Name: Mycobacterium tuberculosis Enriquecimiento de vesículas extracelulares mediante cromatografía de exclusión de tamaño (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: Aprende a enriquecer vesículas extracelulares de Mycobacterium tuberculosis mediante cromatografía de exclusión de tamaño. Este método sencillo y reproducible ofrece alto rendimiento con mínima contaminación proteica.

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Nos gustaría agradecer el apoyo de la Facultad de Medicina Veterinaria y Ciencias Biomédicas Premio Experiencial y el Programa de Investigación Compartida del Consejo de Investigación Universitaria a NKG y la financiación de ATCC (premio # 2016-0550-0002) a KMD. También nos gustaría agradecer a Anne Simpson por su apoyo técnico y a BEI Resources, NIAID, NIH por los siguientes reactivos: Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LpqH (Gene Rv3763), IT-54 (producido in vitro), NR-13792, Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis GroES (Gene Rv3418c), Clone IT-3 (SA-12) (producido in vitro), NR-49223, y Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LAM, Clon CS-35 (producido in vitro), NR-13811.

El Comité de Bioseguridad Institucional de la Universidad Estatal de Colorado aprobó el presente estudio (19-046B). El cultivo de Mycobacterium tuberculosis y la cosecha de sobrenadantes de cultivo ricos en EV fueron realizados por personal capacitado en un laboratorio de alta contención. Los materiales fueron trasladados fuera del área de alta contención después de que se realizó, confirmó y aprobó un método de inactivación válido por las políticas institucionales de bioseguridad. Al replicar el protocolo, si la inactivación validada o el método de filtración estéril no son factibles, los siguientes procedimientos deben realizarse en un laboratorio de alta contención.
1. Preparación de concentrado crudo Mtb EV
NOTA: Para procedimientos detallados sobre el cultivo de Mtb y la preparación de proteínas de filtrado de cultivo (CFP), ver Referencias11,12. Se recomienda que los medios de cultivo bacteriano estén libres de suplementos de crecimiento con componentes proteínicos o que contengan EV, como la albúmina oleica dextrosa catalasa (OADC), y detergentes como Tween. También se recomienda que la calidad del cultivo bacteriano y la CFP cosechada se examinen para garantizar una muerte celular limitada y la lisis 13,14.
<ol><li>Prepare un filtro centrífugo de corte de peso molecular (MWCO) de 100 kDa (consulte la Tabla de materiales) agregando la capacidad de volumen completo de solución salina tamponada con fosfato (1x PBS). Centrifugadora durante 5 min a 2.800 x g a 4 °C. NOTA: Si utiliza un filtro sin volumen de parada muerta, se debe tener cuidado para garantizar que el volumen de la muestra no se reduzca por debajo del nivel del filtro, lo que resulta en un secado completo del filtro durante la centrifugación.</li>
	<li>Deseche el flujo de flujo y cualquier PBS restante antes de llenar la cámara de muestra con Mtb CFP a su máxima capacidad. Centrifugar a 2.800 x g a 4 °C hasta que el volumen se haya reducido al volumen mínimo del dispositivo de ultrafiltración. Repetir según sea necesario, añadiendo más CFP a la unidad hasta que toda la muestra se haya reducido lo suficiente. NOTA: Conserve una parte del material de flujo continuo de 100 kDa (100F) para la calificación aguas abajo si lo desea. Conservar a 4 °C.</li>
	<li>Agregue 1x PBS a la unidad de filtro que contiene el concentrado hasta la capacidad total del dispositivo. Reduzca el volumen como se describe en 1.2. Repita este paso cinco veces para garantizar un lavado completo y un intercambio de tampón.</li>
	<li>Recupere el retentate CFP concentrado de 100 kDa (100R) de acuerdo con las especificaciones del dispositivo de ultrafiltración (consulte la Tabla de Materiales). Una vez que se recupera el 100R, lave el filtro con un volumen mínimo de 1x PBS al menos tres veces, y agrupe el lavado con el 100R para maximizar la recuperación.</li>
	<li>Cuantificar el material 100R con un ensayo bicinconónico (BCA) siguiendo las instrucciones del fabricante (ver Tabla de Materiales). Para realizar el ensayo, use varias diluciones de muestras 1:2, 1:5 y 1:10 en PBS. Pruebe la muestra por triplicado. NOTA: Conserve una parte del material 100R para la calificación posterior si lo desea. Conservar a 4 °C.</li>
</ol>2. Cromatografía de exclusión de tamaño para el enriquecimiento de EV Mtb a partir de CFP
NOTA: El siguiente procedimiento es específico para el uso de 3 mg de CFP de 100R Mtb con columna SEC y colector automático de fracción (AFC, ver Tabla de Materiales). Se puede adaptar para otras concentraciones iniciales y tipos de columna siguiendo las especificaciones del fabricante. Además, se recomienda a los usuarios que lean y comprendan el manual de usuario del colector automático de fracciones.
<ol><li>Permita que la columna SEC se equilibre a temperatura ambiente.</li>
	<li>Encienda el AFC con el interruptor de encendido en la parte posterior de la unidad de torre y ajuste la configuración de la célula de carga, si es necesario, presionando SETUP en la pantalla táctil del menú principal. La célula de carga solo debe calibrarse en el primer uso, después de cada actualización de software y si se observa inconsistencia en los volúmenes de recolección de fracciones.</li>
	<li>En la pantalla SETUP , alinee el carrusel seleccionando CARRUSEL > CALIBRAR. Inserte el carrusel con los 13 pequeños orificios orientados hacia arriba en la torre AFC y ajuste el carrusel para que la boquilla de fluido esté directamente sobre la posición de descarga presionando los botones - y / o + .</li>
	<li>Retire las tapas de la columna SEC equilibrada. Deslice la columna SEC en el soporte de columna apropiado e instálela cuidadosamente en la torre AFC. Asegúrese de que la etiqueta de identificación por radiofrecuencia (RFID) en la columna esté orientada hacia el AFC y verifique que la conexión entre la columna y la válvula sea segura. Coloque el tubo de salida de residuos en un contenedor de recogida.</li>
	<li>En la pantalla SETUP , seleccione Programación de recolección y establezca el recuento en 13 y el tamaño en 0,5 ml pulsando los botones - y/o + . Deje la configuración "Volumen de búfer" como predeterminada de 2.7 ml y luego cierre la ventana "Programación de recopilación" presionando X.</li>
	<li>Seleccione INICIAR COLECCIÓN en la pantalla de inicio y confirme los parámetros de la colección seleccionando SÍ. Cargue 13 tubos de microcentrífuga etiquetados de 1,7 ml con las tapas abiertas y apuntando hacia el centro del carrusel.</li>
	<li>Avance el AFC seleccionando OK, luego monte el depósito de columna y avance nuevamente presionando OK. Seleccione la opción para vaciar la columna presionando SÍ y agregue un volumen de columna de PBS filtrado de 0,2 μm para eliminar cualquier búfer de almacenamiento. Una vez que se complete el lavado, avance el AFC presionando OK.</li>
	<li>Coloque la cubierta del carrusel sobre el AFC y pulse OK. Prepare un volumen de columna de PBS filtrado de 0,2 μm. Utilice una pipeta para eliminar cualquier exceso de búfer de la columna.</li>
	<li>Traiga 3 mg de muestra de 100R según lo cuantificado en el paso 1.5 a 500 μL con 1x PBS. Agregue la muestra de 3 mg a la parte superior de la columna. Avance el AFC y permita que la muestra se tope con la frita. Una vez que la muestra haya entrado completamente en la columna, agregue el PBS preparado en el paso 2.6 al depósito.</li>
	<li>Supervise el funcionamiento del AFC mientras recoge primero el volumen vacío y luego las fracciones especificadas. Una vez que se complete la carrera y el carrusel vuelva a la posición de desperdicio, retire la cubierta y retire los tubos de fracción del carrusel. Almacene las fracciones a 4 °C antes de la cuantificación (paso 3) y la calificación (paso 4).</li>
	<li>Si la columna se va a reutilizar, seleccione la opción para limpiar la columna pulsando SÍ; de lo contrario, presione NO. Siga las instrucciones de la AFC. NOTA: Una vez que la columna se lava y el búfer de almacenamiento se ha ejecutado, se puede quitar, tapar y almacenar a 4 °C.</li>
</ol>3. Cuantificación de los vehículos eléctricos Mtb
<ol><li>Mida la concentración de proteínas para cada fracción usando BCA y micro BCA12.<ol>
<li>Para fracciones de 0,5 ml recogidas de 3 mg de CFP de 100R Mtb, utilice el micro BCA con una dilución de 1:3 para las fracciones numeradas del 1 al 7 de cada muestra por triplicado.</li>
		<li>Para fracciones de 0,5 ml numeradas 5-13, utilice el BCA sin dilución para cada muestra por triplicado. NOTA: La superposición de los ensayos para las fracciones 5-7 ayudará a garantizar que todas las fracciones tengan una salida legible.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cuantificar la concentración de partículas para cada fracción mediante el análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA).<ol>
<li>Diluya las muestras en 1 ml de 1x PBS utilizando las siguientes proporciones iniciales sugeridas; para las fracciones 1-3, use 1:100, y luego para las fracciones restantes, use una dilución 1:10.</li>
		<li>Vórtice las soluciones diluidas y luego extraiga la muestra en una jeringa desechable de 1 ml. Coloque la jeringa en una bomba de jeringa automática si está disponible.</li>
		<li>Ajuste la bomba de jeringa a 30 μL/min y utilice la configuración de captura de vídeo con una ganancia de pantalla de 10-12 y un nivel de cámara de 10-12. Ajuste el enfoque para cada muestra.</li>
		<li>Recopile un mínimo de tres videos a 30 s cada uno utilizando un flujo constante.</li>
		<li>Realice el análisis con el umbral de detección de software establecido en cinco. NOTA: Es posible que no sea posible obtener datos de NTA para las últimas fracciones (>7) sin sacrificar un volumen de muestra significativo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Calificación de los vehículos eléctricos Mtb
<ol><li>Visualice el perfil general de proteínas de cada fracción utilizando un gel de proteína teñido de plata. NOTA: Los procedimientos detallados para SDS-PAGE y tinción de plata se pueden encontrar en la Referencia15.<ol>
<li>Agregue el tampón de muestra SDS a 10 μL de cada fracción y 5 μg de CFP, 100R y 100F. Hervir durante 5 min a 100 °C, luego cargar en un gel Bis-Tris al 4%-12% con una escalera de peso molecular para electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) (ver Tabla de materiales).</li>
		<li>Ejecute el gel utilizando 1 tampón de 2-[N-morfolino]ácido etanosulfónico (MES) (consulte la Tabla de materiales) y una corriente de 200 V durante 35 min.</li>
		<li>Retire el gel del cassette y proceda con la tinción de plata15.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Evaluar la presencia o ausencia de marcadores EV en cada fracción por Western blot. NOTA: Los procedimientos detallados para Western blotting se pueden encontrar en la Referencia15.<ol>
<li>Ejecute un gel SDS-PAGE como se describe en los pasos 4.1.1-4.1.2.</li>
		<li>Retire el gel del cassette y transfiera las proteínas resueltas a una membrana de nitrocelulosa de 0,2 μm (ver Tabla de Materiales) aplicando una corriente de 50 V durante un mínimo de 1 h.</li>
		<li>Realizar análisis de Western blot para evaluar proteínas de interés. Se recomiendan anticuerpos primarios contra LpqH, lipoarabinomanano (LAM) y GroES (ver Tabla de Materiales).</li>
		<li>Fracciones de agrupación basadas en la presencia o ausencia de marcadores, según corresponda para la aplicación posterior.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Confirmar la presencia de vesículas intactas mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM).<ol>
<li>Fije 15 μL de la muestra de vesícula agregando 15 μL de paraformaldehído de grado EM al 4% y guárdelo a 4 ° C durante la noche.</li>
		<li>Prepare una rejilla TEM de cobre recubierta de carbono formvar de 200 mallas limpiando la superficie y haciendo un sustrato hidrófilo. NOTA: Se recomienda la limpieza con plasma con 95% de argón, 5% de oxígeno y 30% de potencia plasmática durante 1 minuto.</li>
		<li>Deje caer 10 μL de la muestra fija en la rejilla y deje que la muestra se adhiera durante 10 minutos, luego borre el exceso de líquido con papel de filtro.</li>
		<li>Flote la rejilla en una gota de agua ultrapura durante 30 s, luego elimine el exceso de líquido.</li>
		<li>Flote la rejilla en una gota de acetato de uranilo de grado EM al% durante 2 minutos, luego borre el exceso de líquido.</li>
		<li>Deje que la rejilla se seque completamente al aire.</li>
		<li>Imagen utilizando un TEM (ver Tabla de Materiales) a 100 kV o similar. NOTA: Se deben utilizar otros métodos de cuantificación y caracterización de vehículos eléctricos en función de las aplicaciones posteriores. La Información Mínima para Estudios de Vesículas Extracelulares18 debe ser consultada para obtener pautas que aseguren el rigor y la reproducibilidad de todos los estudios de EV.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Las vesículas extracelulares de Mycobacterium tuberculosis son reservorios altamente antigénicos, que las presentan como una vía atractiva para el desarrollo de herramientas diagnósticas y futuras vacunas 4,19,20. Históricamente, la ultracentrifugación por gradiente de densidad se ha utilizado para separar los EV Mtb de otros materiales solubles y secretados8. Si bien este proceso es efectivo, ta...

La liberación de vesículas extracelulares (EV) por patógenos puede ser la clave para desbloquear nuevas tecnologías para controlar las enfermedades infecciosas1. Mycobacterium tuberculosis (Mtb) es un patógeno de alta consecuencia, infectando aproximadamente un tercio de la población mundial y cobrándose la vida de millones de personas cada año2. La producción de EV por Mtb está bien documentada pero es difícil de alcanzar en la biogénesis y las funciones variadas (es decir, inmunoestimulantes, inmunosupresoras, de hierro y adquisición de nutrientes) de estos EV en el contexto de la infección 3,4,5. Los esfuerzos para comprender la composición de los EV Mtb revelaron esferas encerradas en la membrana lipídica de 50-150 nm derivadas de la membrana plasmática que contienen lípidos y proteínas de importancia inmunológica 3,6. La investigación del papel de los EV Mtb en la fisiología bacteriana ha revelado la importancia de la modulación bacteriana ev en respuesta al estrés ambiental para la supervivencia5. Los estudios de interacción huésped-patógeno han sido más complicados de interpretar, pero la evidencia indica que los EV Mtb pueden influir en la respuesta inmune del huésped y pueden servir potencialmente como un componente de vacunación efectivo 3,4,7.
La mayoría de los estudios de EV Mtb hasta ahora se han basado en la ultracentrifugación por gradiente de densidad para el enriquecimiento de vesículas8. Esto ha sido eficaz para los estudios a pequeña escala; sin embargo, esta técnica tiene varios desafíos técnicos y logísticos. Los flujos de trabajo alternativos combinan la centrifugación de varios pasos, para la eliminación de células enteras y escombros grandes, con un paso final de ultracentrifugación para granular evs. Esta metodología puede variar en eficiencia y, a menudo, da como resultado un bajo rendimiento y copurificación de biomoléculas solubles asociadas a vesículas no vesículas, al tiempo que afecta la integridad de las vesículas9. Además, este proceso requiere mucho tiempo, es intensivo manualmente y tiene un rendimiento muy limitado debido a las limitaciones del equipo.
El presente protocolo describe una técnica alternativa a la ultracentrifugación por gradiente de densidad: la cromatografía de exclusión de tamaño (SEC). Este método ha sido demostrado para micobacterias ambientales, y en el trabajo actual, se ha extrapolado a Mtb10. Una columna disponible comercialmente y un colector automático de fracción pueden mejorar la consistencia en la preparación vesical y reducir la necesidad de equipos específicos y costosos. También es posible completar este protocolo en una fracción del tiempo en comparación con la ultracentrifugación por gradiente de densidad, lo que aumenta el rendimiento. Esta técnica es menos desafiante técnicamente, por lo que es más fácil de dominar, y puede aumentar la reproducibilidad inter / intra-laboratorio. Finalmente, SEC tiene una alta eficiencia de separación y es suave, preservando la integridad de las vesículas.

<table><tbody><tr><td>20x MES SDS Running Buffer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NP0002</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 96 pocillos</td><td>Corning</td><td>15705-066</td><td></td></tr><tr><td>Colector automático de fracciones</td><td>IZON Science</td><td>AFC-V1-USD</td><td></td></tr><tr><td>BenchMark Escalera de proteínas preteñida</td><td>Invitrogen</td><td>10748010</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga de sobremesa</td><td>Beckman Coulter</td><td>Allegra 6R</td><td></td></tr><tr><td>Centricon Plus - 70 Filtro centrífugo, corte de 100 kDa</td><td>Millipore Sigma</td><td>UFC710008</td><td>Dispositivo de ultrafiltración utilizado en el paso 1.1</td></tr><tr><td>Sistema de electrotransferencia</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>09-528-135</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído de grado EM</td><td>Ciencias de la Microscopía Electrónica</td><td>15714-S</td><td></td></tr><tr><td>Malla Formvar/Carbono 200 Rejillas de Cu</td><td>Ciencias de la Microscopía Electrónica</td><td>FCF200H-Cu-TA</td><td></td></tr><tr><td>Cabra Anti-Ratón IgG H& L (fosfatasa alcalina), molécula entera, 1 mL</td><td>AbCam</td><td>ab6790</td><td>Anticuerpo secundario</td></tr><tr><td>JEM-1400 Microscopio electrónico de transmisión JOEL</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro BCA Kit de ensayo de proteínas</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23235</td><td></td>Lector</tr> de <tr><td>microplacas</td><td>BIOTEK</td><td>Epoch</td><td></td></tr><tr><td>Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis GroES (gen Rv3814c)</td><td>Recursos BEI</td><td>NR-49223</td><td>Anticuerpo primario</td></tr><tr><td>Anti-Mycobacterium tuberculosis LpqH (gen Rv3763)</td><td>Recursos BEI</td><td>NR-13792</td><td>Anticuerpo primario</td></tr><tr><td>Monocolonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LAM, clon CS-35</td><td>Recursos BEI</td><td>NR-13811</td><td>Anticuerpo primario</td></tr><tr><td>NanoClean 1070</td><td>Fischione Instruments</td><td></td><td>Para la limpieza por plasma de la rejilla TEM</td></tr><tr><td>Nanosight equipado con bomba de jeringa y ordenador con el software NanoSight NTA</td><td>Malvern Panalytical</td><td>NS300</td><td></td></tr><tr><td>Membrana de nitrocelulosa, rollo, 0,2 &mu; m</td><td>BioRad</td><td>1620112</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NP0323BOX</td><td></td></tr><tr><td>solución salina tamponada con fosfato, 1X sin calcio ni magnesio</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Kit de ensayo de proteínas Pierce BCA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>PowerPac Fuente de alimentación básica</td><td>BioRad</td><td>1645050</td><td></td></tr><tr><td>qEV Original 35 nm 5/pk</td><td>IZON Science</td><td>SP5-USD</td><td>Columna SEC</td></tr><tr><td>Tampón de muestra SDS</td><td>Boster</td><td>AR1112</td><td>Receta interna utilizada en este procedimiento, sin embargo, este producto es equivalente</td></tr><tr><td>SDS-PAGE cámara de gel</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>EI0001</td><td></td></tr><tr><td>Sigmafast BCIP/NBT</td><td>Millipore Sigma</td><td>B5655</td><td></td></tr><tr><td>Silver Stain Plus Kit</td><td>BioRad</td><td>1610449</td><td>Protocolo interno utilizado en este procedimiento, sin embargo, este kit es equivalente</td></tr> a <tr><td>la microscopía electrónica de</td><td>acetato de uranilo</td><td>22400</td><td></td></tr></tbody></table>

mycobacterium tuberculosis enriquecimiento de vesículas extracelulares mediante cromatografía de exclusión de tamaño

Mycobacterium tuberculosis Extracellular Vesicle Enrichment through Size Exclusion Chromatography

El papel de las vesículas extracelulares (EV) en el contexto de la infección bacteriana ha surgido como una nueva vía para comprender la fisiología microbiana. Específicamente, los EV de Mycobacterium tuberculosis (Mtb) desempeñan un papel en la interacción huésped-patógeno y la respuesta al estrés ambiental. Los VEHÍCULOS eléctricos Mtb también son altamente antigénicos y muestran potencial como componentes de la vacuna. El método más común para purificar los EV Mtb es la ultracentrifugación por gradiente de densidad. Este proceso tiene varias limitaciones, incluyendo bajo rendimiento, bajo rendimiento, dependencia de equipos costosos, desafíos técnicos, y puede afectar negativamente la preparación resultante. La cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) es un método alternativo más suave que combate muchas de las limitaciones de la ultracentrifugación. Este protocolo demuestra que SEC es eficaz para el enriquecimiento de Mtb EV y produce preparaciones mtb EV de alta calidad de mayor rendimiento de una manera rápida y escalable. Además, una comparación con la ultracentrifugación del gradiente de densidad mediante procedimientos de cuantificación y calificación demuestra los beneficios de sec. Si bien la evaluación de la cantidad de EV (análisis de seguimiento de nanopartículas), el fenotipo (microscopía electrónica de transmisión) y el contenido (Western blotting) se adapta a los EV Mtb, el flujo de trabajo proporcionado se puede aplicar a otras micobacterias.

La proteína de filtrado de cultivo (CFP) de Mycobacterium tuberculosis (Mtb) se concentró, cuantificó y luego se aplicaron 3 mg de material a una columna de cromatografía de exclusión de tamaño (SEC). Las concentraciones de proteínas y partículas fueron enumeradas por BCA y NTA, respectivamente. Los rangos esperados para la recuperación de proteínas y partículas más los valores exactos obtenidos para estos resultados se informan en la Tabla 1. Valores mucho más altos que estos rangos pueden indi...

Este protocolo describe la cromatografía de exclusión de tamaño, una técnica fácil y reproducible para enriquecer vesículas extracelulares de Mycobacterium tuberculosis a partir de sobrenadantes de cultivo.

Mycobacterium tuberculosis Enriquecimiento de vesículas extracelulares mediante cromatografía de exclusión de tamaño

The role of extracellular vesicles (EVs) in the context of bacterial infection has emerged as a new avenue for understanding microbial physiology. ...

Este protocolo reduce la complejidad técnica y el tiempo requerido para el enriquecimiento de vesículas extracelulares de Mycobacterium tuberculosis, Mtb EVs. Proporciona una alternativa suave a la ultracentrifugación tradicional y las técnicas basadas en la densidad. La principal ventaja de esta técnica es que es fácil de realizar, por lo que es más reproducible.Proporciona un alto rendimiento de Mtb EVs con un mínimo co-enriquecimiento de proteínas no EV. Demostrando el procedimiento estará Joanie Ryan, una ex estudiante graduada de nuestro laboratorio. Para comenzar, prepare un filtro centrífugo de corte de peso molecular de 100 kilodalton agregando la capacidad de volumen total de PBS.Centrifugar durante cinco minutos a 2, 800 veces G a 4 grados centígrados. Deseche el flujo continuo y cualquier PBS restante, y llene la cámara de muestra con Mtb CFP a su máxima capacidad. Centrifugar a 2, 800 veces G a 4 grados centígrados hasta que el volumen se haya reducido al volumen mínimo del dispositivo de ultrafiltración.Repita según sea necesario hasta que toda la muestra se haya reducido lo suficiente. Agregue 1X PBS a la unidad de filtro que contiene el concentrado hasta la capacidad total del dispositivo. Reduzca el volumen como se describió anteriormente y repita este paso cinco veces para garantizar el lavado completo y el intercambio de tampón.Luego, recupere el retentado CFP concentrado de 100 kilodalton o 100R, de acuerdo con las especificaciones del dispositivo de ultrafiltración. Lave el filtro con un volumen mínimo de 1X PBS al menos tres veces, y tire del lavado con el 100R para maximizar la recuperación. Utilice varias diluciones de muestras en PBS y cuantifique el material 100R con un ensayo bicinchonínico.Pruebe la muestra por triplicado. Permita que la cromatografía de exclusión de tamaño, o columna SEC, se equilibre a temperatura ambiente. Encienda el AFC con el interruptor de encendido situado en la parte posterior de la unidad de torre y pulse Setup (Configuración) en la pantalla táctil del menú principal si es necesario para ajustar los ajustes de la célula de carga.En la pantalla de configuración, alinee el carrusel seleccionando Carrusel seguido de Calibrar. Inserte el carrusel con los 13 orificios pequeños hacia arriba en la torre AFC y ajuste el carrusel presionando los botones menos o más para que la boquilla de fluido esté directamente sobre la posición de descarga. Retire las tapas de la columna SEC equilibrada y deslice la columna SEC en el soporte de columna adecuado.Instálelo cuidadosamente en la torre AFC. Asegúrese de que la etiqueta de identificación por radiofrecuencia en la columna esté orientada hacia el AFC y verifique que la conexión entre la columna y la válvula sea segura. Coloque el tubo de salida de residuos en un contenedor de recolección.En la pantalla de configuración, seleccione Programación de recolección y establezca el recuento en 13 y el tamaño en 0,5 mililitros presionando los botones menos o más. Deje la configuración de volumen de búfer como predeterminada de 2,7 mililitros y, a continuación, cierre la ventana de programación de recogida. Seleccione Iniciar recopilación en la pantalla de inicio y confirme los parámetros de recopilación seleccionando Sí.Load 13 etiquetado como tubos de microcentrífuga de 1,7 mililitros con las tapas abiertas y apuntando hacia el centro del carrusel. Avance el AFC seleccionando OK, luego monte el depósito de columna y avance nuevamente presionando OK. Seleccione la opción para vaciar la columna presionando Sí y agregue un volumen de columna de PBS filtrado de 0,2 micrómetros para eliminar cualquier búfer de almacenamiento. Una vez que se complete el lavado, avance el AFC presionando OK. Coloque la cubierta del carrusel sobre el AFC y pulse OK. Utilice una pipeta para eliminar cualquier exceso de búfer de la columna.Lleve tres miligramos de muestra 100R a 500 microlitros con 1X PBS y agregue la muestra a la parte superior de la columna. Prepare un volumen de columna de PBS filtrado de 0,2 micrómetros. Avance el AFC y permita que la muestra se ejecute en el traste.Una vez que la muestra haya entrado completamente en la columna, agregue el PBS preparado anteriormente al depósito. Supervise la ejecución del AFC mientras recopila primero el volumen vacío y luego las fracciones especificadas. Después de que se complete la ejecución y el carrusel vuelva a la posición de desecho, retire la cubierta y los tubos de fracción del carrusel.Para fracciones de 0,5 milímetros recogidas de tres miligramos de 100R Mtb CFP, medir la concentración de proteína utilizando el micro-BCA con una dilución 1:3 para fracciones numeradas del 1 al 7 de cada muestra por triplicado. Para fracciones de 0,5 mililitros numeradas del 5 al 13, use el BCA sin dilución para cada muestra por triplicado. Agregue el tampón de muestra SDS a 10 microlitros de cada fracción y cinco microgramos de CFP y 100R.Hervir durante cinco minutos a 100 grados centígrados. Luego cargue en un gel de 4 a 12% de Bis-Tris con una escalera de peso molecular para electroforesis en gel de poliacrilamida, o PAGE. Ejecute un gel SDS-PAGE utilizando un búfer de funcionamiento MES 1X y una corriente de 200 voltios durante 35 minutos.Retire el gel del casete y aplique una corriente de 50 voltios durante un mínimo de una hora para transferir las proteínas resueltas a una membrana de nitrocelulosa de 0,2 micrómetros. Finalmente, realice el análisis de Western blot para evaluar las proteínas. Un gel SDS-PAGE teñido con plata demuestra el perfil proteico general para cada fracción.Los datos muestran que las fracciones posteriores contienen más proteínas y se asemejan al material 100R. Los Western blots que detectan LAM, LpqH y GroES demuestran que el marcador de proteínas cambia a través de las fracciones. Aquí se muestra la microscopía electrónica de transmisión, o imágenes TEM, de las fracciones SEC 1 a 3 extraídas antes de la fijación.La ultracentrifugación por gradiente de densidad de los EV Mtb se tiñó negativamente para las imágenes TEM. El análisis de seguimiento de nanopartículas, o distribución NTA, de las fracciones SEC 1 a 3 se muestra aquí. Los EV de ultracentrifugación de gradiente de densidad Mtb se analizaron con análisis de seguimiento de nanopartículas, y la distribución de tamaño se muestra aquí.Este protocolo ha sido optimizado para la purificación de EV a partir de tres miligramos de 100R. Si la carga proteica es variada, la dilución recomendada y la estrategia de BCA en las fracciones resultantes pueden requerir ajustes. Los EV de MTB preparados con esta técnica se pueden utilizar para estudios posteriores basados en la composición y ómicas.También son adecuados para experimentos in vitro e in vivo. Esta técnica proporciona una forma fácil y eficiente de producir preparaciones de Mtb EV de alta calidad, allanando el camino para una mayor reproducibilidad en futuros experimentos de Mtb EV.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Fuente: Gupta, S., Marcela Rodríguez, G. Aislamiento y caracterización de vesículas extracelulares producidas por micobacterias limitadas en hierro. J. Vis. Exp. (2019)Este video demuestra el aislamiento escalonado de vesículas extracelulares (EV) de Mycobacterium tuberculosis cultivadas en condiciones limitantes de hierro que imitan el entorno del huésped. Describe el uso de la ultrafiltración, la centrifugación diferencial y la separación por gradiente de densidad para enriquecer e...

Aislamiento de vesículas extracelulares que contienen sideróforos de Mycobacterium tuberculosis

Fuente: Watson, D. C., et.al. Aislamiento y purificación escalables de vesículas extracelulares de Escherichia coli y otras bacterias. J. Vis. Exp. (2021)Este video demuestra el aislamiento y la concentración de vesículas extracelulares (EV) derivadas de la membrana externa de bacterias modificadas genéticamente. El proceso consiste en cultivar las bacterias para liberar vehículos eléctricos, seguido de pasos secuenciales de centrifugación y filtración para eliminar células y desechos.

Aislamiento y enriquecimiento de vesículas extracelulares derivadas de la membrana externa de bacterias

Fuente: Watson, D. C., et al. Aislamiento y purificación escalables de vesículas extracelulares de Escherichia coli y otras bacterias. J. Vis. Exp. (2021)Este video demuestra el uso de la cromatografía de exclusión por tamaño con perlas de resina porosa para aislar vesículas extracelulares (EV) bacterianas de un filtrado de cultivo bacteriano. Los EV más grandes eluyen temprano al evitar los poros de la resina, mientras que las proteínas más pequeñas ingresan a los poros y se eluyen más tarde.

Aislamiento de vesículas extracelulares bacterianas mediante cromatografía de exclusión por tamaño 

En este video, demostramos una técnica, la cromatografía de exclusión por tamaño, para separar una población heterogénea de vesículas de membrana externa o OMV derivadas de bacterias. Estas vesículas son estructuras esféricas de tamaño nanométrico y se separan en subpoblaciones grandes y pequeñas en función de su tamaño mediante cromatografía de exclusión por tamaño.

Separación de vesículas extracelulares bacterianas basadas en cromatografía de exclusión por tamaño: una técnica para separar poblaciones heterogéneas de vesículas de membrana externa bacterianas gramnegativas en función de su tamaño

Este video demuestra el aislamiento y la concentración de proteínas filtradas de cultivo bacteriano, que incluyen vesículas extracelulares bacterianas, utilizando ultrafiltración. Las vesículas extracelulares concentradas sirven como marcadores diagnósticos para la detección de enfermedades.

Concentración de proteínas filtradas de cultivo bacteriano mediante un dispositivo de ultrafiltración

Este video muestra la técnica de cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) para purificar vesículas extracelulares (EV) bacterianas del filtrado de cultivo de Mycobacterium tuberculosis (Mtb). La técnica utiliza una columna porosa empaquetada de resina para obtener fracciones purificadas de EV. Las partículas porosas permiten selectivamente que las proteínas más pequeñas entren en los poros, lo que resulta en una elución más lenta. Al mismo tiempo, los EV están excluidos de entrar en los...

Una técnica de cromatografía de exclusión por tamaño para purificar vesículas extracelulares micobacterianas

Mycobacterium tuberculosis muestra un aumento de la producción y liberación de vesículas extracelulares en respuesta a condiciones bajas de hierro. Este trabajo detalla un protocolo para generar condiciones de hierro bajas y métodos para la purificación y caracterización de vesículas extracelulares micobacterianas liberadas en respuesta a la deficiencia de hierro.

Aislamiento y caracterización de vesículas extracelulares producidas por micobacterias limitadas por hierro

Las vesículas bacterianas desempeñan un papel importante en la patogénesis y tienen aplicaciones biotecnológicas prometedoras. La heterogeneidad de las vesículas complica el análisis y el uso; por lo tanto, es necesario un método simple y reproducible para separar los diferentes tamaños de vesículas. Aquí, demostramos el uso de la cromatografía de exclusión de tamaño para separar vesículas heterogéneas producidas por Aggregatibacter actinomycetemcomitans.

Cromatografía de exclusión de tamaño para analizar la heterogeneidad de las vesículas de la membrana externa bacteriana

Las bacterias secretan vesículas extracelulares (EV) de tamaño nanométrico que transportan moléculas biológicas bioactivas. La investigación EV se centra en comprender su biogénesis, su papel en las interacciones y enfermedades microbio-microbio y huésped-microbio, así como sus posibles aplicaciones terapéuticas. Se presenta un flujo de trabajo para el aislamiento escalable de vehículos eléctricos de varias bacterias para facilitar la estandarización de la investigación de vehículos eléctricos.

Aislamiento escalable y purificación de vesículas extracelulares de Escherichia coli y otras bacterias

Este protocolo detalla el enriquecimiento de vesículas extracelulares micobacterianas nativas (mEVs) de cultivos axénicos de Mycobacterium smegmatis (Msm) y cómo se pueden diseñar y enriquecer msmEVs recombinantes que contienen mCherry (un reportero fluorescente rojo). Por último, se verifica el novedoso enfoque con el enriquecimiento de MsmEVs que contienen la proteína EsxA de Mycobacterium tuberculosis.

Enriquecimiento de vesículas extracelulares nativas y recombinantes de micobacterias

Este protocolo describe el aislamiento de pequeñas vesículas extracelulares del músculo esquelético murino y la médula ósea mediante digestión enzimática y cromatografía de exclusión de tamaño, permitiendo la recuperación reproducible de fracciones enriquecidas con vesículas de tejidos estructuralmente complejos y de bajo rendimiento para análisis molecular posteriores.

Aislamiento de pequeñas vesículas extracelulares del músculo esquelético murino y médula ósea mediante cromatografía de exclusión de tamaño

Aprende a enriquecer vesículas extracelulares de Mycobacterium tuberculosis mediante cromatografía de exclusión de tamaño. Este método sencillo y reproducible ofrece alto rendimiento con mínima contaminación proteica.

Mycobacterium tuberculosis Enriquecimiento de vesículas extracelulares mediante cromatografía de exclusión de tamaño

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