Name: Imágenes cuantitativas en 3D de células infectadas por Trypanosoma cruzi, amastigotes latentes y células T en órganos aclarados intactos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-23T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: Aprende microscopía de fluorescencia con hoja de luz para cuantificar Trypanosoma cruzi y células T en órganos aclarados. Este método permite evaluar resultados terapéuticos en modelos de enfermedad de Chagas.

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Agradecemos al Dr. Etsuo Susaki por su valiosa ayuda y recomendaciones con respecto a los protocolos de limpieza de tejidos e inmunotinción. Además, agradecemos a M. Kandasamy del CTEGD Biomedical Microscopy Core por el apoyo técnico que utiliza LSFM e imágenes confocales. También agradecemos a todos los miembros del Grupo de Investigación Tarleton por sus útiles sugerencias a lo largo de este estudio.

<ol><li>Schofield, C. J., Jannin, J., Salvatella, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+future+of+Chagas+disease+control%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Parasitology%22%5BJournal%5D)">The future of Chagas disease control.</a> Trends in Parasitology. 22 (12), 583-588 (2006).</li>
<li>Marin-Neto, J. A., Cunha-Neto, E., Maciel, B. C., Simoes, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+chronic+Chagas+heart+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of chronic Chagas heart disease.</a> Circulation. 115 (9), 1109-1123 (2007).</li>
<li>Tarleton, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD8%2B+T+cells+in+Trypanosoma+cruzi+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Immunopathology%22%5BJournal%5D)">CD8+ T cells in Trypanosoma cruzi infection.</a> Seminars in Immunopathology. 37 (3), 233-238 (2015).</li>
<li>Padilla, A. M., Simpson, L. J., Tarleton, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insufficient+TLR+activation+contributes+to+the+slow+development+of+CD8%2B+T+cell+responses+in+Trypanosoma+cruzi+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Insufficient TLR activation contributes to the slow development of CD8+ T cell responses in Trypanosoma cruzi infection.</a> Journal of Immunology. 183 (2), 1245-1252 (2009).</li>
<li>Basso, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+immune+response+in+experimental+Chagas+disease%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Modulation of immune response in experimental Chagas disease.</a> World Journal of Experimental Medicine. 3 (1), 1-10 (2013).</li>
<li>Martin, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD8%2B+T-Cell+responses+to+Trypanosoma+cruzi+are+highly+focused+on+strain-variant+trans-sialidase+epitopes%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">CD8+ T-Cell responses to Trypanosoma cruzi are highly focused on strain-variant trans-sialidase epitopes.</a> PLOS Pathogens. 2 (8), 77(2006).</li>
<li>Sanchez-Valdez, F. J., Padilla, A., Wang, W., Orr, D., Tarleton, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+dormancy+protects+Trypanosoma+cruzi+during+extended+drug+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Spontaneous dormancy protects Trypanosoma cruzi during extended drug exposure.</a> Elife. 7, 34039(2018).</li>
<li>Sanchez-Valdez, F., Padilla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+detection+of+dormant+Trypanosoma+cruzi+amastigotes+using+bioluminescent-fluorescent+reporters%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">In situ detection of dormant Trypanosoma cruzi amastigotes using bioluminescent-fluorescent reporters.</a> Methods in Molecular Biology. 1955, 179-186 (2019).</li>
<li>Vieites-Prado, A., Renier, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+clearing+and+3D+imaging+in+developmental+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Tissue clearing and 3D imaging in developmental biology.</a> Development. 148 (18), 199369(2021).</li>
<li>Ueda, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+clearing+and+its+applications+in+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Tissue clearing and its applications in neuroscience.</a> Nature Reviews Neuroscience. 21, 61-79 (2020).</li>
<li>Molbay, M., Kolabas, Z. I., Todorov, M. I., Ohn, T. L., Erturk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guidebook+for+DISCO+tissue+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">A guidebook for DISCO tissue clearing.</a> Molecular Systems Biology. 17, 9807(2021).</li>
<li>Pan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+learning+reveals+cancer+metastasis+and+therapeutic+antibody+targeting+in+the+entire+body%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Deep learning reveals cancer metastasis and therapeutic antibody targeting in the entire body.</a> Cell. 179 (7), 1661-1676 (2019).</li>
<li>Qi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FDISCO%3A+Advanced+solvent-based+clearing+method+for+imaging+whole+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">FDISCO: Advanced solvent-based clearing method for imaging whole organs.</a> Science Advances. 5, 8355(2019).</li>
<li>Cai, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Panoptic+imaging+of+transparent+mice+reveals+whole-body+neuronal+projections+and+skull-meninges+connections%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections.</a> Nature Neuroscience. 22, 317-327 (2019).</li>
<li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+3D+imaging+of+fixed+and+cleared+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids.</a> Nature Protocols. 14, 1756-1771 (2019).</li>
<li>Sachs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expanding+human+airway+organoids+for+disease+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Long-term expanding human airway organoids for disease modeling.</a> The EMBO Journal. 38 (4), 100300(2019).</li>
<li>Hu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-Term+Expansion+of+Functional+Mouse+and+Human+Hepatocytes+as+3D+Organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Long-Term Expansion of Functional Mouse and Human Hepatocytes as 3D Organoids.</a> Cell. 175 (6), 1591-1606 (2018).</li>
<li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157 (3), 726-739 (2014).</li>
<li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+CUBIC+protocols+for+whole-brain+and+whole-body+clearing+and+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging.</a> Nature Protocols. 10, 1709-1727 (2015).</li>
<li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497, 332-337 (2013).</li>
<li>Tainaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-body+imaging+with+single-cell+resolution+by+tissue+decolorization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization.</a> Cell. 159 (4), 911-924 (2014).</li>
<li>Tainaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+landscape+for+tissue+clearing+based+on+hydrophilic+reagents%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Chemical landscape for tissue clearing based on hydrophilic reagents.</a> Cell Reports. 24 (8), 2196-2210 (2018).</li>
<li>Murakami, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+three-dimensional+single-cell-resolution+whole-brain+atlas+using+CUBIC-X+expansion+microscopy+and+tissue+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A three-dimensional single-cell-resolution whole-brain atlas using CUBIC-X expansion microscopy and tissue clearing.</a> Nature Neuroscience. 21, 625-637 (2018).</li>
<li>Zhao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+probing+of+intact+human+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular probing of intact human organs.</a> Cell. 180 (4), 796-812 (2020).</li>
<li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nature Protocols. 7, 1983-1995 (2012).</li>
<li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iDISCO%3A+a+simple%2C+rapid+method+to+immunolabel+large+tissue+samples+for+volume+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging.</a> Cell. 159 (4), 896-910 (2014).</li>
<li>Chung, K., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CLARITY+for+mapping+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">CLARITY for mapping the nervous system.</a> Nature Methods. 10, 508-513 (2013).</li>
<li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatile+whole-organ%2Fbody+staining+and+imaging+based+on+electrolyte-gel+properties+of+biological+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Versatile whole-organ/body staining and imaging based on electrolyte-gel properties of biological tissues.</a> Nature Communications. 11, 1982(2020).</li>
<li>Kubota, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-body+profiling+of+cancer+metastasis+with+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Whole-body profiling of cancer metastasis with single-cell resolution.</a> Cell Reports. 20 (1), 236-250 (2017).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3564(2012).</li>
<li>Bustamante, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+drug+regimen+clears+active+and+dormant+trypanosomes+in+mouse+models+of+Chagas+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">A modified drug regimen clears active and dormant trypanosomes in mouse models of Chagas disease.</a> Science Translational Medicine. 12 (567), (2020).</li>
<li>Wang, H., Khoradmehr, A., Tamadon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FACT+or+PACT%3A+A+comparison+between+free-acrylamide+and+acrylamide-based+passive+sodium+dodecyl+sulfate+tissue+clearing+for+whole+tissue+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Journal%22%5BJournal%5D)">FACT or PACT: A comparison between free-acrylamide and acrylamide-based passive sodium dodecyl sulfate tissue clearing for whole tissue imaging.</a> Cell Journal. 21 (2), 103-114 (2019).</li>
<li>Hofmann, J., Gadjalova, I., Mishra, R., Ruland, J., Keppler, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+tissue+clearing+and+multi-organ+volumetric+imaging+enable+quantitative+visualization+of+sparse+immune+cell+populations+during+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Efficient tissue clearing and multi-organ volumetric imaging enable quantitative visualization of sparse immune cell populations during inflammation.</a> Frontiers in Immunology. 11, 599495(2020).</li>
<li>Messal, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+retrieval+and+clearing+for+whole-organ+immunofluorescence+by+FLASH%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Antigen retrieval and clearing for whole-organ immunofluorescence by FLASH.</a> Nature Protocols. 16, 239-262 (2021).</li>
<li>Kolesova, H., Capek, M., Radochova, B., Janacek, J., Sedmera, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+different+tissue+clearing+methods+and+3D+imaging+techniques+for+visualization+of+GFP-expressing+mouse+embryos+and+embryonic+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Comparison of different tissue clearing methods and 3D imaging techniques for visualization of GFP-expressing mouse embryos and embryonic hearts.</a> Histochemistry and Cell Biology. 146 (2), 141-152 (2016).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+tiling+light+sheet+microscope+for+imaging+of+cleared+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A versatile tiling light sheet microscope for imaging of cleared tissues.</a> Cell Reports. 33, 108349(2020).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses contrapuestos.

La ausencia de imágenes extensas de los parásitos y la respuesta inmune en todo el órgano limita la comprensión de la complejidad de las interacciones huésped-parásito e impide la evaluación de las terapias para la enfermedad de Chagas. El presente estudio adoptó la tubería CUBIC para aclarar y teñir órganos y tejidos intactos de ratones infectados con T. cruzi.
En este estudio se probaron múltiples protocolos de limpieza de tejidos (PACT32, ECi 33, FLASH<sup c...

La enfermedad de Chagas, causada por el parásito protozoario T. cruzi, es una de las enfermedades tropicales más desatendidas del mundo, causando aproximadamente 13.000 muertes anuales. La infección a menudo progresa de una etapa aguda a una crónica produciendo patología cardíaca en el 30% de los pacientes, incluyendo arritmias, insuficiencia cardíaca y muerte súbita 1,2. A pesar de la fuerte respuesta inmune del huésped provocada contra el parásito durante la fase aguda, un bajo número de parásitos persiste crónicamente durante toda la vida del huésped en tejidos como el corazón y el músculo esquelético. Varios factores, incluyendo el inicio tardío de las respuestas inmunes adaptativas y la presencia de formas no replicantes del parásito, pueden contribuir a la capacidad de T. cruzi para evitar una eliminación completa por el sistema inmune 3,4,5,6. Además, las formas latentes no replicantes del parásito muestran una baja susceptibilidad a los fármacos tripanocidas y pueden ser en parte responsables del fracaso del tratamiento observado en muchos casos 7,8.
El desarrollo de nuevas técnicas de imagen brinda la oportunidad de obtener información sobre la distribución espacial de los parásitos en los tejidos infectados y su relación con las células inmunes involucradas en su control. Estas características son cruciales para una mejor comprensión de los procesos de control de parásitos por parte del sistema inmune y el seguimiento de los raros parásitos latentes presentes en los tejidos crónicos.
La microscopía de fluorescencia de lámina de luz (LSFM) es uno de los métodos más completos e imparciales para obtener imágenes 3D de tejidos u órganos grandes sin sección delgada. Los microscopios de lámina de luz utilizan una fina lámina de luz para excitar solo los fluoróforos en el plano focal, reducir el fotoblanqueo y la fototoxicidad de las muestras, y grabar imágenes de miles de capas de tejido utilizando cámaras ultrarrápidas. El alto nivel de transparencia tisular necesario para la correcta penetración de la luz láser en los tejidos se obtiene homogeneizando el índice de refracción (IR) después de la deslipidación y decoloración tisular, lo que reduce la dispersión de la luz y produce imágenes de alta calidad 9,10,11.
Se han desarrollado enfoques de limpieza de tejidos para la obtención de imágenes de ratones enteros 12,13,14, organoides 15,16,17, órganos que expresan marcadores fluorescentes reporteros 18,19,20,21,22,23, y recientemente un número limitado de tejidos humanos 24 . Los métodos actuales para la limpieza de tejidos se clasifican en tres familias: (1) métodos basados en solventes orgánicos como los protocolos DISCO 25,26, (2) métodos basados en hidrogel, como CLARITY27, y métodos acuosos, como CUBIC (Clear, Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computational analysis)18,19,28,29 . Los protocolos CUBIC mantienen la forma del órgano y la integridad del tejido, preservando la fluorescencia de las proteínas reporteras expresadas endógenamente. La actualización más reciente de esta técnica, CUBIC-HistoVision (CUBIC-HV), también permite la detección de epítopos utilizando anticuerpos marcados con fluorescencia y marcado de ADN28.
En el presente protocolo, se utilizó la tubería CUBIC para detectar T. cruzi expresando proteínas fluorescentes en tejidos de ratón intactos clarificados. Se obtuvieron imágenes de tejidos ópticamente transparentes, se reconstruyeron en 3D y se cuantificó automáticamente el número total preciso de células infectadas por T. cruzi , amastigotes latentes y células T por órgano. Además, este protocolo se adoptó con éxito para obtener un etiquetado uniforme de los órganos despejados con anticuerpos y tinciones nucleares. Estos enfoques son esenciales para comprender la expansión y el control de T. cruzi en huéspedes infectados y son útiles para evaluar completamente la quimioterapia e inmunoterapéutica para la enfermedad de Chagas.

<table><tbody><tr><td>1-metilimidazol</td><td>Millipore Sigma</td><td>616-47-7</td><td></td></tr><tr><td>2,3-Dimetil-1-fenil-5-pirazolona (Antipirina</td><td>TCI</td><td>D1876</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultivo celular de 6 pocillos</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>140675</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 647 anti-ratón Fab fragmento</td> Jackson <td>Immuno Research Laboratories</td><td>315-607-003</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 647 anti-conejo Fab fragment</td><td>Jackson Immuno Research Laboratories</td><td>111-607-003</td><td></td></tr><tr><td>anti-GFP nanobody Alexa Fluor 647</td><td>Chromotek</td><td>gb2AF647-50</td><td></td></tr><tr><td>anti-RFP</td><td>Rockland</td><td>600-401-379</td><td></td></tr><tr><td>anti-&alpha;-SMA</td><td>Sigma</td><td>A5228</td><td></td></tr><tr><td>B6. C+A2:A44g-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomate)Hze/J</td> ratón La cepa de <td>laboratorio de Jackson</td><td>#007914</td><td>Nombre común: Ai14, Ai14D o Ai14(RCL-tdT)-D</td></tr><tr><td>B6. Cg-Gt(ROSA)26Sor tm14(CAG-tdTomate)Ratón Hze/J</td><td>La cepa de laboratorio de Jackson</td><td>#007914</td><td>Nombre común: Ai14 , Ai14D o Ai14(RCL-tdT)-D</td></tr><tr><td>YODURO BOBO-1</td><td></td><td></td> Albúmina <td></td></tr><tr><td>sérica bovina (BSA)</td><td>Sigma</td><td>#A7906</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J-Tg(Cd8a*-cre)B8Asin/J</td><td>ratón La cepa de laboratorio Jackson</td><td>#032080</td><td>Común Nombre: Cd8a-Cre (E8III-Cre)</td></tr><tr><td>CAPSO</td><td>Sigma</td><td>#C2278</td><td></td></tr><tr><td>Toallitas de limpieza Kimwipes</td><td>&nbsp; Kimberly-Clark</td><td>T8788</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de barrido láser confocal</td><td>Zeiss</td><td>LSM 790</td><td></td></tr><tr><td>CUBIC-HV 1 kit de inmunotinción 3D</td><td>TCI</td><td>C3699</td><td></td></tr><tr><td>CUBIC-HV 1 kit de tinción nuclear 3D</td><td>TCI</td><td>C3698</td><td></td></tr><tr><td>CUBIC-L</td><td>TCI</td><td>T3740</td><td></td></tr><tr><td>CUBIC-P</td><td>TCI</td><td>T3782</td><td></td></tr><tr><td>CUBIC-R+</td><td>TCI</td><td>T3741</td><td></td></tr><tr><td>Superpegamento en gel a base de cianoacrilato</td><td>Scotch</td><td>571605</td><td></td></tr><tr><td>DiR (DiIC18(7); 1,1'-dioctadecil-3,3,3',3'-tetrametilindotricarbocianina yoduro) Compañía: Biotium</td><td>Biotium</td><td>#60017</td><td></td></tr><tr><td>Etileno diamina ácido tetraacético (EDTA)</td><td>Millipore Sigma</td><td>60-00-4</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Tubos de centrífuga 15 mL</td><td>Corning</td><td></td><td></td>CLS430791</tr><tr><td>Tubos de centrífuga Falcon 50&nbsp; mL</td><td>Corning</td><td>CLS430290</td><td></td></tr><tr><td>Formalina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>Heparina</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>J16920. BBR</td><td></td></tr><tr><td>Hyaluronidasa</td><td>Sigma</td><td>#H3884 o #H4272</td><td></td></tr><tr><td>Imaris File Converter x64</td><td>BitPlane</td><td>v9.2.0</td><td></td></tr><tr><td>Software Imaris</td><td>BitPlane</td><td>v9.3</td><td></td></tr><tr><td>Software ImSpector</td><td>LaVision BioTec, Miltenyi Biotec</td><td>v6.7</td><td></td></tr><tr><td>Aguja de inyección intravenosa 23-G</td><td>Sartori, Minisart Filtro de jeringa</td><td>16534</td><td></td></tr><tr><td>Toallitas Kimwipes</td><td>sin pelusa Microscopio</td>fluorescente de hoja ligera Miltenyi Biotec ULtramicroscope II sistema de imagen Metanol ThermoFisher Scientific 041838.K2 Puntas de <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> micropipeta, 10 y micro;<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> L, 200 y micro; L y 1.000 &micro; L</td><td>Axygen</td><td>T-300, T-200-Y y T-1000-B</td><td></td></tr><tr><td>Dispensador de pipetas motorizado</td><td>Fisher Scientific, Fisherbrand</td><td>03-692-172</td><td></td></tr><tr><td>Solución de montaje</td><td>TCI</td><td>M3294</td><td></td></tr><tr><td>N-butildietanolamina</td><td>TCI</td><td>B0725</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamida</td><td>TCI</td><td>N0078</td><td></td></tr><tr><td>N-metilnicotinamida</td><td>TCI</td><td>M0374</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído (PFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>RedDot 2 Tinción nuclear ultrarroja</td><td>Biotio</td><td>#40061</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de perfusión de sacrificio</td><td>Leica</td><td>10030-380</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras</td><td>Fine Science Tools</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas serológicas</td><td>Costar Estéril</td><td>4488</td><td></td></tr><tr><td>incubadora agitadora</td><td>TAITEC</td><td>BR-43FM MR</td><td></td></tr><tr><td>Azida sódica (NaN3)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>447815000</td><td></td></tr><tr><td>Carbonato de sodio (Na2CO3)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L13098.36 Cloruro</td><td></td></tr><tr><td>de sodio (NaCl)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>447302500</td><td></td></tr><tr><td>Hidrogenocarbonato de sodio (NaHCO3)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>014707.A9</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX-G Tinción de ácido nucleico verde</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S7020</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr></tbody></table>

imágenes cuantitativas en 3d de células infectadas por trypanosoma cruzi, amastigotes latentes y células t en órganos aclarados intactos

Quantitative 3D Imaging of Trypanosoma cruzi-Infected Cells, Dormant Amastigotes, and T Cells in Intact Clarified Organs

La enfermedad de Chagas es una patología desatendida que afecta a millones de personas en todo el mundo, principalmente en América Latina. El agente de la enfermedad de Chagas, Trypanosoma cruzi (T. cruzi), es un parásito intracelular obligado con una biología diversa que infecta a varias especies de mamíferos, incluidos los humanos, causando patologías cardíacas y digestivas. La detección confiable de infecciones in vivo por T. cruzi ha sido necesaria durante mucho tiempo para comprender la compleja biología de la enfermedad de Chagas y evaluar con precisión el resultado de los regímenes de tratamiento. El protocolo actual demuestra una tubería integrada para la cuantificación automatizada de células infectadas por T. cruzi en órganos reconstruidos y despejados en 3D. La microscopía fluorescente de lámina de luz permite visualizar y cuantificar con precisión los parásitos T. cruzi que proliferan activamente y están latentes y las células efectoras inmunes en órganos o tejidos completos. Además, se adoptó con éxito la tubería CUBIC-HistoVision para obtener un etiquetado uniforme de los órganos despejados con anticuerpos y tinciones nucleares. La limpieza de tejidos junto con la inmunotinción 3D proporciona un enfoque imparcial para evaluar exhaustivamente los protocolos de tratamiento farmacológico, mejorar la comprensión de la organización celular de los tejidos infectados por T. cruzi y se espera que avance en los descubrimientos relacionados con las respuestas inmunes anti-T. cruzi, el daño tisular y la reparación en la enfermedad de Chagas.

Los tejidos fijos CUBIC se lavaron con PBS para eliminar los fijadores y luego se incubaron con cócteles CUBIC-L, una solución tamponada básica de aminoácidos alcoholes que extraen pigmentos y lípidos del tejido, lo que resulta en la decoloración del tejido mientras se mantiene la arquitectura del tejido. Las líneas de cuadrícula en el papel se pueden ver a través de los tejidos que indican una limpieza adecuada de los órganos (Figura 2A). Después de la deslipidación, los te...

El presente protocolo describe la microscopía fluorescente de lámina de luz y los métodos automatizados asistidos por software para visualizar y cuantificar con precisión los parásitos Trypanosoma cruzi proliferantes y latentes y las células T en órganos y tejidos intactos y despejados. Estas técnicas proporcionan una forma confiable de evaluar los resultados del tratamiento y ofrecen nuevos conocimientos sobre las interacciones parásito-huésped.

Imágenes cuantitativas en 3D de células infectadas por Trypanosoma cruzi, amastigotes latentes y células T en órganos aclarados intactos

Chagas disease is a neglected pathology that affects millions of people worldwide, mainly in Latin America. The Chagas disease agent, Trypanosoma cruzi ...

Esta técnica proporcionó una imagen más completa y 3D de órganos transparentes completos y fue útil para la cuantificación, no solo de la replicación, sino también de las células latentes del parásito y del factor inmune. Esta técnica nos permite determinar la asociación especial de parásitos, células inmunes y el daño tisular resultante de la infección. La inmunotinción de epítopos y el etiquetado de ADN también fueron comparables con esta técnica.Este protocolo se utilizó eficazmente para evaluar los resultados del tratamiento en modelos de ratón de la enfermedad de Chagas. Un tratamiento de dosis individuales más altas, administradas con menos frecuencia durante un período de tratamiento prolongado, elimina tanto los parásitos replicantes como los latentes. Demostrando el procedimiento estará Caleb Hawkins, un técnico de investigación del laboratorio de Rick Tarleton.Después de sacrificar, diseccionar y fijar los órganos de un ratón infectado como se describe en el manuscrito, sumerja los órganos individuales en 10 mililitros de CUBIC-L diluido en agua al 50%, con una agitación suave a temperatura ambiente en tubos cónicos de 50 mililitros durante la noche protegidos de la luz. Al día siguiente, reemplace 50% CUBIC-L con 10 mililitros de 100% CUBIC-L, e incube durante seis días a 37 grados centígrados, mientras mantiene el tubo plano en la incubadora del agitador. Al final de este período de incubación, los tejidos deben ser casi completamente transparentes.Lave los órganos transparentes dos veces con PBS durante dos horas a 37 grados centígrados, con una agitación suave. Con cada lavado, transfiera los tejidos a un nuevo tubo cónico de 50 mililitros para eliminar Triton X-100. Para la tinción de ADN, diluya el colorante de ácido nucleico disponible comercialmente en cinco mililitros de tampón de tinción a 1:2, 500.Luego, sumerja el tejido en un tubo cónico de 15 mililitros que contenga solución de tinte nuclear e incube a 37 grados centígrados, con una rotación suave durante cinco días en posición de pie. Lave el pañuelo tres veces con 15 mililitros de tampón de lavado de tinción nuclear 3D durante dos horas a temperatura ambiente, con una agitación suave. Calcular la cantidad requerida de anticuerpos primarios y secundarios.Mezcle los anticuerpos primarios y secundarios en un tubo ámbar de dos mililitros e incube a 37 grados centígrados durante 1,5 horas. Para el intercambio de tampón, mezcle 7.5 mililitros de tampón de inmunotinción 2x HV1 3D con 7.5 mililitros de agua doble destilada. Sumerja la muestra de tejido en el tampón e incube durante 1,5 horas a 32 grados centígrados, con una agitación suave en un tubo cónico de 15 mililitros en posición horizontal.Recoja la muestra de tejido del medio de intercambio de tampón y sumérjala en la solución de tinción de anticuerpos. Incubar los tejidos individualmente durante una semana a 32 grados centígrados, agitando suavemente los tubos en posición de pie lejos de la luz. Mueva las muestras de tejido a cuatro grados centígrados e incube de pie.Después de enfriar el tampón de lavado de inmunotinción HV1 3D a cuatro grados centígrados, lave la muestra con 15 mililitros de tampón dos veces a cuatro grados centígrados durante 30 minutos, cada uno con agitación suave en posición horizontal. Diluir la formalina al 1% en el tampón de lavado de inmunotinción HV1 3D y sumergir la muestra en ocho mililitros de la solución durante 24 horas a cuatro grados centígrados, con una agitación suave. Ahora, incube la muestra en una solución fresca de formalina al 1% durante una hora a 37 grados centígrados y lave en 15 mililitros de PBS durante dos horas a 25 grados centígrados.Sumerja los órganos transparentes en un tubo cónico de 50 mililitros que contenga cinco mililitros de solución CUBIC-R+ diluida en agua al 50% a temperatura ambiente, con una agitación suave. Reemplácelo por cinco mililitros 100%CUBIC-R+ e incubar con agitación suave durante dos días. Seque los tejidos con Kimwipes, y luego, transfiéralos a cinco mililitros de solución de montaje en una placa de cultivo de seis pocillos e incubarlos a temperatura ambiente.Adhiera los tejidos al soporte de la muestra del microscopio con pegamento de gel super. Sumerja las muestras en la cubeta de cuarzo del microscopio llena con 120 mililitros de solución de montaje. Imagínelos transversalmente a su eje longitudinal, y adhiera el corazón, con el ápice y la aorta alineados horizontalmente.El corazón infectado por Trypanosoma cruzi reconstruido en 3D mostró una mayor proporción de células infectadas en la aurícula, en comparación con los ventrículos. Los parásitos latentes se pueden identificar en el corazón, como se muestra en los recuadros ampliados en 3D. Las células T que expresan ZsGreen1, así como las células infectadas con Trypanosoma cruzi, se visualizaron en el músculo esquelético de un ratón reportero CD8 infectado con Trypanosoma cruzi.Los zooms 3D de la imagen reconstruida en 3D identificaron células T en la región de una célula infectada. La interfaz de las células T en las células infectadas por el huésped se visualizó mediante microscopía confocal. En el corazón de un ratón inmunodeficiente, se detectaron células huésped infectadas con dos cepas diferentes de Trypanosoma cruzi, y el corte a través de los tejidos mostró abundantes células infectadas por parásitos en las aurículas del corazón a varias profundidades de tejido.La inmunodetección de vasculatura en el corazón infectado y despejado por Trypanosoma cruzi revela la intrincada vasculatura del corazón. Se podían observar células infectadas con parásitos en las aurículas del corazón. La tinción nuclear del músculo esquelético mostró una acumulación de núcleos en áreas con pocos o indetectables parásitos tdTomato.El aumento de los marcadores reporteros de parásitos tdTomato y GFP con anticuerpos contra RFP y GFP, y todo el músculo esquelético aclarado dio como resultado una fuerte fluorescencia. Por lo tanto, los puntos críticos son el tiempo de incubación en el tampón cúbico, el tiempo de dilución e incubación en el colorante de ADN, el tiempo de incubación en los anticuerpos y el tiempo de incubación en la solución refractada de coincidencia de índices. El uso de tinción adicional, con colorante de anticuerpos específicos y reacción rápida, podría aumentar significativamente el potencial de esta técnica, permitiendo la detección de múltiples células, procesos y estructura en órganos intactos.Ahora tenemos una forma mejor y más completa de explorar las células inmunes responsables de matar a los parásitos, los tejidos donde los parásitos persisten crónicamente y la distribución de los medicamentos específicos en los tejidos.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Se muestra el método para realizar microscopía intravital del bazo con las buenas prácticas agrarias parásitos de la malaria transgénicos y la cuantificación de la movilidad del parásito y el flujo de sangre dentro de este órgano.

Microscopia intravital del bazo: Análisis cuantitativo de la movilidad del parásito y el flujo sanguíneo

Se describe un método de microscopía correlativa que combina alta velocidad de microscopía de luz fluorescente de células vivas 3D y la crio-tomografía electrónica de alta resolución. Se demuestra la capacidad del método correlativo por imágenes dinámicas, pequeñas partículas de VIH-1 que interactúan con las células HeLa de acogida.

Microscopía correlativa para el análisis estructural en 3D de Interacciones Dinámicas

El uso de este protocolo, hemos sido capaces de imagen de 160 micras de espesor secciones de cerebro de ratones infectados con el parásito Toxoplasma gondii, que permite la visualización y el análisis de la relación espacial entre el parásito enquistamiento y la neurona infectada.

Imaging 3-D y Análisis de neuronas infectadas En Vivo Con Toxoplasma gondii

Este manuscrito describe el uso de una cepa bioluminiscente de tripanosomas africanos para permitir el seguimiento de la infección en etapa tardía y demuestra cómo se pueden usar imágenes en vivo in vivo para visualizar infecciones dentro del sistema nervioso central en tiempo real.

Imágenes de bioluminiscencia para detectar la infección en fase tardía de la tripanosomiasis africana

En este protocolo, fluorescencia etiquetada T. cruzi fueron inyectadas en larvas de pez cebra transparente y motilidad del parásito fue observada en vivo usando microscopía de fluorescencia de la ficha técnica de iluminación.

Establecimiento de pez cebra Larval como modelo Animal para investigar Trypanosoma cruzi motilidad En Vivo

El agente Trypanosoma cruzi enfermedad de Chagas produce infecciones asintomáticas de larga duración que convertirse abruptamente en patología clínicamente reconocida. El siguiente protocolo de investigación describe un estudio epidemiológico de corto plazo basado en la familia para desentrañar la infección de T. cruzi transmitida sexual de los padres a la progenie.

Transmisión sexual de tripanosomas americanos de machos y hembras a compañeros de ingenua

Este protocolo describe los pasos para generar un modelo 3D de distribución de metabolitos durante la infección por tripanosomátidos, incluida la recolección de muestras, la extracción de metabolitos, una descripción general de la cromatografía líquida-adquisición de datos de espectrometría de masas en tándem, generación de modelos 3D y, finalmente, visualización de datos.

Enfoques de cartografía química para estudiar la infección por tripanosomátidos

Este estudio muestra un protocolo detallado para realizar microscopía de expansión de ultraestructura en tres etapas del ciclo de vida in vitro de Trypanosoma cruzi, el patógeno responsable de la enfermedad de Chagas. Incluimos la técnica optimizada para las proteínas del citoesqueleto y el marcaje panproteoma.

Microscopía de expansión ultraestructural en tres etapas del ciclo de vida in vitro de Trypanosoma cruzi

Aquí, describimos un procedimiento que permite la detección de bacterias patógenas en todo el órgano durante la infección y la cuantificación de las actividades de los reporteros fluorescentes.

Tomografía tridimensional de órgano entero de alta resolución de infecciones microbianas

El protocolo proporcionado aquí describe los pasos detallados para realizar estudios de eficacia de fármacos en un modelo bioluminiscente de infección por Trypanosoma cruzi , con un enfoque en la adquisición, análisis e interpretación de datos. También se proporcionan procedimientos de solución de problemas y control de calidad para minimizar los problemas técnicos.

Desmitificación de la imagen de bioluminiscencia in vivo de un modelo de ratón de enfermedad de Chagas para estudios de eficacia de fármacos

Aprende microscopía de fluorescencia con hoja de luz para cuantificar Trypanosoma cruzi y células T en órganos aclarados. Este método permite evaluar resultados terapéuticos en modelos de enfermedad de Chagas.

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