Name: Aislamiento e identificación de bacterias resistentes a antibióticos transmitidas por el agua y caracterización molecular de sus genes de resistencia a antibióticos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-03T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Aprende a aislar e identificar bacterias resistentes a antibióticos en muestras de agua mediante técnicas de cultivo y metagenómica. Este protocolo detecta microorganismos cultivables y no cultivables para un análisis completo de genes de resistencia.

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Este trabajo fue parcialmente apoyado por subvenciones financieras del Departamento de Ciencia y Tecnología-Promoción de la Investigación Universitaria y el Esquema de Excelencia Científica (DST-PURSE) de la Universidad de Mumbai. Devika Ghadigaonkar trabajó como becaria de proyecto bajo el esquema. Se reconoce la ayuda técnica proporcionada por Harshali Shinde, investigador principal del Proyecto n.º de investigación del Departamento de Ciencia y Tecnología-Junta de Investigación de Ciencia e Ingeniería (DST-SERB): CRG / 2018 / 003624.

1. Recogida y procesamiento de muestras
<ol><li>Recogida de muestras<ol><li>Recoja el volumen apropiado de la muestra de agua en recipientes de muestras estériles, asegurándose de que no se llenen más de 3/4 del recipiente.</li>
		<li>Transportar las muestras al laboratorio en condiciones asépticas tan pronto como sea posible después de la recolección y procesarlas inmediatamente.</li>
	</ol></li>
	<li>Procesamiento de muestras<ol><li>Filtrar asépticamente la muestra de agua a través de un paño de muselina estéril para eliminar cualquier partícula.</li>
		<li>Llevar a cabo diluciones seriadas apropiadas del agua filtrada para su posterior análisis.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Estimación de la carga bacteriana total y del recuento de bacterias resistentes a los antibióticos
<ol><li>Determinación de la carga bacteriana total<ol><li>Suspender 18,12 g de agar R2A, polvo modificado en 1.000 ml de agua doble destilada, y disolver la mezcla por calentamiento. Autoclave la mezcla disuelta a 121 °C, 15 psi durante 20 min. Prepare agar R2A, placas modificadas vertiendo la cantidad apropiada de la mezcla esterilizada en autoclave en placas de Petri estériles (por ejemplo, agregue aproximadamente 20 ml de medio estéril esterilizado en autoclave a una placa de Petri estéril de 90 mm).</li>
		<li>Distribuir uniformemente 100 μL de las diluciones apropiadas de la muestra de agua filtrada en el agar R2A, placa modificada una vez que el medio se solidifique. Realice el experimento por duplicado.</li>
		<li>Incubar todas las placas anteriores a 35-37 °C durante 48 h (variar la temperatura y el tiempo de incubación dependiendo del medio utilizado para el aislamiento).</li>
		<li>Expresar la carga bacteriana total en términos de unidades formadoras de colonias por mililitro (UFC/ml) utilizando la ecuación (1): <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63934/63934eq01.jpg" style="margin: auto;">(1)</li>
	</ol></li>
	<li>Determinación del recuento bacteriano de AR<ol><li>Siga los pasos 2.1.1-2.1.4. Sin embargo, en lugar de agar R2A, las placas modificadas, use agar R2A, placas modificadas complementadas individualmente con cinco antibióticos diferentes, a saber, cefotaxima (3 μg / ml), ciprofloxacina (0.5 μg / ml), eritromicina (20 μg / ml), kanamicina (15 μg / ml) y vancomicina (3 μg / ml).</li>
		<li>Añadir los antibióticos por separado en tubos que contengan 20 ml de agar R2A fundido estéril, modificado (con la temperatura del agar R2A fundido, modificado a ≤40 °C) para alcanzar la concentración final de antibiótico como se menciona en el paso 2.2.1.</li>
		<li>Agite para mezclar uniformemente y vierta en placas de Petri estériles antes de que el agar se solidifique. Realice el experimento por duplicado.</li>
		<li>Incubar todas las placas anteriores a 35-37 °C durante 48 h (si se utiliza un medio diferente, la temperatura y el tiempo de incubación pueden variar).</li>
		<li>Para el control de calidad y la comprobación de la eficacia de los antibióticos, esparcir 100 μL de suspensiones bacterianas de las cepas de Agar R2A de Escherichia coli ATCC 25922 y Staphylococcus aureus ATCC 29213 en sus respectivas placas modificadas de Agar R2A que contienen antibióticos (asegúrese de que la densidad del cultivo fresco utilizado para la inoculación sea OD = 0,5 a 600 nm).</li>
		<li>Determinar el recuento bacteriano resistente a los antibióticos en términos de UFC/ml como se describe en el paso 2.1.4.</li>
	</ol></li>
	<li>Existencias de glicerol de las cepas aisladas<ol><li>Seleccionar colonias de AR morfológicamente distintas.</li>
		<li>Suspender una sola colonia aislada en 2 ml de caldo estéril de Luria-Bertani que contenga el antibiótico respectivo (por ejemplo, si se seleccionó una colonia de una placa que contiene cefotaxima, inocular la colonia del paso 2.3.1 en caldo estéril de Luria-Bertani que contenga cefotaxima en su concentración respectiva).</li>
		<li>Incubar los tubos inoculados a 37 °C a 80 rpm hasta que el OD600 alcance 0,5.</li>
		<li>Preparar las existencias de glicerol de los aislados mezclando 750 μL de la suspensión de cultivo del paso 2.3.3 en 250 μL de glicerol estéril al 100% en condiciones asépticas.</li>
		<li>Almacenar las existencias de glicerol a -80 °C hasta un análisis adicional. NOTA: Para la reactivación de los cultivos de las reservas de glicerol, descongelar las reservas de glicerol a 4 °C. Inocular un bucle de este caldo en 2 ml de caldo estéril Luria-Bertani que contiene el antibiótico respectivo y dejar crecer.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Identificación de bacterias cultivables mediante secuenciación del gen 16S rRNA
<ol><li>Preparación de la plantilla de ADN a partir de los aislados para PCR NOTA: El protocolo descrito para la preparación de la plantilla de ADN para PCR para el aislamiento de ADN crudo de la bacteria es dado por Carlson et al.10.<ol><li>Usando un palillo de dientes estéril, tome una colonia única, aislada y pura del aislado que crece en una placa de Petri. Suspender la colonia bacteriana en 100 μL de agua estéril doble destilada en un tubo de microcentrífuga estéril y hervir durante 10 min.</li>
		<li>Centrifugar la suspensión a 10.000 × g durante 2 minutos para granular los residuos y transferir el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga estéril nuevo para su uso como plantilla de ADN crudo.</li>
	</ol></li>
	<li>Amplificación por PCR dirigida de la región V3 del gen 16S rRNA y secuenciación<ol><li>Preparar 40 μL de la mezcla de reacción en un tubo de PCR para la amplificación por PCR, como se menciona en la Tabla 1. NOTA: La preparación de ADN debe llevarse a cabo en un bloque de hielo minimizando la posibilidad de contaminación (use guantes mientras manipula los reactivos y limpie la superficie de trabajo a fondo con etanol al 70%).</li>
		<li>Coloque el tubo en el bloque térmico y ejecute el programa apropiado en el termociclador de PCR. Consulte la Tabla 2 para las condiciones estandarizadas de ciclo de PCR y la información del manual para la amplificación de las regiones V3 de los genes 16S rRNA.</li>
		<li>Para resolver los amplicones y la visualización, realice electroforesis en gel de agarosa (AGE). Mezclar 10 μL del producto de PCR amplificado y 2 μL de tampón de carga de gel 6x (Tabla 3), y cargar esta mezcla en pocillos en gel de agarosa al 1,5% (disolver 1,5 g de polvo de agarosa en 100 ml de 1x tampón TAE [Tabla 3]) que contiene 5 μL de bromuro de etidio (EtBr) a una concentración final de 0,5 μg/ml de EtBr en 100 ml del gel de agarosa. PRECAUCIÓN: EtBr es un potente carcinógeno. Se deben usar guantes en todo momento mientras se manipula EtBr y geles que contengan EtBr.</li>
		<li>Agregue una escalera de ADN para la estimación del tamaño de los amplicones.</li>
		<li>Realice la electroforesis del gel en un tampón de tanque TAE a 80-100 V.</li>
		<li>Una vez que el tinte de seguimiento ejecute 3/4 del gel, detenga la electroforesis y visualice las bandas de amplicón bajo un transiluminador UV.</li>
		<li>Utilice el producto de PCR (amplicón) para la secuenciación del gen 16S rRNA para identificar el aislado.</li>
		<li>Cuantificar el amplicón sometiéndolo a análisis espectrofotométrico usando la ecuación (2). <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63934/63934eq02.jpg" style="margin: auto;">(2)</li>
		<li>Para verificar la pureza del ADN, calcule la proporción de A260 / A280. NOTA: Idealmente, este número debe estar por encima de 1.5 y, preferiblemente, entre 1.8 y 2.0.</li>
		<li>Para identificar los aislamientos, compare las secuencias que se obtienen con las bases de datos de secuencias utilizando una herramienta de búsqueda de alineación adecuada.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Detección de resistencia a antibióticos en los aislados mediante pruebas de sensibilidad a antibióticos
NOTA: Este protocolo describe el método para la prueba de susceptibilidad a los antibióticos (AST) por difusión de disco. Se utilizaron los siguientes discos antibióticos: cefotaxima (5 μg), ampicilina (10 μg), levofloxacino (5 μg), cloranfenicol (30 μg), tigeciclina (15 μg), ceftriaxona (30 μg), imipenem (10 μg), gentamicina (10 μg), neomicina (10 μg), trimetoprima (5 μg) y ciprofloxacino (5 μg).
<ol><li>Preparación del inóculo para el AST<ol><li>Inocular asépticamente una colonia de RA única, aislada y purificada utilizando un asa estéril en 2 ml de un medio estéril no selectivo, como el caldo Luria-Bertani (sin ningún antibiótico), e incubar a 37 °C a 80 rpm durante la noche.</li>
		<li>Resuspender tomando 100-150 μL del cultivo cultivado durante la noche (aproximadamente, OD 600 = 1.8-2.0) en 2 ml de medio de caldo fresco no selectivo Luria-Bertani e incubar durante 2-4 h (hasta que el OD600 alcance 0.4-0.5).</li>
		<li>Diluir esta suspensión de cultivo recién cultivada utilizando solución salina estéril al 0,85% de tal manera que la densidad del cultivo sea igual a 0,5 McFarland estándar (aproximadamente, OD600 = 0,1), que corresponde aproximadamente a 1-2 × 108 células/ml.</li>
		<li>Mezcle suavemente la suspensión bacteriana para una distribución celular uniforme.</li>
		<li>Use la suspensión anterior dentro de los 15 minutos posteriores a la dilución.</li>
	</ol></li>
	<li>Inoculación de las placas de agar<ol><li>Prepare placas de agar Mueller-Hinton (MHA) para realizar el AST mezclando 38 g de MHA en 1,000 ml de agua doble destilada y disuelva la mezcla calentando. Autoclave la mezcla disuelta a 121 °C, 15 psi durante 15 min.</li>
		<li>Asegúrese de que la profundidad de MHA en las placas sea de 4 mm (25 ml de medio por placa).</li>
		<li>Simultáneamente, retire los discos antibióticos del congelador y caliéntelos a temperatura ambiente. NOTA: Los discos antibióticos deben descongelarse gradualmente descongelándolos inicialmente a 4 °C y posteriormente a temperatura ambiente para reducir cualquier peligro potencial de condensación en los discos, que posteriormente puede afectar a la zona de inhibición (ZOI).</li>
		<li>En condiciones asépticas, sumergir un hisopo de algodón estéril en el inóculo preparado en el paso 4.1 y eliminar el exceso de suspensión para evitar la sobreinoculación de las placas.</li>
		<li>Extienda el cultivo uniformemente en las placas, comenzando desde la parte superior de la placa MHA y yendo y viniendo de borde a borde. Gire la placa 60° mientras frota.</li>
	</ol></li>
	<li>Aplicación de los discos antibióticos<ol><li>Con la ayuda de fórceps esterilizados por llama, transfiera asépticamente los discos antibióticos a las placas MHA inoculadas y presione los discos suavemente para asegurar un contacto nivelado completo con el agar. NOTA: Este procedimiento debe realizarse dentro de los 15 minutos posteriores a la inoculación del cultivo en las placas.</li>
		<li>Coloque el número adecuado de discos antibióticos en la placa de agar teniendo en cuenta el organismo, el antibiótico utilizado y el tamaño de la placa para evitar la superposición de las zonas de inhibición. NOTA: Se pueden acomodar de cuatro a cinco discos en una placa circular de 90 mm.</li>
	</ol></li>
	<li>Incubación de las placas<ol><li>Dentro de los 15 minutos posteriores a la aplicación de los discos antibióticos, invertir las placas e incubar a 37 °C durante la noche.</li>
	</ol></li>
	<li>Interpretación de los resultados<ol><li>Mida el diámetro ZOI en milímetros (mm) e infórmelo de acuerdo con los valores de punto de ruptura dados por EUCAST11. Véanse los dos ejemplos que figuran a continuación.<ol><li>El punto de ruptura del diámetro de la zona (mm) para un disco antibiótico ciprofloxacino (5 μg) para Enterobacterales es S ≥ 25 y R &lt; 22, lo que significa que se considera sensible (S) si ZOI ≥ 25 mm, mientras que es resistente (R) si ZOI &lt; 22 mm. Si el diámetro de ZOI cae entre 22 y 25, el aislado se considera intermedio (I).</li>
			<li>El punto de ruptura del diámetro de la zona (mm) para un disco antibiótico cloranfenicol (30 μg) para Staphylococcus spp. es S ≥ 18 y R &lt; 18, lo que significa que se considera sensible si ZOI ≥ 18 mm, mientras que es resistente si ZOI &lt; 18 mm.</li>
		</ol></li>
		<li>Determine el índice de resistencia a antibióticos múltiples (SAM) encontrando la relación entre el número de antibióticos a los que el aislado es resistente y el número total de antibióticos a los que está expuesto el aislado. NOTA: Para el control de calidad, E. coli ATCC 25922 y S. áureo ATCC 29213 se utilizan como cepas de referencia siguiendo el protocolo como en el paso 4.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Detección basada en PCR de genes de resistencia a antibióticos en los aislados
<ol><li>Utilice un protocolo de PCR estándar para la identificación de ARG en los aislados. Prepare la plantilla de ADN utilizando el protocolo indicado en el paso 3.1. NOTA: Las condiciones de ciclo de PCR utilizadas en este estudio fueron 94 °C durante 10 min, seguidas de 35 ciclos de 94 °C durante 30 s, recocido durante 30 s a la temperatura apropiada (estandarizado para cada juego de cebadores), extensión a 72 °C durante 40 s y una extensión final a 72 °C durante 5 min. La mezcla de reacción se describe en la Tabla 4. La lista de ARG, cebadores y temperaturas de recocido se da en la Tabla 5.</li>
	<li>Para resolver, visualizar y comprobar la pureza de los amplicones, siga los pasos 3.2.3-3.2.10.</li>
</ol>6. Análisis de ADN metagenómico completo para la identificación de la diversidad bacteriana total y la detección de ARG en el metagenoma
<ol><li>Extracción del ADN total (metagenoma) de la muestra de agua<ol><li>Extraer el ADN metagenómico de las muestras de agua filtrada. NOTA: En el presente estudio, el ADN metagenómico (ADN total) se extrajo de las muestras de agua filtrada utilizando el kit de aislamiento de ADN referenciado siguiendo el protocolo del fabricante (ver la Tabla de materiales).</li>
		<li>Verifique la calidad del ADN cargando 3 μL del ADN metagenómico extraído en un gel de agarosa al 0,8% y ejecute el gel a 80-110 V durante aproximadamente 30 minutos.</li>
		<li>Compruebe la presencia de una sola banda intacta.</li>
		<li>Verifique la concentración de ADN con un fluorómetro.</li>
	</ol></li>
	<li>Determinación de la diversidad bacteriana y detección de ARG mediante secuenciación de ADN metagenómico completo<ol><li>Preparación de bibliotecas y amplificación por PCR:<ol><li>Prepare una biblioteca de secuenciación de extremo emparejado utilizando el kit de preparación de la biblioteca de ADN al que se hace referencia (consulte la Tabla de materiales).</li>
			<li>Prepare el ADN para la ligadura del adaptador tomando 200 ng de ADN y cortándolo mecánicamente en fragmentos más pequeños, seguido de un paso continuo de reparación final en el que se agrega una "A" a los extremos 3'.</li>
			<li>Dependiendo de la plataforma utilizada para la secuenciación, ligar adaptadores específicos a ambos extremos de los fragmentos de ADN. NOTA: Las secuencias cruciales para enlazar bibliotecas con doble código de barras a una celda de flujo para la secuenciación están presentes en estos adaptadores. Esto permite la amplificación por PCR de los fragmentos ligados por adaptador y la unión de los cebadores de secuenciación estándar.</li>
			<li>Para verificar la calidad y la cantidad, analice la biblioteca amplificada utilizando un chip de ADN de alta sensibilidad según las instrucciones del fabricante.</li>
		</ol></li>
		<li>Generación y secuenciación de clústeres:<ol><li>Cargue la biblioteca amplificada en la plataforma de secuenciación adecuada para la generación de clústeres y la secuenciación posterior. NOTA: Las moléculas de biblioteca se unen a los oligos adaptadores complementarios en la celda de flujo de extremo pareado. Durante la secuenciación, las hebras hacia adelante se escinden selectivamente después de la resíntesis de la cadena inversa. Esta hebra inversa copiada se secuencia desde el extremo opuesto del fragmento.</li>
		</ol></li>
		<li>Análisis bioinformático:<ol><li>Genere andamios a partir de los datos de alta calidad utilizando la plataforma adecuada.</li>
			<li>Someter estos andamios a análisis bioinformáticos para la clasificación taxonómica e identificación de los ARGs. NOTA: El flujo de trabajo para todo el análisis de ADN metagenómico para la identificación de la diversidad bacteriana total y la detección de ARG en el metagenoma se da en la Figura 1. Un diagrama de flujo de la metodología completa descrita en el manuscrito se da en la Figura 2.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Akers, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aminoglycoside+resistance+and+susceptibility+testing+errors+in+Acinetobacter+baumannii-calcoaceticus+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Aminoglycoside resistance and susceptibility testing errors in Acinetobacter baumannii-calcoaceticus complex.</a> Journal Of Clinical Microbiology. 48 (4), 1132-1138 (2010).</li>
<li>Ciesielczuk, H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Extra-intestinal+pathogenic+Escherichia+coli+in+the+UK%3A+The+importance+in+bacteraemia+versus+urinary+tract+infection%2C+colonisation+of+widespread+clones+and+specific+virulence+factors%22">Extra-intestinal pathogenic Escherichia coli in the UK: The importance in bacteraemia versus urinary tract infection, colonisation of widespread clones and specific virulence factors</a>. , Queen Mary University of London. PhD thesis (2015).</li>
</ol>

Los autores no tienen intereses contradictorios que revelar.

La recolección y el procesamiento de la muestra juegan un papel importante y pueden afectar los resultados y la interpretación del estudio. Por lo tanto, para descartar la variabilidad en las muestras, es importante llevar a cabo el muestreo en múltiples ubicaciones de la masa de agua dulce que se está estudiando. Mantener condiciones ambientales asépticas adecuadas al manipular dichas muestras puede prevenir la contaminación. Además, para evitar cambios en la composición bacteriana que puedan influir en la calidad y can...

La resistencia a los antimicrobianos (RAM) se ha identificado como uno de los problemas mundiales más acuciantes. La rápida evolución de la RAM y su propagación mundial son una de las mayores amenazas para la salud humana y la economía mundial en términos de los costos de salud asociados con ella1. El uso excesivo y el mal uso de antibióticos han llevado a un aumento en AR. Esto ha sido destacado por la pandemia de COVID-19, durante la cual el tratamiento de infecciones secundarias asociadas, en muchos casos, se vio enormemente comprometido debido a la RAM en los pacientes afectados2. Además del uso directo / mal uso de antibióticos por parte de los seres humanos, el uso excesivo y el mal uso de antibióticos en la agricultura y la ganadería y su descarga inadecuada en el medio ambiente, incluidas las masas de agua, son una preocupación importante3. El aumento de nuevos rasgos de resistencia y resistencia a múltiples fármacos en bacterias resalta urgentemente la necesidad de una mejor comprensión de los factores que conducen al desarrollo de AR y su diseminación. Múltiples bacterias resistentes a los antibióticos, que a menudo portan múltiples genes AR (ARG) en elementos genéticos móviles como los plásmidos, pueden transferir estos genes de resistencia a microorganismos no resistentes, incluidos los patógenos humanos potenciales, lo que lleva a la aparición de superbacterias que son intratables incluso con antibióticos de último recurso4. Estas múltiples bacterias resistentes a los antibióticos, si están presentes en los ecosistemas acuáticos, pueden ingresar directamente al intestino humano a través del consumo de alimentos contaminados a base de agua como peces, cangrejos y moluscos. Estudios previos han demostrado que la propagación de bacterias AR en sistemas de agua naturales también puede llegar a otros suministros de agua, incluida el agua potable, y, por lo tanto, puede ingresar a la cadena alimentaria humana 5,6,7.
El objetivo del presente estudio es proporcionar un protocolo integral utilizando una combinación de técnicas basadas en cultivos y no basadas en cultivos (análisis metagenómico completo) para obtener información completa sobre la diversidad bacteriana total y el conjunto total de diferentes ARG presentes en un cuerpo de agua en Mumbai, India. Convencionalmente, se han utilizado técnicas basadas en el cultivo para estudiar la diversidad bacteriana en cuerpos de agua. Como los microorganismos cultivables constituyen solo un pequeño porcentaje de la microbiota total en cualquier nicho, para tener una mejor comprensión del estado general de la diversidad bacteriana y los diversos rasgos resistentes que prevalecen en cualquier muestra, se deben utilizar varias técnicas basadas en el cultivo e independientes del cultivo en conjunto. Una de esas técnicas robustas y confiables independientes del cultivo es el análisis de ADN metagenómico completo. Este método de alto rendimiento ha sido utilizado con éxito en diversos estudios sobre diversidad bacteriana o anotaciones funcionales de varios ARG 8,9. Esta técnica utiliza el metagenoma (el material genético total en una muestra) como material de partida para varios análisis y, por lo tanto, es independiente del cultivo. Los protocolos del presente estudio se pueden utilizar para el análisis de ADN metagenómico completo para obtener información sobre la diversidad bacteriana total y varios ARG (resistoma) en muestras de agua.

<table><tbody><tr><td>Escalera de ADN de 100 pb</td><td>Himedia</td><td>MBT049-50LN</td><td>Para la estimación del tamaño de los amplicones</td></tr><tr><td>2x PCR Taq mastermix</td><td>HiMedia</td><td>MBT061-50R</td><td>Para hacer la mezcla de reacción PCR</td></tr><tr><td>37 &deg; C Incubadora</td><td>GS-192, Gayatri Scientific</td><td>NA</td><td>Para la incubación de bacterias</td></tr><tr><td>6x Tampón de carga de gel</td><td>HiMedia</td><td>ML015-1ML</td><td>Colorante de carga y seguimiento que ayuda a pesar la muestra de ADN y a seguir el progreso de la electroforesis</td></tr><tr><td>Polvo de agarosa</td><td>Himedia</td><td>MB229-50G</td><td>Para la resolución de amplicones durante la electroforesis en gel de agarosa (AGE)</td></tr><tr><td>Disco antibiótico de ampicilina</td><td>HiMedia</td><td>SD002</td><td>Para la realización</td></tr> de <tr><td>AST Autoclave</td><td>Equitron</td><td>NA</td><td>Necesario para la esterilización de medios, placas de vidrio, tubos de ensayo, etc</td></tr>. <tr><td>Bioanalyzer 2100</td><td>Agilent Technologies</td><td>NA</td><td>Para comprobar la calidad y cantidad de la biblioteca amplificada</td></tr><tr><td>Bisafety B2 Armario</td><td>IMSET IMSET</td><td>BSC-Clase II Tipo B2</td><td>Se utiliza para trabajos microbiológicos como el cultivo de bacterias, AST, etc.</td></tr><tr><td>Disco antibiótico de cefotaxima</td><td>HiMedia</td><td>SD295E-5VL</td><td>Para realizar AST</td></tr><tr><td>Polvo de antibiótico de cefotaxima</td><td>HiMedia</td><td>TC352-5G</td><td>Para la preparación de la solución madre de antibióticos necesaria durante el aislamiento de bacterias resistentes a los antibióticos Disco de</td></tr><tr><td>antibiótico de ceftriaxona</td><td>HiMedia</td><td>SD065</td><td>Para realizar</td></tr> la <tr><td>centrífuga AST Minispin</td><td>Eppendorf</td><td>Minispin Plus-5453</td><td>Se utiliza para granular los restos durante la preparación del ADN crudo</td></tr><tr><td>Disco antibiótico de cloranfenicol</td><td>HiMedia</td><td>SD006-5x50DS</td><td>Para realizar AST</td></tr><tr><td>Disco antibiótico de ciprofloxacina</td><td>HiMedia</td><td>SD060-5x50DS</td><td>Para realizar AST</td></tr><tr><td>Ciprofloxacina antibiótico en polvo</td><td>HiMedia</td><td>TC447-5G</td><td>Para la preparación de la solución madre de antibióticos necesaria durante el aislamiento de antibióticos resistentes bacterias</td></tr><tr><td>Colorímetro</td><td>Quest</td><td>NA</td><td>Para comprobar el diámetro exterior de las suspensiones de cultivo</td></tr><tr><td>Base de datos</td><td></td><td></td> completa de resistencia a antibióticos (CARD) <td>anotación funcional de ARG; https://card.mcmaster.ca/</td></tr> <tr><td>Incubadora agitadora de enfriamiento</td><td>BTL41 Allied Scientific</td><td>NA</td><td>Para la incubación de placas de medios para el cultivo de bacterias</td></tr><tr><td>Congelador (-40 &deg; C)&nbsp;</td><td>Haier</td><td>DW40L, Haier Biomedicals</td><td>Para el almacenamiento de existencias de glicerol Kit de preparación de bibliotecas de</td></tr><tr><td>ADN</td><td>NEB Next Ultra Kit de preparación de bibliotecas de ADN para Illumina</td><td>NA</td><td>Preparación de bibliotecas de secuenciación de extremos emparejados</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>HiMedia</td><td>GRM1195-100G</td><td>Para la preparación de tampones de funcionamiento de gel para electroforesis en gel de agarosa (AGE)Aparato de</td></tr> <tr><td>electroforesis</td><td>TechResource</td><td>Bandeja</td> <td>de fundición en gel de 15 cmPara hacer el gel de agarosa &nbsp; y la realización de electroforesis&nbsp;</td></tr><tr><td>Electroforesis Batería de energía con electrodos</td><td>Genei</td><td>NA</td><td>Para el funcionamiento del AGE&nbsp;</td></tr><tr><td>Disco antibiótico de eritromicina</td><td>HiMedia</td><td>SD222-5VL</td><td>Para realizar AST</td></tr><tr><td>Antibiótico de eritromicina en polvo</td><td>HiMedia</td><td>CMS528-1G</td><td>Para la preparación de la solución madre de antibióticos necesaria durante el aislamiento de bacterias resistentes a los antibióticos</td></tr><tr><td>Antibiotico de eritromicina en polvo</td><td>HiMedia</td><td>TC024-5G</td><td>Para la preparación de la solución madre de antibióticos necesaria durante el aislamiento de antibióticos resistentes bacterias</td></tr><tr><td>Escherichia coli ATCC 25922&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>HiMedia</td><td>0335X-1</td><td>Se utiliza como control mientras se realiza AST</td></tr><tr><td>Bromuro de etidio</td><td>HiMedia</td><td>MB071-1G</td><td>Agente de intercalación y visualización de ADN después de la electroforesis bajo Gel Sistema de documentación</td></tr><tr><td>Fluorómetro</td><td>Qubit 2.0</td><td>NA</td><td>Para determinar la concentración de ADN metagenómico extraído</td></tr><tr><td>Sistema de documentación en gel</td><td>BioRad</td><td></td><td>Se utiliza para visualizar amplicones de PCR después de la electroforesis</td></tr><tr><td>Disco antibiótico de gentamicina</td><td>HiMedia</td><td>SD170-5x50DS</td><td>Para realizar AST</td></tr><tr><td>Ácido Acético Glacial</td><td>HiMedia</td><td>AS119-500ML</td><td>Para la preparación de Tampón de funcionamiento de gel para Electroforesis de gel de agarosa (AGE)</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>HiMedia</td><td>GRM1027-500ML</td><td>Para hacer caldos de glicerol</td></tr><tr><td>Disco</td> <td>de antibiótico ImipenemHiMedia</td><td>SD073</td><td>Para realizar</td></tr><tr><td>AST Kaiju Database</td><td>NA</td><td>NA Para</td> la <td>clasificación taxonómica de lecturas; https://kaiju.binf.ku.dk/</td></tr> <tr><td>Disco de antibiótico de kanamicina</td><td>HiMedia</td><td>SD017-5x50DS</td><td>Para realizar AST</td></tr><tr><td>Antibiótico de kanamicina en polvo</td><td>HiMedia</td><td>MB105-5G</td><td>Para la preparación de la solución madre de antibióticos necesaria durante el aislamiento de bacterias resistentes a los antibióticos</td></tr><tr><td>Disco antibiótico de levofloxacino</td><td>HiMedia</td><td>SD216-5VL</td><td>Para realizar</td></tr><tr><td>el caldo AST Luria Bertani</td><td>Himedia</td><td>M1245-500G</td><td>Para el enriquecimiento de cultivos</td></tr><tr><td>Normas McFarland</td><td>Himedia</td><td>R092-1No</td><td>Para comparar la densidad de la suspensión de cultivo</td></tr><tr><td>Biología molecular agua</td><td>HiMedia</td><td>TCL018-500ML</td><td>Para hacer mezcla</td></tr> <tr><td>de reacción PCRAgar Mueller-Hinton (MHA)&nbsp;</td><td>HiMedia</td><td>M173-500G</td><td>Para realizar pruebas de susceptibilidad a los antibiotc (AST)</td></tr><tr><td>Disco antibiótico de neomicina</td><td>HiMedia</td><td>SD731-5x50DS</td><td>Para realizar AST</td></tr><tr><td>PCR Gradient Thermal Cycler</td><td>Eppendorf</td><td>Mastercycler Nexus Gradient 230V/50-60 Hz&nbsp;</td><td>Se utiliza para realizar PCR para la amplificación de la región de ARNr 16S y varios genes de resistencia a antibióticos</td></tr><tr><td>Imprimaciones&nbsp;</td><td>Xcelris</td><td>NA</td><td>para amplificación de PCR&nbsp;</td></tr><tr><td>Agar R2A, Modificado</td><td>HiMedia</td><td>M1743</td><td>Para la preparación de placas de medios para el aislamiento de la carga bacteriana total y resistente a los antibióticos (AR)</td></tr><tr><td>Generación de andamios</td><td>CLC Genomics Workbench 6.0</td><td>NA</td><td>Para la generación de andamios</td></tr><tr><td>Secuenciador</td><td>Plataforma Illumina (2 x 150 bp química)</td><td>NA</td><td>Secuenciación de biblioteca amplificada</td></tr><tr><td>Cloruro de sodio&nbsp;</td><td>HiMedia</td><td>TC046-500G</td><td>Para la preparación de solución salina al 0,85% para diluir en serie la muestra de agua</td></tr><tr><td>Kit de aislamiento de ADN en el suelo</td><td>Xcelgen</td><td>NA</td><td>Para la extracción de ADN metagenómico completo de la muestra de agua filtrada&nbsp;</td></tr><tr><td>Staphylococcus aureus subsp. aureus ATCC 29213</td><td>HiMedia</td><td>0365P</td><td>Se utiliza como control mientras se realiza</td></tr> la <tr><td>clasificación taxonómica</td> AST <td>Herramienta ioinformática Kaiju</td><td>NA</td><td>Para la clasificación de lecturas en diferentes grupos taxonómicos desde el nivel de filo hasta el nivel de género&nbsp;</td></tr><tr><td>La Base de Datos Integral de Resistencia a los Antibióticos (CARD)</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Para la anotación funcional de ARGs Disco de</td></tr><tr><td>antibiótico Tigeciclina</td><td>HiMedia</td><td>SD278</td><td>Para realizar AST</td></tr><tr><td>Disco antibiótico Trimethoprim</td><td>HiMedia</td><td>SD039-5x50DS</td><td>Para realizar AST</td></tr><tr><td>Tris base</td><td>HiMedia</td><td>TC072-500G</td><td>Para la preparación de Gel tampón de ejecución para Agarose Gel Electroforesis (AGE)</td></tr><tr><td>Vancomicina antibiótico en polvo</td><td>HiMedia</td><td>CMS217</td><td>Para la preparación de la solución madre de antibióticos necesaria durante el aislamiento de bacterias resistentes a los antibióticos</td></tr><tr><td>Balanza de pesaje</td><td>Mettler Toledo</td><td>ME204 Mettler Toledo Se</td><td>utiliza para el pesaje de medios en polvo, reactivos en polvo, etc.</td></tr><tr><td>NA - No aplicable</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

aislamiento e identificación de bacterias resistentes a antibióticos transmitidas por el agua y caracterización molecular de sus genes de resistencia a antibióticos

Isolation and Identification of Waterborne Antibiotic-Resistant Bacteria and Molecular Characterization of their Antibiotic Resistance Genes

El desarrollo y la propagación de la resistencia a los antibióticos (RA) a través de la microbiota asociada con cuerpos de agua dulce es un importante problema de salud mundial. En el presente estudio, se recolectaron muestras de agua dulce y se analizaron con respecto a la diversidad bacteriana total y los genes AR (ARG) utilizando técnicas convencionales basadas en cultivos y un enfoque metagenómico independiente del cultivo de alto rendimiento. Este artículo presenta un protocolo sistemático para la enumeración de las bacterias cultivables totales y resistentes a antibióticos a partir de muestras de agua dulce y la determinación de la resistencia fenotípica y genotípica en los aislados cultivables. Además, informamos el uso de un análisis metagenómico completo del ADN metagenómico total extraído de la muestra de agua dulce para la identificación de la diversidad bacteriana general, incluidas las bacterias no cultivables, y la identificación del grupo total de diferentes ARG (resistoma) en el cuerpo de agua. Siguiendo estos protocolos detallados, observamos una alta carga de bacterias resistentes a los antibióticos en el rango de 9.6 × 10 5-1.2 × 109 UFC/mL. La mayoría de los aislamientos fueron resistentes a los múltiples antibióticos probados, incluyendo cefotaxima, ampicilina, levofloxacina, cloranfenicol, ceftriaxona, gentamicina, neomicina, trimetoprima y ciprofloxacina, con índices de resistencia a antibióticos múltiples (MAR) de ≥0,2, lo que indica altos niveles de resistencia en los aislados. La secuenciación del ARNr 16S identificó patógenos humanos potenciales, como Klebsiella pneumoniae, y bacterias oportunistas, como Comamonas spp., Micrococcus spp., Arthrobacter spp. y Aeromonas spp. La caracterización molecular de los aislados mostró la presencia de varios ARGs, como blaTEM, blaCTX-M (β-lactámicos), aadA, aac (6')-Ib (aminoglucósidos) y dfr1 (trimetoprimas), lo que también fue confirmado por todo el análisis metagenómico de ADN. También se detectó una alta prevalencia de otros ARG que codifican para bombas de eflujo de antibióticos-mtrA, macB, mdtA, acrD, β-lactamasas-SMB-1, VIM-20, ccrA, ampC, blaZ, el gen de la cloranfenicol acetiltransferasa catB10 y el gen de resistencia a la rifampicina rphB-. Con la ayuda de los protocolos discutidos en este estudio, confirmamos la presencia de bacterias SAM transmitidas por el agua con diversos rasgos fenotípicos y genotípicos de AR. Por lo tanto, el análisis de ADN metagenómico completo se puede utilizar como una técnica complementaria a las técnicas convencionales basadas en cultivos para determinar el estado general de AR de un cuerpo de agua.

Carga bacteriana total y recuento de bacterias resistentes a los antibióticos (AR) La enumeración de la carga bacteriana total se llevó a cabo mediante la difusión de diluciones de 10−4 a 10−6 veces de las muestras de agua en agar R2A, medio modificado. Para la enumeración del recuento de bacterias AR, se distribuyeron diluciones de 10-3 a 10-6 veces en placas de medios que contenían antibióticos (Figura 3). Los recuentos totale...

Aquí, presentamos un protocolo detallado para el aislamiento e identificación de bacterias resistentes a antibióticos del agua y la caracterización molecular de sus genes de resistencia a antibióticos (ARG). El uso de técnicas basadas en cultivos y no basadas en cultivos (análisis metagenómico) proporciona información completa sobre la diversidad bacteriana total y el conjunto total de diferentes ARG presentes en aguas dulces de Mumbai, India.

Aislamiento e identificación de bacterias resistentes a antibióticos transmitidas por el agua y caracterización molecular de sus genes de resistencia a antibióticos

The development and spread of antibiotic resistance (AR) through microbiota associated with freshwater bodies is a major global health concern. In the ...

Nuestro método responde a preguntas clave, como ¿cuál es la carga total de bacterias resistentes a los antibióticos en la muestra de agua? ¿Cuál es la identidad de estas bacterias y cuáles son los diferentes tipos de rasgos y genes resistentes a los antibióticos que portan? La ventaja de nuestro protocolo es que puede detectar incluso bacterias que no se pueden cultivar en el laboratorio, que constituyen una proporción significativa del total de bacterias en la muestra de agua.Por lo tanto, teóricamente, ninguna bacteria o sus rasgos resistentes quedan fuera. Esta técnica combinatoria que involucra técnicas basadas en cultivo e independientes de cultivo se puede replicar y personalizar para cualquier muestra obtenida de aguas residuales, efluencia farmacéutica u hospitalaria, entornos clínicos y no clínicos, y más. Junto con Devika, demostrarán los procedimientos experimentales Harshali Shinde y Maitri Mishra, ambos becarios de investigación senior de mi laboratorio.Para comenzar, procese la muestra de agua asépticamente filtrándola a través de un paño de muselina estéril para eliminar cualquier partícula. Luego, diluya en serie la muestra de agua filtrada para su posterior análisis. Para determinar la carga bacteriana total, coloque 100 microlitros de las diluciones apropiadas de la muestra de agua filtrada en las placas y duplicados de agar R2A solidificados, y extienda uniformemente.Incubar todas las placas de propagación de muestras a 35 a 37 grados centígrados durante 48 horas. Después del período de incubación, contar las colonias y expresar la carga bacteriana total en unidades formadoras de colonias por mililitro. Para determinar el recuento bacteriano resistente a los antibióticos, agregue los antibióticos por separado en tubos que contengan 20 mililitros de agar R2A fundido estéril modificado aproximadamente a 40 grados centígrados.Agitar para mezclar uniformemente y verter sobre placas de Petri estériles antes de que el agar se solidifique. Para el control de calidad y para comprobar la eficacia de los antibióticos, extienda 100 microlitros de suspensión bacteriana sobre sus respectivas placas modificadas con agar R2A que contienen antibióticos. Incubar las placas a 35 a 37 grados centígrados durante 48 horas, y luego determinar el recuento bacteriano.Para preparar la plantilla de ADN de los aislados para PCR, utilizando un palillo de dientes estéril, tome una sola colonia pura aislada del aislado que crece en una placa de Petri. Suspenda la colonia bacteriana en 100 microlitros de agua doble destilada estéril en un tubo de microcentrífuga y hierva en un baño de agua hirviendo o un baño seco durante 10 minutos a 100 grados centígrados. Centrifugar la suspensión a 10, 000 g durante dos minutos para granular los desechos y transferir el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga estéril fresco para usarlo como plantilla de ADN crudo.Para amplificar la región V3 del gen 16S rRNA por PCR, prepare 40 microlitros de la mezcla de reacción en un tubo de PCR. Coloque el tubo en el bloque térmico y ejecute el programa apropiado en el termociclador de PCR. Para resolver y visualizar los amplicones de PCR, mezcle 10 microlitros del producto de PCR amplificado en dos microlitros de tampón de carga de gel 6x, y cargue esta mezcla en los pocillos de un gel de agarosa al 1,5% junto con una escalera de ADN pareada de 100 bases para estimar el tamaño de los amplicones.Realice la electroforesis del gel en el tampón del tanque TAE a 80 a 100 voltios hasta que el tinte de seguimiento ejecute 3/4 del gel. Luego visualice las bandas de amplicón bajo un transiluminador UV. Para preparar el inóculo, inocular asépticamente una sola colonia aislada de resistencia a antibióticos purificada utilizando un bucle estéril en dos mililitros de caldo Luria-Bertani, o LB, sin ningún antibiótico e incubar a 37 grados centígrados a 80 rpm durante la noche.Al día siguiente, agregue de 100 a 150 microlitros del cultivo cultivado durante la noche a dos mililitros de caldo LB fresco no selectivo e incube durante dos a cuatro horas hasta que la densidad óptica a 600 nanómetros alcance 0.4 a 0.5. Diluir la suspensión de cultivo recién cultivada utilizando solución salina estéril al 0,85% y mezclar suavemente para distribuir las células uniformemente para alcanzar una densidad de cultivo equivalente a 0,5 McFarland estándar. Dentro de los 15 minutos posteriores a la dilución, sumerja un hisopo de algodón estéril en el inóculo y retire el exceso de suspensión para evitar la inoculación excesiva de las placas.Luego extienda el cultivo uniformemente en la placa de agar Mueller Hinton preparada, comenzando desde la parte superior y yendo y viniendo de borde a borde. Luego gire la placa 60 grados y comience a frotar nuevamente. Para colocar los discos antibióticos, use un fórceps esterilizado por llama y transfiera asépticamente los discos antibióticos a las placas de agar inoculadas.Presione los discos suavemente para asegurar un nivel completo de contacto con el agar. Coloque el número apropiado de discos antibióticos en la placa de agar considerando el organismo, el antibiótico utilizado y el tamaño de la placa para evitar la superposición de las zonas de inhibición. Dentro de los 15 minutos posteriores a la aplicación del disco antibiótico, invierta las placas e incube a 37 grados centígrados durante la noche.Al día siguiente, mida el diámetro de la zona de inhibición en milímetros e interprete de acuerdo con los valores de punto de ruptura dados por EUCAST. Se encontró que la carga bacteriana total en la muestra de agua era de 3.0 x 10 a la novena UFC / ml, y se encontró que la carga bacteriana resistente a los antibióticos era alta. Los aislados culturales de resistencia a antibióticos secuenciados pertenecían a la familia Enterobacteriaceae, siendo la mayoría Escherichia coli y Klebsiella pneumoniae.Además, también se identificaron bacterias oportunistas raras. Las pruebas de susceptibilidad a antibióticos por el método de difusión del disco mostraron un índice de resistencia a antibióticos múltiples de aproximadamente 0,2 para ocho aislados, lo que indica un alto grado de resistencia. Sin embargo, las especies de Comamonas y Arthrobacter no mostraron resistencia a ninguno de los antibióticos probados.Los aislados cultivables revelaron la presencia de genes de resistencia a antibióticos que codifican los factores contra betalactámicos, trimetoprima y aminoglucósidos. El análisis metagenómico del ADN para la diversidad bacteriana total condujo a la identificación de 50 filos, lo que indica la alta diversidad bacteriana donde Proteobacteria era el filo más dominante, que consiste en las clases Alphaproteobacteria, Betaproteobacteria y Gammaproteobacteria. A nivel de orden, Burkholderiales fue el más prevalente, perteneciente a la clase Betaproteobacteria.A nivel general, Pseudomonas, Acinetobacter, Pedobacter, Prosthecobacter, Limnohabitans, Flavobacterium y Comamonas fueron algunas de las bacterias abundantes. El análisis de ADN metagenómico también reveló más genes de resistencia a los antibióticos. En este método, el paso de dilución en serie es crítico ya que cualquier error puede conducir a una interpretación incorrecta de la UFC total y la carga bacteriana resistente a los antibióticos.Además, el diámetro de la zona de inhibición debe medirse cuidadosamente para interpretar correctamente si el aislado es resistente o sensible. Utilizando estos protocolos, además de la muestra de agua, se puede estudiar cualquier otra muestra, ya sea ambiental, alimentaria o clínica. Además, además de las bacterias, otras poblaciones microbianas en cualquier ecosistema también pueden estudiarse utilizando enfoques similares.

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El diseño de un esquema de flujo de trabajo sencillo de un día para el diagnóstico de patógenos bacterianos permite el reconocimiento rápido de infecciones del torrente sanguíneo. La inclusión de los ocho objetivos bacterianos clínicamente relevantes y sus perfiles de resistencia a los antibióticos ofrece al clínico una visión inicial en el mismo día, que puede conducir a una terapia más adecuada.

Un día de flujo de trabajo Método de detección de patógenos bacterianos y pruebas de resistencia a los antimicrobianos de cultivos de sangre

Fuente: Ghadigaonkar, D. y Rath, A. Aislamiento e identificación de bacterias resistentes a los antibióticos transmitidas por el agua y caracterización molecular de sus genes de resistencia a los antibióticos. J. Vis. Exp. (2023)Este video demuestra el aislamiento y la preparación de bacterias resistentes a los antibióticos a partir de una muestra de agua utilizando medios selectivos. El ADN se extrae de bacterias resistentes a los antibióticos y se amplifica para identificar los genes...

Aislamiento de bacterias resistentes a los antibióticos de una muestra de agua para análisis molecular

Biosensores fagos líticos y los granos de anticuerpos son capaces de discriminar entre resistente a la meticilina (MRSA) y la bacteria estafilococo sensibles. Los fagos se inmovilizaron mediante un método de Langmuir-Blodgett sobre una superficie de un sensor de microbalanza de cristal de cuarzo y trabajaron como amplias sondas estafilococo gama. Perlas de anticuerpos reconocen SARM.

Biosensor para la detección de antibióticos Las bacterias estafilococo resistentes

Este protocolo describe la detección de integrones de clase 1 y sus casetes de genes asociados en productos alimenticios.

Screening productos alimenticios para la Clase 1 integrones y Gene Cassettes

Describimos una plataforma que utiliza una biblioteca de Escherichia coli isogénica resistente a antibióticos para la dereplicación de antibióticos. La identidad de un antibiótico producido por bacterias u hongos puede deducirse por el crecimiento de E. coli expresando su respectivo gen de resistencia. Esta plataforma es económicamente eficaz y eficiente en el tiempo.

Desreplicación de antibióticos utilizando la plataforma de resistencia a antibióticos

Los antibióticos etiquetados fluorescentemente son herramientas poderosas que se pueden utilizar para estudiar múltiples aspectos de la resistencia a los antimicrobianos. Este artículo describe la preparación de antibióticos etiquetados fluorescentemente y su aplicación para estudiar la resistencia a los antibióticos en bacterias. Las sondas se pueden utilizar para estudiar mecanismos de resistencia bacteriana (por ejemplo, eflujo) por espectrofotometría, citometría de flujo y microscopía.

Visualización de la resistencia bacteriana mediante sondas fluorescentes antibióticas

La microscopía de fuerza atómica-espectroscopía infrarroja (AFM-IR) proporciona una poderosa plataforma para estudios bacterianos, lo que permite lograr una resolución a nanoescala. Tanto el mapeo de los cambios subcelulares (por ejemplo, en la división celular) como los estudios comparativos de la composición química (por ejemplo, derivados de la resistencia a los medicamentos) se pueden realizar a nivel de una sola célula en bacterias.

Microscopía de Fuerza Atómica Combinada con Espectroscopía Infrarroja como Herramienta para Sondear Química de Bacteria Única

Presentamos el proceso de aislamiento, propagación y caracterización de bacterias degradadoras de hidrocarburos de hábitats acuáticos. El protocolo describe el aislamiento bacteriano, la identificación mediante el método de ARNr 16S y las pruebas de su potencial de degradación de hidrocarburos. Este artículo ayudaría a los investigadores a caracterizar la biodiversidad microbiana en muestras ambientales y, específicamente, a detectar microbios con potencial de biorremediación.

Aislamiento, propagación e identificación de especies bacterianas con propiedades metabolizadoras de hidrocarburos de hábitats acuáticos

Aquí, presentamos una técnica simple para evaluar la resistencia a los antimicrobianos (RAM) ambiental mediante el aumento de la proporción de ADN extracelular de bajo peso molecular. El tratamiento previo con PEG al 20%-30% y NaCl 1,2 M permite la detección de genes de AMR tanto genómicos como transferidos horizontalmente. El protocolo se presta a un proceso sin kits con optimización adicional.

Extracción mejorada de ADN de bajo peso molecular de aguas residuales para una evaluación integral de la resistencia a los antimicrobianos 

Los animales salvajes suelen ser parasitados por una amplia gama de helmintos. Los cuatro tipos principales de helmintos son los "gusanos redondos" (nematodos), los "gusanos de cabeza espinosa" (acantocéfalos), los "trematodos" y las "tenias" (cestodos). Aquí describimos cómo se recolectan los helmintos de un animal vertebrado y cómo se conservan e identifican taxonómicamente.

Recolección e identificación de helmintos de la vida silvestre

Aprende a aislar e identificar bacterias resistentes a antibióticos en muestras de agua mediante técnicas de cultivo y metagenómica. Este protocolo detecta microorganismos cultivables y no cultivables para un análisis completo de genes de resistencia.

Aislamiento e identificación de bacterias resistentes a antibióticos transmitidas por el agua y caracterización molecular de sus genes de resistencia a antibióticos (Video) | JoVE Journal

Aislamiento e identificación de bacterias resistentes a antibióticos transmitidas por el agua y caracterización molecular de sus genes de resistencia a antibióticos

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