Determinación de la afinidad de unión (K_D) de anticuerpos radiomarcados a antígenos inmovilizados

Este método puede determinar la afinidad de unión de un anticuerpo radiomarcado para su antígeno. También medirá la especificidad de la vinculación. La principal ventaja de este método simple es la caracterización específica de la afinidad de unión de solo el anticuerpo radiomarcado sin interferencia del anticuerpo parental no conjugado.

Esta técnica valida cuantitativamente la capacidad de un anticuerpo radiomarcado para unirse a su objetivo. Esto es importante para aplicaciones en imágenes nucleares y en terapia nuclear en una variedad de enfermedades. Demostrando el procedimiento estará Erika Belitzky, una asociada de posgrado de mi laboratorio.

Para comenzar, prepare un tampón de inmovilización agregando 191 miligramos de bicarbonato de sodio y 23.9 miligramos de carbonato de sodio a un tubo cónico de 50 mililitros. Luego, agregue 40 mililitros de agua de 18 megaohmios y disuelva por vórtice. Ahora, ajuste el pH a 9.0 antes de llevar el volumen total a 50 mililitros.

A continuación, prepare 200 mililitros de tampón de lavado agregando 200 mililitros de PBS y 100 microlitros de Tween 20 a una botella de 250 mililitros. También prepare 50 mililitros de tampón de unión agregando 50 miligramos de BSA y 25 microlitros de Tween 20 a 50 mililitros de PBS y mezcle por vórtice. Agregue 1.5 gramos de BSA a 50 mililitros de PBS para preparar el tampón de bloqueo y el vórtice suavemente para mezclar.

Diluya el antígeno en tampón de inmovilización. Luego, tome una placa rompible de 96 pocillos y fondo plano y agregue 100 microlitros de antígeno al fondo de cada pozo de 24 pozos en una matriz de ocho por tres. Cubra la placa con cinta de sellado e incube a cuatro grados centígrados durante la noche.

Al día siguiente, lave el plato tres veces con tampón de lavado. Invierta la placa rápidamente en el fregadero para desechar el líquido y golpee la placa con una pila de toallas de papel para eliminar el exceso de líquido. Luego, a los pozos que contienen el antígeno, agregue 300 microlitros de tampón de lavado por pozo usando una pipeta multicanal.

Agregue 300 microlitros de tampón de bloqueo por pozo a los pozos recubiertos de 24 antígenos y a los 24 pozos vacíos de la placa de 96 pocillos. Luego, incuba la placa durante una hora a temperatura ambiente y lava cada pozo de la placa tres veces con 300 microlitros de tampón de lavado. Realice diluciones en serie triples del anticuerpo radiomarcado en el tampón de unión para ocho filas designadas como A a H en la placa.

Primero, calcule el volumen de anticuerpos radiomarcados de stock necesarios para hacer una solución de 1,2 mililitros de la primera concentración. Luego, agregue 800 microlitros de tampón de unión a los tubos de microcentrífuga etiquetados de B a H y agregue el volumen requerido de tampón de unión a un tubo de microcentrífuga etiquetado como A.Agregue el volumen calculado de anticuerpos radiomarcados de stock al tubo A y al vórtice suavemente. Luego, gire hacia abajo usando una mini-microcentrífuga para recoger todo el líquido en la parte inferior del tubo.

A continuación, agregue 400 microlitros de líquido de dos A al tubo B.Después del vórtice, gírelo hacia abajo con una mini-microcentrífuga. Del mismo modo, agregue solución del tubo B al tubo C, C a D, hasta el tubo H.Agregue 100 microlitros de cada dilución por pozo a tres pozos inmovilizados con antígeno y tres pozos bloqueados solo con BSA. Ahora, agregue 100 microlitros de cada dilución a los tubos de microcentrífuga etiquetados como estándar A a estándar H y guarde estos tubos como estándares de anticuerpos radiomarcados para ser ensayados en el contador gamma.

Incubar el plato durante una hora a 37 grados centígrados con un balanceo suave. Etiquete los tubos de microcentrífuga para cada pozo como se describe en el manuscrito. Aspire el anticuerpo radiomarcado de los pocillos de la placa de 96 pocillos utilizando un aspirador de vacío.

Ahora, usando una pipeta multicanal, agregue 300 microlitros de tampón de lavado a cada pozo. Aspire el tampón de lavado y repita el lavado cuatro veces más. Rompa los pozos en los tubos de microcentrífuga apropiados.

Cuente la radiactividad en los tubos con el antígeno marcado como H1, H2, H3, H3 a A1, A2, A3, y luego con BSA solo marcado como H4, H5, H6, a A4, A5, A6 usando un contador gamma. El amivantamab radiomarcado mostró una unión específica para las proteínas EGFR y cMET. De manera similar, las afinidades de unión también fueron retenidas por fabs radiomarcadas de un solo brazo unidas a las proteínas EGFR y cMET.

Las gráficas de unión a la saturación mostraron que cuando las concentraciones de anticuerpos radiomarcados eran demasiado bajas, no se alcanzaba la saturación, como indica la curva lineal. Las concentraciones de anticuerpos radiomarcados que eran demasiado altas condujeron a la saturación sin un crecimiento logarítmico distinto, como lo demuestra la meseta horizontal. Además, se observó una alta unión inespecífica debido a las altas concentraciones de anticuerpos radiomarcados.

Este procedimiento puede tomar múltiples intentos para optimizar el rango de concentración para cada anticuerpo radiomarcado específico. Utilice datos de resultados negativos para ayudar a diseñar experimentos futuros. Una vez que se conoce la afinidad de unión, se puede utilizar como punto de referencia para otros ensayos in vitro como parte de la caracterización de un anticuerpo radiomarcado.