Fabricación de colgajos vasculares de ingeniería utilizando tecnologías de impresión 3D

Nuestro protocolo permite a los investigadores generar redes jerárquicas de vasos dentro de un colgajo totalmente diseñado e implantable, lo que allanó el camino para nuevos estudios sobre el comportamiento de los vasos sanguíneos bajo integración in vivo. Esta técnica combinó la versatilidad de dos tecnologías de impresión 3D para crear y ensamblar recipientes en la micro y mesoescala que se pueden anastomosar directamente con los vasos huésped utilizando microcirugía. Los colgajos vascularizados totalmente diseñados se pueden usar para tratar defectos tisulares grandes, así como para proporcionar una plataforma para estudiar el desarrollo y la integración de los tejidos.

Los métodos propuestos se pueden ampliar para estudiar la incorporación de células específicas de tejidos, así como para evaluar el uso de diferentes biotintas y materiales de soporte. Comience llenando el molde BVOH con 30 microlitros de la solución de polímero. Centrifugar el molde a 100 veces g durante 2 minutos y recargar el molde con otros 20 microlitros de la solución de polímero para garantizar un llenado completo.

Congele los moldes llenos a menos 80 grados centígrados durante al menos 30 minutos para asegurarse de que toda la solución de polímero se congele. Retire el disolvente de los moldes liofilizándolos durante la noche. Para eliminar el material del molde de sacrificio, transfiera los moldes después del proceso de liofilización a un baño de agua desionizada de 5 litros bajo una agitación suave.

Reemplace el agua en el baño cuando se turbe. Cuando todo el BVOH se disuelva, seque al aire los andamios y guárdelos en una cámara de vacío hasta su uso. Transfiera aproximadamente 4 mililitros del material de soporte preparado y compactado a cada pozo de una placa de 12 pocillos utilizando una pipeta de desplazamiento positivo.

Golpee la placa del pozo en una superficie dura para forzar que el material de soporte se extienda uniformemente en el pozo. Prepare una suspensión que contenga 2 millones de HAMEC-ZsGreen y 6 millones de células madre de pulpa dental en 10 mililitros de medio de células endoteliales. Centrifugar la suspensión celular a 200 veces g durante 4 minutos para obtener un pellet celular, luego aspirar el medio sobrenadante y resuspendir el pellet celular en 1 mililitro de biotinta rhCollMA para obtener una biotinta con una concentración celular total de 8 millones de células por 1 mililitro de biotinta.

Ajuste una aguja de 0,22 milímetros de diámetro interno a un cartucho de impresión ámbar de 3 mililitros y coloque el cartucho en un tubo cónico de 50 mililitros. Transfiera 1 mililitro de la mezcla de células y biotinta al cartucho de impresión llenándolo desde la parte superior con una pipeta de desplazamiento positivo para reducir las burbujas. Instale el cartucho de impresión en la herramienta adecuada en la bioimpresora.

Esboza un patrón 2D de un cuadrado de 4 milímetros que contiene un canal circular de 2 milímetros de diámetro en su centro. Extruir el boceto en 4 milímetros para obtener un cubo de 4 milímetros con un canal central. Exporte este objeto como un archivo STL.

Importe una plantilla STL de placa de 12 pocillos en la pestaña de modelado sólido en el software de corte de bioimpresora y colóquela en el área designada de la cama de impresión virtual. Importe el archivo STL de la forma del cubo en la pestaña de modelado sólido en el software de corte de bioimpresora. Haga clic en la casilla de verificación Usar segmentación de datos externa seguida de configurar segmentación de datos en la sección de propiedades del objeto.

En la ventana emergente, elija un patrón rectilíneo para el patrón de relleno y escriba 30% en la densidad de relleno, haga clic en aceptar. Haga clic en el cubo y muévalo con el mouse para colocar una copia de la forma del cubo en cada pozo virtual deseado. Haga clic en el botón Agregar material en la pestaña de materiales del software de corte de bioimpresora para crear nuevas configuraciones de material para la biotinta rhCollMA.

Elija la configuración de material para imprimir. Para la presión, tipo 2 psi, y para el tipo de velocidad 20 milímetros por segundo en las casillas correspondientes. Asigne los valores de ancho de línea y alto de línea a 0,24 milímetros y el valor de aceleración a 400 milímetros por segundo cuadrado.

En la pestaña de modelado sólido, haga clic en el objeto cubo y luego haga clic en el material rhCollMA de la sección material para asignarlo a la forma del cubo. En la pestaña bioensamblaje, haga clic en el botón Enviar trabajo de impresión para enviar el trabajo de impresión a la bioimpresora. Cargue el cartucho de impresión cargado con la biotinta celular en la herramienta de dispensación neumática ambiental de 3 mililitros de la bioimpresora basada en extrusión 3D.

Haga clic en el botón Enfriar debajo de la pestaña Control de calefacción o refrigeración en la pantalla de la interfaz de la bioimpresora para establecer la temperatura de la cama de impresión en 4 grados centígrados. Cargue la placa con el baño de soporte en la cama de la impresora. En la pestaña Imprimir en la pantalla de la interfaz de la bioimpresora, haga clic en el trabajo de impresión, luego haga clic en Inicio, seguido de GO para comenzar el trabajo de impresión.

Después de imprimir, exponga la placa del pozo a una fuente de luz de 405 nanómetros con una intensidad de 3 milivatios por centímetro cuadrado durante 30 segundos para iniciar la reticulación de la biotinta rhCollMA. Después de la reticulación, incube la placa del pozo a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono durante al menos 20 minutos hasta que todo el baño de soporte se derrita. Aspire suavemente el baño de soporte licuado y reemplácelo con el medio de células endoteliales.

Incubar las construcciones a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Inmediatamente después de la extracción del material de soporte de la red microvascular bioimpresa, coloque un andamio vascular PLLA:PLGA recubierto de fibronectina junto a la estructura bioimpresa. Inserte el andamio vascular en el canal principal de la estructura bioimpresa.

Incubar las construcciones ensambladas a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono durante dos días. Preparar una suspensión celular de células endoteliales microvasculares adiposas humanas que expresan tdTomato a una concentración de 10 millones de células por mililitro. Coloque una gota de 20 microlitros de esta suspensión celular sobre una superficie hidrofóbica.

Coloque suavemente los andamios vasculares en la parte superior de la gota de modo que la luz del andamio en un extremo haga contacto con la gota celular. Aspire la gota desde el extremo opuesto del andamio llenando su lumen con la suspensión celular. Coloque el andamio sentado en un tubo de microcentrífuga y colóquelo en un rotador dentro de una incubadora humidificada durante 60 minutos.

Finalmente, transfiera el andamio a una placa de 12 pocillos y agregue 2 mililitros de medio de células endoteliales. La vista lateral de un colgajo de ingeniería representativo fotografiado cuatro días después del revestimiento endotelial del andamio vascular se muestra aquí. La microvasculatura bioimpresa se muestra en verde, mientras que el revestimiento endotelial se muestra en rojo.

La imagen representativa muestra las anastomosis entre la vasculatura bioimpresa y el revestimiento endotelial. La inmunotinción para la actina del músculo liso, los núcleos y las células endoteliales después de siete días de incubación se muestra aquí. La imagen representativa muestra anastomosis completadas del colgajo diseñado con la arteria femoral de una rata antes de la extracción de la pinza y después de la extracción de la abrazadera.

Esta técnica se puede utilizar para estudiar la maduración e integración de la vasculatura impresa en 3D in vivo y monitorear la perfusión del implante en la extremidad posterior para establecer el potencial y la seguridad de su uso para tratar defectos tisulares.