Name: Ensayo de adhesión y la invasión de agar en S. cerevisiae (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2006-11-08T00:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 36 s
Description: Aprende el ensayo cualitativo de adhesión e invasión en agar para evaluar fenotipos invasivos de S. cerevisiae. Este método permite estudiar la diferenciación de levaduras y el impacto de señales ambientales.

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Nos gustaría agradecer a Lisa Schneper y Duevel Katrin por sus ideas en el desarrollo de este ensayo.

<ol><li> Ponga 200ul de las culturas de creciente interés en las placas de los medios de comunicación sintética con las condiciones requeridas hambre (SC con glucosa al 2% frente al SC con 0,2% de glucosa, por ejemplo) Si la densidad de las culturas son muy diferentes el uno del otro, ajustar el recuento de células por cultivo 200ul por lo que cada gota tiene aproximadamente la misma cantidad de células. </li><li> Asegúrese de mantener registros de las que caen en las placas es que la cultura. </li><li> Mantenga la tapa entreabierta placa y dejar bien a temperatura ambiente oa 30 ° C hasta que las gotas se seca. </li><li> Placas de sellado con parafilm y envoltorio plástico (opcional) y dejar en 30 ° C durante 3-7 días. </li><li> Documentar el crecimiento de las células en las placas (por escáner, tomar una fotografía digital, etc) </li><li> Lavar las células de la superficie del agar con agua a alta presión (de preferencia agua DI) durante un minuto cuidando para el agar, no para levantar y cambiar la orientación. </li><li> Deshacerse del exceso de agua tocando las placas en papel toalla y dejarlos abiertos a secas. </li><li> Una vez que las placas se seca documento de adhesión en cada plato (mediante la exploración o la toma de fotografías digitales) </li><li> Células con un dedo enguantado y frote suavemente de forma la superficie del agar con agua corriente durante un minuto. </li><li> Secar las placas como antes. </li><li> Si se utiliza un microscopio de disección, retire la aguja antes de colocar las placas en la plataforma del microscopio. </li><li> Documento de la invasión con un aumento de 10x o 40x. Asegúrese de concentrarse en la parte media de cada círculo, para los bordes será demasiado llena para ver a morfologías celulares individuales. Los bordes pueden indicar el nivel de crecimiento filamentoso y pueden registrarse para referencia futura. Exploración o de tomar una fotografía digital de todo el plato también puede ser útil. </li></ol>

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<li>Elortondo, F. J. P., Salmeron, J., Albisu, M., Casas, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilms+in+the+food+industry%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Science+and+Technology+International%22%5BJournal%5D)">Biofilms in the food industry.</a> Food Science and Technology International. 5, 25-30 (1999).</li>
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<li>Liu, H., Styles, C. A., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elements+of+the+yeast+pheromone+response+pathway+required+for+filamentous+growth+of+diploids%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Elements of the yeast pheromone response pathway required for filamentous growth of diploids.</a> Science. 262, 1741-1744 (1993).</li>
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<li>Roberts, R. L., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elements+of+a+single+MAP+kinase+cascade+in+Saccharomyces+cerevisiae+mediate+two+developmental+programs+in+the+same+cell+type%3A+mating+and+invasive+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Elements of a single MAP kinase cascade in Saccharomyces cerevisiae mediate two developmental programs in the same cell type: mating and invasive growth.</a> Genes Dev. 8, 2974-2985 (1994).</li>
<li>Robertson, L. S., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+three+yeast+A+kinases+have+specific+signaling+functions+in+pseudohyphal+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The three yeast A kinases have specific signaling functions in pseudohyphal growth.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 13783-13787 (1998).</li>
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</ol>

Las células de levadura mostrar los diversos modos de diferenciación de acuerdo a la disponibilidad de nutrientes y las condiciones ambientales, incluyendo la formación de esporas bajo condiciones de hambre y el estrés, filamentación en diversas tensiones de nutrientes, y la floculación. Levaduras diferentes, incluyendo S. cerevisiae y C. albicans, también se puede encontrar en los biofilms formados por un conjunto diverso de microorganismos. Aunque hay una cierta correlación con filamentación y comportamiento invasivo, no está claro exacta...

<table><tbody><tr><td>Moticam 350</td><td>Cámara</td><td>Motic</td><td>descatalogado (nuevo modelo: Moticam 352)</td><td>Una cámara relativamente económica que se conecta a los oculares de microscopios y captura imágenes digitales para PC o Mac.</td></tr></tbody></table>

ensayo de adhesión y la invasión de agar en s. cerevisiae

Assay for Adhesion and Agar Invasion in S. cerevisiae

Las levaduras se encuentran en las biopelículas naturales, donde muchos microorganismos colonizan las superficies. En ambientes artificiales, como las superficies de los objetos artificiales, los biofilms pueden reducir la productividad industrial, destruir las estructuras, y poner en peligro la vida humana. 1.3 Por otra parte, aprovechando el poder de biofilms pueden ayudar a limpiar el medio ambiente y la generación de energía sostenible. 8.4 La capacidad de S. cerevisiae para colonizar las superficies y participar en las biopelículas complejo fue ignorada hasta que el redescubrimiento de los programas de diferenciación provocada por diferentes vías de señalización y las señales ambientales en este organismo. 9, 10 El continuo interés en el uso de S. cerevisiae como organismo modelo para comprender la interacción y convergencia de las vías de señalización, como el Ras-PKA, MAPK Kss1 y Hog1 vías osmolaridad, pone rápidamente de S. cerevisiae en el cruce de la biopelícula la biología y la investigación de la transducción de señales. 20.11 En este sentido, la diferenciación de células de levadura en un largo, filamentos de adhesivo, se convirtió en pseudohyphal una lectura conveniente para la activación de vías de transducción de señales a los diversos cambios ambientales. Sin embargo, filamentación es un conjunto complejo de fenotipos, lo que hace analizando para ello, como si se tratara de un fenotipo engañoso simple. En la última década, varios ensayos se adoptaron con éxito de los estudios de biofilm de bacterias a la investigación de levadura, tales como los ensayos de la formación de MAT para medir la expansión de colonias en agar blando y cristal violeta para medir cuantitativamente la adherencia de la superficie celular. 12, 21 Sin embargo, ha habido cierta confusión en los ensayos desarrollados para evaluar cualitativamente los fenotipos adhesivo e invasiva de la levadura en agar. A continuación, presentamos un método sencillo y fiable para evaluar la calidad del adhesivo e invasiva de las cepas de levadura con fácil de entender, las medidas necesarias para aislar la evaluación de la adherencia de la evaluación de la invasión. Nuestro método, adoptado a partir de estudios anteriores, 10, 16 y afecta las células que crecen en medios líquidos y placas en las condiciones diferenciales de nutrientes para el crecimiento de grandes manchas, que luego lave con agua para evaluar la adhesión y frote las células completamente fuera de la superficie del agar para evaluar la invasión en el agar. Se elimina la necesidad de rayar las células en agar, que afecta a la invasión de las células en el agar. En general, hemos observado que las cepas haploides que invaden agar siempre adhesiva, sin embargo, no todas las cepas adhesivo puede invadir un medio de agar. Nuestro enfoque se puede utilizar en combinación con otros ensayos para analizar cuidadosamente los pasos y los requisitos de diferenciación de la transducción de señal de la levadura, la diferenciación, la detección de quórum, y la formación de biofilm.

Se describe un ensayo cualitativo para la adhesión de la levadura y la invasión de agar como una medida de la diferenciación y la invasión pseudohyphal. Este ensayo simple se puede utilizar para evaluar el fenotipo invasivo de distintos mutantes, así como las señales de los efectos ambientales y las vías de señalización en la diferenciación de la levadura.

Ensayo de adhesión y la invasión de agar en S. cerevisiae

Las levaduras se encuentran en biopelículas naturales, donde colonizan superficies diversos microorganismos. En entornos artificiales, como las superficies de objetos fabricados por el hombre, ...

Tome 200 microlitros de su cultivo de interés y simplemente haga un objetivo. Normalmente puedo colocar hasta seis en una placa mensual si quiero, y luego la dejo abierta para que se seque. Y estas son dos placas.Uno de ellos tiene moho, pero está bien porque no afecta nuestro experimento. Y uno de ellos está completo, uno de ellos está en medio con baja concentración de glucosa. Así que vamos a observar la adhesión y la invasión para ver si hay alguna diferencia.Así que simplemente retire la placa así. Y puede ver el crecimiento de material. Voy a lavar.Puede observarse las burbujas debajo del sacacorchos, y eso se debe a que el agua pasó por debajo del sacacorchos, lo cual es normal, pero solo para que el sacacorchos no se salga de la placa. Por lo tanto, diría que, aunque algunas células se desprendieron, ambas cepas son adherentes. Las células se están adhiriendo a otras células que posiblemente se adhieren al agar.De lo contrario, muchas de las células se desprenderían y no lo hicieron. Entonces, ahora que hemos documentado la adhesión, vamos a documentar la invasión. Voy a frotar suavemente las células de la superficie, en la medida en que se desprendan.No estoy ejerciendo presión, pero estoy tratando de retirar cualquier cosa que se desprenda de la otra superficie. Y verá, sentirá cómo su dedo topa donde está la capa. Estoy intentando secarla. ¿Podemos ver la diferencia aquí?No puedes, lo cual es bueno porque esto es una placa completa y por lo tanto no les falta ningún nutriente. Y esta es una placa de glucosa baja y les falta glucosa. Entonces observas una diferencia.Entonces, ese es un buen control.

assay-for-adhesion-and-agar-invasion-in-s-cerevisiae

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

En este video, se describe un procedimiento para la expresión de las bacterias de tipo III efectores en la levadura y la identificación de los fenotipos de efectos inducidos por la inhibición del crecimiento. Fenotipos como puede ser explotada posteriormente para aclarar las funciones efectoras y objetivos.

Identificación de los fenotipos de inhibición del crecimiento inducida por la expresión de tipo bacteriana efectores III en la levadura

Un protocolo general para el estudio de la invasión de las células huésped por un patógeno bacteriano, centrándose...

La invasión de las células humanas por un patógeno bacteriano

Este protocolo es un ensayo simple adhesión bacteriana consiste en contar el número de unidades formadoras de colonias bacterianas que se adhieren a las células cultivadas. El ensayo es sólida, independiente de la adhesina estudiados, y numerosas variantes se utilizan en la mayoría de los laboratorios que trabajan en la patogénesis bacteriana.

Ensayo in vitro de la adhesión bacteriana a las células epiteliales de mamíferos

Este video ilustra el inicio de la formación de biopelículas polimicrobianas en células infectadas por virus por bacterias y hongos. La infección por el virus del herpes simple impide la adhesión bacteriana a las células, impidiendo la colocalización bacteriano-fúngica. Por el contrario, las células no infectadas muestran una colocalización bacteriano-fúngica y el inicio de la formación de biopelículas.

Un ensayo para determinar el inicio de biopelículas polimicrobianas en células infectadas por virus

Aquí presentamos un método rentable para definir las interacciones químico-genéticas en levaduras en ciernes. El enfoque se basa en técnicas fundamentales en biología molecular de levaduras y es muy adecuado para la interrogación mecanicista de colecciones pequeñas y medianas de productos químicos y otros entornos de medios.

La rápida identificación de químicos interacciones genéticas en<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Este artículo describe un ensayo basado en el crecimiento de levaduras para la determinación de los requisitos genéticos para la degradación de proteínas. También demuestra un método para la extracción rápida de proteínas de levadura, adecuado para la transferencia de Western para confirmar bioquímicamente los requisitos de degradación. Estas técnicas se pueden adaptar para monitorear la degradación de una variedad de proteínas.

Determinación basada en el crecimiento y en la confirmación bioquímica de Requisitos Genéticos para la degradación de proteínas en<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Este protocolo describe una metodología de alto rendimiento para funcionalmente basados en proteína herencia en S. cerevisiae.

Proyección de alto rendimiento para la herencia basados en proteína en S. cerevisiae

Este estudio demuestra la utilidad y la facilidad de la medida de extensión cuantitativa membrana de la célula y su correlación con la capacidad adhesiva de las células. Como un ejemplo, aquí mostramos esa proteína Dickkopf-relacionada 3 (DKK3) promueve la formación mayor lobopodia y adhesividad celular adrenocortical carcinoma de células en vitro.

Caracterización de extensiones de la membrana de la célula y estudiar sus funciones en la dinámica de adherencia celular cáncer

Los fenotipos de crecimiento de levadura se miden con precisión a través de imágenes de lapso de tiempo altamente paralelas de células inmovilizadas que crecen en microcolonías. Simultáneamente, se puede monitorear la tolerancia al estrés, la expresión proteica y la localización de proteínas, generando conjuntos de datos integrados para estudiar cómo las diferencias ambientales y genéticas, así como la heterogeneidad de la expresión génica entre las células isogénicas, modulan el crecimiento.

Imágenes en vivo de alto rendimiento de microcolonias para medir la heterogeneidad en crecimiento y expresión génica

En este trabajo se presenta un protocolo para el examen de la infección oral por Candida en pacientes con síndrome de Sjögren primario, que puede ser utilizado para el tratamiento oportuno y, posteriormente, evitar complicaciones relacionadas.

Examen de la infección oral por Candida en pacientes con síndrome de Sjögren primario

Aprende el ensayo cualitativo de adhesión e invasión en agar para evaluar fenotipos invasivos de S. cerevisiae. Este método permite estudiar la diferenciación de levaduras y el impacto de señales ambientales.

Ensayo de adhesión y la invasión de agar en S. cerevisiae

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