exudados oculares aplicando 50 microlitros de solución salina estéril en el ojo inmediatamente después del desafío.

Para la escisión de los tejidos de la superficie ocular, coloque el ratón sobre una superficie uniforme y desinfecte el área orbital alrededor del ojo con un hisopo de etanol al 70%. Para formar una incisión alrededor del ojo, haga una incisión entre la oreja y el seno retroorbitario y a lo largo de la superficie sobre el hueso escamoso verticalmente, extendiendo la incisión horizontalmente debajo del párpado inferior a lo largo del hueso maxilar y por encima del párpado superior a lo largo del hueso frontal. Sostenga cuidadosamente el tejido diseccionado alrededor del ojo con pinzas curvas y saque el tejido y el globo ocular.

Coloque los órganos extirpados en PBS estéril. Luego, usando un bisturí bajo el microscopio estéreo, recorte el exceso de tejido muscular facial alrededor de los párpados superiores extirpados. Para recoger la conjuntiva coloca el párpado superior sobre una placa de Petri seca.

Luego, con pinzas finas y un bisturí, pelar suavemente la capa de moco blanquecino de la superficie interna del párpado. A continuación, para diseccionar la córnea, coloque el globo ocular sobre una nueva placa de Petri seca sobre hielo seco. Después de tres minutos, coloque el plato sobre la superficie del banco en una posición estable.

Use tijeras finas y afiladas para hacer una pequeña incisión en el borde de la córnea junto al limbo. Continúe la incisión con el bisturí alrededor del globo ocular, separando la esclerótica de la córnea. Luego retire el iris y los restos del cristalino de la parte posterior de la córnea enjuagando generosamente con solución salina.

Para evaluar la glándula de Meibomio y sus orificios, coloque los párpados extirpados en posición vertical bajo el microscopio estéreo. Luego, de acuerdo con el tiempo de exposición de la cámara y la configuración ISO, capture imágenes bajo iluminación epi-luz blanca. Para evaluar el área de la glándula de Meibomio, coloque los párpados extirpados en posición horizontal y encienda la luz de fondo del microscopio estereoscópico equipado con una cámara infrarroja.

Captura imágenes ajustando el tiempo de exposición según el ISO de la cámara. Los ratones administrados con solución salina mostraron superficies oculares sanas con los ojos bien abiertos. En comparación, la aplicación de óvulos induce inflamación severa de la superficie ocular, la apertura estrecha de los ojos y signos de quemosis.

Los párpados extirpados mostraron grandes oclusiones que taponaban los orificios de la glándula de Meibomio y edema, en contraste con los párpados sanos que mostraban pequeños tapones de la glándula que recubre el párpado. Un examen más detallado de la transiluminación infrarroja de la glándula revela la apariencia racémica de los acinos de la glándula de Meibomio. Los párpados de ratones desafiados con solución salina mostraron los acinos redondos.

En comparación, las aplicaciones de óvulos indujeron la destrucción y pérdida de algunas glándulas con la enfermedad ocular alérgica o FAE. El análisis histológico de los párpados mostró glándulas de Meibomio dilatadas en comparación con los ratones administrados solo con solución salina. La incubación del globo ocular en hielo seco permitió la incisión en la córnea junto al limbo y la separación de la córnea de la esclerótica.

Este estudio facilitó la recolección de la córnea. Además, la administración de óvulos infligió inflamación severa a la conjuntiva con una apariencia hiperémica. Los niveles elevados de la quimiocina CXCL-1 facilitan la extravasación de neutrófilos, la fagocitosis y la desgranulación, y se observó interleucina-6 que media la respuesta de fase aguda y la infiltración de neutrófilos en los sobrenadantes de ratones DEA.

Por otro lado, la concentración de interleucina-10 no mostró cambios significativos tanto en ratones naïve como en AED. Este nuevo modelo permite el desarrollo y la evaluación de la eficacia de los fármacos que se dirigen a las vías inmunes innatas, y es de gran ayuda en la minería de datos de la forma de administración de agentes antiinflamatorios. Después de la recolección apropiada de órganos, los métodos altamente multiplexados como la secuenciación de células individuales y la citometría de masas de imágenes son compatibles con este protocolo.