Name: In vitro Modelo enteroide apical de enterocolitis necrosante (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-08T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Aprenda a desarrollar un modelo enteroide apical-out para estudiar enterocolitis necrosante in vitro. Este método permite evaluar terapéuticas orales accediendo a la superficie apical de los enteroides.

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Este contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente los puntos de vista oficiales de los Institutos Nacionales de Salud. HC es apoyado por la subvención P20GM134973 de los Institutos Nacionales de Salud. KB cuenta con el apoyo de una subvención de Children's Hospital Foundation (CHF) y Presbyterian Health Foundation (PHF). Agradecemos al Laboratorio de Investigación de Biología Molecular y Citometría de OUHSC por el uso de la Instalación Básica, que proporcionó imágenes confocales.

Todos los procedimientos con animales en este estudio fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad de Oklahoma. Se obtuvieron muestras de conveniencia del intestino delgado de un primate no humano prematuro (NHP, 90% de gestación, babuino olivo, Papio anubis) después de la eutanasia para un estudio separado (Protocolo # 101523-16-039-I).
1. Establecimiento del modelo enteroide apical-out NEC-in-a-dish
<ol><li>Preparación de tratamientos de medios y enteroides NOTA: Una vez preparado siguiendo la técnica aséptica estándar, el medio se puede almacenar a 4 °C durante un máximo de 1 semana.<ol><li>Prepare medios libres de antibióticos (AFM) mezclando 50 ml de medios de crecimiento de organoides humanos con 50 ml de suplemento organoide (consulte la Tabla de materiales). Preparar 5 mM de ácido etilendiaminotetraacético/solución salina tamponada con fosfato (EDTA/PBS) añadiendo 100 μL de 0,5 M EDTA a 9.900 μL de PBS.</li>
		<li>Enfriar el medio del águila modificada de Dulbecco/nutriente Mezcla de jamón F12 + 15 mM HEPES Tampón (DMEM/F12) a 2-8 °C.</li>
		<li>Preparar la solución madre de TNF-α suspendiendo 100 μg de polvo de TNF-α en 1 ml de 1x PBS. Diluya aún más el stock de TNF-α a concentraciones de 20 ng / ml y 50 ng / ml utilizando AFM como solvente. Prepare la solución madre de LPS suspendiendo 2 mg de LPS en 1 ml de 1x PBS. Diluir más LPS madre diluido a 100 μg/ml y 200 μg/ml utilizando AFM como disolvente.</li>
	</ol></li>
	<li>Invertir la polaridad de enteroides 3D NOTA: El siguiente procedimiento está diseñado para la inversión de una sola placa de cultivo de tejido de fondo plano de 24 pocillos en dos placas de cultivo de tejido de fijación ultra baja de 24 pocillos. Las placas de cultivo de tejidos deben calentarse a 37 °C durante al menos 30 minutos antes de su uso. La derivación de enteroides 3D basolaterales hacia fuera se logró como se describió previamente por muchos grupos35,36, con ligeras modificaciones para los medios (detallados anteriormente). El procedimiento general de derivación enteroide no difiere del de los humanos. En resumen, el tejido extirpado se lava, se corta en pequeños fragmentos y se incuba en un tampón de interrupción celular. La solución celular se ejecuta a través de un filtro celular de 70 μM, lo que resulta en criptas que se chapan en una alta densidad.<ol><li>Aspirar medios de cada pocillo de una placa de 24 pocillos de enteroides basolaterales 3D establecidos.</li>
		<li>Agregue 500 μL de EDTA/PBS helado de 5 mM a cada pocillo de la placa de 24 pocillos e interrumpa mecánicamente suavemente el extracto de la membrana basal/domo ECM pipeteando hacia arriba y hacia abajo con una pipeta p200 un mínimo de 5x-6x.</li>
		<li>Transfiera el contenido de cuatro pocillos a un tubo cónico de 15 ml y agregue 8 ml de EDTA/PBS helado al tubo cónico. Transfiera los 20 pozos restantes de la misma manera.</li>
		<li>Incubar tubos cónicos de 15 ml a 4 °C durante 1 h en una plataforma giratoria o agitador a 330 rpm. Después de la incubación de 1 h, centrifugar los tubos cónicos a 300 x g durante 3 min a 4 °C. Retire y deseche el sobrenadante de cada tubo.</li>
		<li>Combine y lave los gránulos celulares con 5 ml de DMEM/F12 y distribuya la suspensión celular en dos tubos cónicos de 15 ml.</li>
		<li>Granular las células centrifugando a 300 x g durante 3 min a 4 °C. Retire el sobrenadante y agregue 12 ml de AFM a cada tubo, asegurándose de que los gránulos celulares se resuspendan.</li>
		<li>Pipetear 500 μL de la suspensión enteroide en cada pocillo de dos placas de fijación ultrabaja de 24 pocillos.</li>
		<li>Incubar las placas a 37 °C y 5% deCO2 durante 2-5 días o hasta que los enteroides hayan invertido la polaridad.</li>
		<li>Para verificar la reversión enteroide, primero establezca la tinción inmunofluorescente confirmatoria y el tiempo promedio de reversión (~ 3 días), luego confirme la inversión de polaridad utilizando una visualización básica de microscopio óptico. Los enteroides apicales son muy celulares en apariencia, mientras que los enteroides basolaterales a menudo están dominados por la presencia de una gran luz central o gemación (ver Figura suplementaria 1). NOTA: Una vez que el procedimiento ha sido estandarizado, la tasa de conversión a apical-out típicamente supera el 95%. El uso de enteroides apicales de salida pretende ser un experimento terminal, aunque teóricamente es posible pasar enteroides apicales a un pequeño número de enteroides basolaterales.</li>
	</ol></li>
	<li>Salida apical NEC-in-a-dish NOTA: Una vez que los enteroides hayan invertido la polaridad, use los cultivos en experimentos posteriores rápidamente, ya que su longevidad en la conformación apical-out no se ha confirmado más allá de 3-4 días. Para el siguiente modelo de NEC en un plato, los enteroides se trataron durante 24 h, luego se recolectaron inmediatamente después y se conservaron para experimentos posteriores.<ol><li>Una vez que los enteroides hayan invertido visualmente la polaridad con al menos un 95% de eficiencia, retire las placas de la incubadora y recoja ocho pocillos de una placa de 24 pocillos en un tubo cónico de 15 ml. Como los enteroides apical-out están en suspensión, simplemente pipetea la solución enteroide/media. Centrifugar el tubo de 15 ml a 300 x g durante 5 min a 4 °C.</li>
		<li>Una vez que las células estén peletizadas, retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en 4 ml de AFM mezclado con el volumen deseado (10 μL aquí para que coincida con el volumen de tratamiento más alto agregado) de 1x PBS (control).</li>
		<li>Pipetear 500 μL de suspensión enteroide/PBS/AFM en ocho pocillos de una placa de fijación ultrabaja de 24 pocillos e incubar la placa a 37 °C y 5% deCO2 durante 24 h.</li>
		<li>Repita los pasos 1.3.1.-1.3.3. para los tratamientos TNF-α (20 ng/ml y 50 ng/ml) y LPS (100 μg/ml y 200 μg/ml) en normoxia. Para todos los tratamientos de hipoxia, repita los pasos 1.3.1.-1.3.3., pero coloque la placa en una incubadora separada a 37 °C, 5% de CO2 y 1% deO2 durante 24 h. NOTA: Paso 1.3.4. se puede hacer simultáneamente con los pasos 1.3.1.-1.3.3, pero, para mayor claridad, el procedimiento anterior se separó por tratamiento para reducir la complejidad.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Tinción inmunofluorescente y microscopía confocal
<ol><li>Preparación de soluciones de tinción<ol><li>Preparar Triton X-100 al 0,1% mezclando 7 μL de Triton X-100 en 1x PBS hasta un volumen final de 7 mL. Prepare PBST (PBS-Tween) agregando 30 μL de Tween-20 a 1x PBS a un volumen final de 30 ml.</li>
		<li>Prepare suero de burro normal (NDS)/PBST al 10% agregando 700 μL de NDS a 6.3 ml de PBST. Preparar NDS/PBST al 1% añadiendo 70 μL de NDS a PBST a un volumen final de 7 ml. NOTA: El suero de burro se utilizó aquí para correlacionarse con el huésped de anticuerpos secundario. Sin embargo, las especies de suero bloqueantes deben coincidir con las especies de anticuerpos secundarias para bloquear adecuadamente la unión no específica.</li>
	</ol></li>
	<li>Tinción (Día 1)<ol><li>Transfiera el contenido de cuatro pocillos de una placa de 24 pocillos a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Repita para todos los pozos / tratamientos deseados, con cada tratamiento en un tubo separado. Centrifugar los tubos a 300 x g durante 4 min a 4 °C. Una vez que los enteroides estén peletizados, retire el sobrenadante.</li>
		<li>Resuspender los gránulos celulares en 300 μL de fijador de formaldehído al 4% durante 30 min a temperatura ambiente (RT). Después de 30 min, centrifugar los tubos a 300 x g durante 4 min a 4 °C, retirar el sobrenadante y lavar el pellet con 500 μL de ESTÉRIL, RT 1x PBS.</li>
		<li>Centrifugar los tubos a 300 x g durante 4 min a 4 °C. Retire el sobrenadante y agregue 500 μL de Triton X-100 al 0,1%, y deje reposar durante 1 h en RT.</li>
		<li>Después de 1 h, centrifugar los tubos a 300 x g durante 4 min a 4 °C y retirar el sobrenadante. Lavar con 500 μL de 1x PBS y colocar los tubos en un rotador o agitador a 200 rpm durante 15 min a 2-8 °C. Repita esto un total de 4x.</li>
		<li>Centrifugar los tubos a 300 x g durante 4 min a 4 °C y retirar el sobrenadante. Añadir 500 μL de NDS/PBST al 10% e incubar a RT durante 45 min. Durante la incubación, preparar soluciones de anticuerpos primarios combinando 20 μL de anticuerpo antivillina recombinante, 10 μL de anticuerpo E-cadherina y 1970 μL de NDS/PBST al 1% para ocho pocillos de una placa de 24 pocillos.</li>
		<li>Después de la incubación de 45 minutos, centrifugar los tubos a 300 x g durante 4 min a 4 °C. Coloque los tubos sobre hielo. Retire el sobrenadante y sustitúyalo por 250 μL de solución de anticuerpos primarios. Incubar los tubos durante la noche a 2-8 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Tinción (Día 2)<ol><li>Centrifugar los tubos a 300 x g durante 4 min a 4 °C y retirar el sobrenadante. Añadir 250-500 μL de PBST a cada tubo, dependiendo del tamaño del pellet, y colocar en el rotador o agitador a 200 rpm durante 1 h a 2-8 °C. Repita el lavado PBST 4x.</li>
		<li>Preparar la solución secundaria de anticuerpos añadiendo 52 μL de Cy3 burro anti-conejo IgG (H + L) al 50% de glicerol y 5,2 μL de anticuerpos secundarios verde fluorescente 488 de burro a 5142,8 μL de NDS/PBST al 1%.</li>
		<li>Después del último lavado y centrifugación de PBST, retire el sobrenadante de los tubos. Dispensar 200 μL de solución de anticuerpos secundarios en cada tubo e incubar en la oscuridad durante la noche a 2-8 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Montaje de enteroides apicales teñidos (Día 1)<ol><li>Lleve el montante a base de glicerol que contenga colorante nuclear azul a RT durante 1 h.</li>
		<li>Centrifugar los tubos a 300 x g durante 4 min a 4 °C. Retire 100 μL del sobrenadante y resuspenda las células en los ~100 μL restantes de sobrenadante. Transfiera la suspensión celular a tubos de 0,5 ml.</li>
		<li>Centrifugar los tubos en una mini centrífuga durante 20 s para granular las células. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender los gránulos celulares en 100 μL de tinción de ácido nucleico rojo lejano. Incubar los tubos a RT durante 10 min.</li>
		<li>Centrifugar los tubos en una mini centrífuga durante 20 s para granular las células. Retire el sobrenadante y resuspenda los gránulos celulares en 100 μL de 1x PBS. Repita para un segundo lavado.</li>
		<li>Centrifugar los tubos en una mini centrífuga durante 20 s para granular las células y eliminar 70 μL del sobrenadante. Vuelva a suspender las celdas en el volumen restante de PBS y transfiera el contenido a un cubreobjetos etiquetado (24 mm x 60 mm).</li>
		<li>Aplicar 75 μL de montante directamente sobre la muestra y eliminar las burbujas con la punta de una pipeta. Deje que los cubreobjetos se curen durante la noche (18-24 h) en RT en la oscuridad.</li>
	</ol></li>
	<li>Montaje de enteroides apicales teñidos (Día 2)<ol><li>Después de curar durante la noche, aplique una capa delgada (~ 15 μL) de glicerol a los cubreobjetos. Monte el cubreobjetos en la corredera de vidrio y presione suavemente en su lugar. Toque para eliminar cualquier burbuja entre el cubreobjetos y la corredera.</li>
		<li>Deje que el cubreobjetos se fije en RT en la oscuridad durante un mínimo de 2 h, antes de obtener imágenes con un aumento de 20x con un microscopio confocal. Para la visualización microscópica de enteroides utilizando diversos métodos de adquisición confocal, véase Lallemant et al.37.</li>
	</ol></li>
	<li>Cuantificación inmunofluorescente NOTA: Este método determina la fluorescencia total corregida eliminando la señal de fondo utilizando el software ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/).<ol><li>Abra las imágenes confocales en ImageJ y delinee el área deseada con la herramienta de región de interés (ROI).</li>
		<li>Para definir parámetros definidos por el usuario, vaya a Analizar > Establecer medidas. Seleccione Área > Densidad integrada > Valor gris medio en la pestaña de configuración.</li>
		<li>Desplácese hasta Analizar > medir. Aparecerá una ventana emergente con las mediciones. Copia y pega estas medidas en una hoja de cálculo.</li>
		<li>Para restar la señal de fondo, seleccione una pequeña área no fluorescente de la imagen. Vaya a Analizar > medida para esa región. Aparecerá una ventana emergente con las mediciones. Copia y pega la salida en una hoja de cálculo.</li>
		<li>Multiplique el área de la célula seleccionada por la fluorescencia promedio de las lecturas de fondo y reste la suma de la densidad integrada para calcular la fluorescencia celular total corregida (CTCF). Repita los pasos anteriores para todas las imágenes de interés, mientras mantiene los registros en una hoja de cálculo o paquete de software estadístico (consulte Tabla de materiales).</li>
	</ol></li>
</ol>3. Viabilidad celular de NEC en un plato apical
<ol><li>Tratamientos enteroides<ol><li>Establezca el modelo NEC-in-a-dish apical-out durante 24 h, como en el Paso 1.</li>
		<li>Reactivo del ensayo de viabilidad celular de descongelación durante la noche a 4 °C. El día del ensayo, lleve el reactivo a RT 30 min antes de usarlo. Invierta el reactivo para mezclar.</li>
		<li>Antes de realizar el ensayo, retire 100 μL de medio de cada pocillo, dejando los 400 μL restantes. Agregue 400 μL de reactivo de ensayo de viabilidad celular a cada pocillo.</li>
		<li>Mezclar vigorosamente bien el contenido en un agitador de placas a RT durante 5 min a 200 rpm para inducir la lisis celular. Después de agitar, incubar el plato en RT durante 25 minutos adicionales.</li>
		<li>Después de 25 minutos de incubación, mezclar el contenido de un pocillo mediante pipeteo y transferir 200 μL de los 800 μL a un solo pocillo de una placa de 96 pocillos, opaca, de poliestireno y fondo transparente. Repita para los 600 μL restantes, creando cuatro réplicas técnicas por pozo. Transfiera el contenido restante de cada pocillo de la placa de 24 pocillos a una placa de 96 pocillos de esta manera.</li>
		<li>Utilizando un lector de placas capaz de luminiscencia, registre los valores a 0,25 ms de integración y compare los valores relativos entre los tratamientos. Alternativamente, compare la luminiscencia del tratamiento con un estándar de trifosfato de adenosina (ATP).</li>
	</ol></li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar y no tienen conflictos de intereses.

El reciente desarrollo de modelos enteroides derivados de criptas epiteliales intestinales permite un tejido in vitro fisiológicamente más relevante en el que estudiar la patogénesis necrosante de la enterocolitis. A pesar de incluir todos los principales tipos de células diferenciadas del epitelio intestinal, los enteroides 3D todavía están sujetos a varias limitaciones significativas. Los enteroides convencionales basolaterales están suspendidos en domos de hidrogel 3D ECM, cuya composición y densidad pueden l...

La enterocolitis necrosante (ECN), una enfermedad inflamatoria grave del intestino delgado que ocurre en hasta 10% de los recién nacidos prematuros, se asocia comúnmente con alta morbilidad y mortalidad 1,2. Las tasas de mortalidad cercanas al 50% en lactantes de muy bajo peso al nacer (<1500 g), que requieren intervención quirúrgica, no son infrecuentes3. Mientras que la etiología exacta de la ECN no se comprende actualmente, se cree que los factores de riesgo, como la alimentación con fórmula, se combinan con anomalías fisiológicas, como disbiosis, epitelio intestinal inmaduro y barrera intestinal disfuncional, en el desarrollo de la enfermedad 2,4. A pesar de los esfuerzos significativos, se ha avanzado poco en la prevención o el tratamiento de la ECN en la última década5. Se requiere un nuevo método in vitro para estudiar la ECN y la disfunción de la barrera epitelial intestinal asociada para avanzar en la comprensión de la patogénesis de la enfermedad, ya que los hallazgos de modelos animales, hasta ahora, se han traducido mal a la cabecera6.
Se han utilizado varios modelos in vitro para investigar los mecanismos en juego durante la ECN. La línea celular epitelial intestinal humana, Caco-2, se encuentra entre los modelos in vitro más utilizados de NEC 7,8. Las células Caco-2 emulan las características morfológicas del borde en cepillo del intestino delgado, pero, como línea celular, no se diferencian en la amplia variedad de tipos de células in vivo, incluidas las células caliciformes productoras de moco, requeridas para un modelo altamente traducible. HT-29-MTX, células de adenocarcinoma de colon humano, incluyen un fenotipo mixto de enterocito y cáliz, pero aún carecen de tipos de células basadas en criptas del epitelio intestinal9. IEC-6 e IEC-18 son líneas celulares no transformadas con una morfología ileal inmadura similar a la cripta pero no se derivan de tejido humano, lo que limita su capacidad de traducción. Las líneas celulares intestinales FH 74-Int y H4 se derivan del tejido fetal humano y no forman uniones estrechas ni monocapas polarizadas10,11, y por lo tanto son inmaduras en comparación incluso con los bebés más prematuros susceptibles a la ECN. Por lo general, los modelos in vitro de NEC utilizan tratamientos de lipopolisacáridos (LPS) para inducir el receptor tipo toll 4 (TLR4), un receptor importante que inicia la inflamación intestinal en NEC12. El daño mediado por el tratamiento con especies reactivas de oxígeno (ROS), típicamente a través del peróxido de hidrógeno, se utiliza a menudo para inducir daño oxidativo similar al NEC y apoptosis13,14. Como principal impulsor de la inflamación intestinal, el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α), un componente posterior de la señalización inflamatoria TLR4, también se utiliza comúnmente en estos modelos in vitro para imitar la patogénesis in vivo 15.
Los organoides, generados a partir de células madre pluripotentes inducibles (iPSCs), han crecido en popularidad como modelo in vitro del intestino debido a su capacidad para recapitular la compleja arquitectura in vivo y la composición de tipo celular del tejido del que se derivan16,17. Un sistema in vitro relacionado, los enteroides, son organoides derivados de criptas intestinales resecadas que son más fáciles de establecer y mantener que los organoides derivados de iPSC. Los enteroides se cultivan típicamente en una matriz extracelular (ECM) tridimensional (3D) con acceso experimental limitado a la superficie celular basolateral. Se han desarrollado métodos, como la microinyección18,19, para superar esta barrera a la superficie apical, pero la acumulación de desechos celulares desprendidos y moco dentro del lumen hace que la microinyección sea técnicamente difícil e inconsistente. Como las plataformas de microinyección robótica personalizadas no son ampliamente accesibles20, la variabilidad de laboratorio a laboratorio en la capacidad técnica y la técnica general se convierten en variables significativas para superar con los protocolos de microinyección. Las monocapas bidimensionales (2D) derivadas de enteroides 3D disociados, que aún comprenden todos los principales tipos celulares del epitelio intestinal, permiten el acceso a la superficie apical, pero tradicionalmente han sido difíciles de mantener sin una capa alimentadora de miofibroblastos mesenquimales21. Mientras que los soportes permeables al cultivo celular pueden ser utilizados para acceder tanto al lado apical como basolateral de monocapas enteroides sin el uso de miofibroblastos subyacentes, estos insertos requieren escisión y montaje de la membrana antes de su uso con modalidades como la microscopía confocal, lo que resulta en un proceso técnicamente más exigente y difícil cuando se utilizan métodos tradicionales de microscopía22. NEC se ha modelado in vitro utilizando enteroides 3D tradicionales 23,24,25 y soportes permeables 26,27, y la inflamación intestinal se ha replicado recientemente con modelos gut-on-a-chip28,29. Si bien los modelos gut-on-a-chip que incorporan microfluídica son, con mucho, los modelos más avanzados y traducibles, esta tecnología es costosa, compleja e inaccesible para la mayoría de los investigadores30.
Los avances recientes en las técnicas de enteroides apical-out han permitido un acceso más fácil a la superficie apical de enteroides 3D sin correr el riesgo de dañar la integridad estructural del epitelio in vitro 31,32,33. Los enteroides apicales comparten la composición del tipo celular y la función de barrera del epitelio intestinal in vivo, pero, a diferencia de los enteroides 3D típicos, las superficies apicales de estas células se enfrentan al medio de cultivo, lo que permite estudios fisiológicamente más relevantes sobre la absorción de nutrientes, la infección microbiana y la secreción luminal31. Una ventaja adicional de los enteroides apicales es la capacidad de distribuir homogéneamente agentes experimentales a enteroides. No se requiere variar los volúmenes de tratamiento según el tamaño enteroide, como ocurre con la microinyección, y la capacidad de mantener estos enteroides en cultivo en suspensión niega cualquier interferencia de la ECM en la difusión del agente experimental32.
La enterocolitis necrosante es una enfermedad multifactorial que involucra múltiples tipos de células epiteliales intestinales y una variedad de factores ambientales y fisiopatológicos34. La composición celular variada de los enteroides intestinales es una clara mejora sobre los monocultivos en el modelado de una enfermedad compleja como la ECN. Curiosamente, mientras que una sola exposición inflamatoria es a menudo suficiente para inducir daño en monocultivos in vitro , los enteroides, como con los modelos de ratón23, parecen requerir un mínimo de dos componentes inflamatorios para inducir un daño similar al NEC6. Aquí, presentamos un modelo apical-out NEC-in-a-dish, utilizando enteroides apical-out en combinación con hipoxia (una característica clínica importante de NEC6) y LPS o TNF-α, como un modelo in vitro mejorado y fisiológicamente más relevante para estudiar las respuestas epiteliales a la inflamación similar a la ECN y, potencialmente, identificar objetivos terapéuticos. Describimos un protocolo para invertir la polaridad de enteroides 3D del intestino delgado, así como un protocolo de tinción inmunofluorescente para identificar la interrupción de la barrera epitelial y las alteraciones de la expresión de proteínas de unión. Finalmente, demostramos además un ensayo de viabilidad enteroide simple para determinar el impacto de nuestro modelo NEC-in-a-a-dish de doble golpe y salida apical.

<table><tbody><tr><td>0,5 m EDTA, pH 8,0</td><td>Fisher Scientific</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga de 1,5</td><td>mL Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Tubo cónico</td><td>VWR</td><td>89039-666</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter-Glo Ensayo de viabilidad celular 3D</td><td>Promega</td><td>G9681</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar Accesorio ultrabajo Microplacas de 24 pocillos</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-602</td><td></td></tr><tr><td>Cubierta de vidrio 24 mm x 60 mm</td><td>Thermo Scientific</td><td>102460</td><td></td></tr><tr><td>Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Anticuerpo secundario altamente adsorbido cruzado, Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Scientific</td><td>A-21202</td><td></td></tr><tr><td>Donkey Anticuerpo IgG anti-Conejo, Cy3 conjugado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>AP182C</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mezcla de Jamón F-12 (DMEM-F12) con 15 mM Tampón HEPES</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>36254</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo E-cadherina (7H12)</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP2-19051</td><td></td></tr><tr><td>Solución de formaldehído 4%, tamponada, pH 6.9</td><td>Millipore Sigma</td><td>1004960700</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>56-81-5</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>Fiji</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>IntestiCult Medio de crecimiento de organoides (humano)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>06010</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocal Leica SP8</td><td></td> Lipopolisacáridos de Escherichia coli <td></td><td></td></tr><tr><td>O111:B4, purificados por cromatografía de filtración en gel</td><td>Millipore Sigma</td><td>L3012-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-7</td><td></td></tr><tr><td>Suero de burro normal</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>566460</td><td></td></tr><tr><td>Nunc MicroWell de 96 pocillos, Nunclon Delta, microplaca de fondo plano</td><td>Thermo Scientific</td><td>136101</td><td></td></tr><tr><td>PBS (solución salina tamponada con fosfato), 1x [-] calcio, magnesio, pH 7.4</td><td>Corning</td><td>21-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>Montaje antidecoloración de vidrio prolongado con NucBlue</td><td>Fisher Scientific</td><td>P36983</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-villano recombinante [SP145]</td><td>Abcam</td><td>ab130751</td><td></td></tr><tr><td>TNF-& alfa humano recombinante; proteína 100 y micro; g</td><td>Bio-Techne</td><td>210-TA-100/CF</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax iD3 Lector de microplacas multimodo</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermo Forma Series II Incubadora trigás con camisa de agua, 184L</td><td>Fisher Scientific</td><td>3140</td><td></td></tr><tr><td>TO-PRO-3 Yoduro (642/661)</td><td>Thermo Scientific</td><td>T3605</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Tubos, 0,5 mL, tapa plana</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB0350</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9005-64-5</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro modelo enteroide apical de enterocolitis necrosante

In Vitro Apical-Out Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis

La enterocolitis necrosante (ECN) es una enfermedad devastadora que afecta a los recién nacidos prematuros, caracterizada por inflamación intestinal y necrosis. Los enteroides han surgido recientemente como un sistema prometedor para modelar patologías gastrointestinales. Sin embargo, los métodos utilizados actualmente para la manipulación enteroide carecen de acceso a la superficie apical del epitelio (tridimensional [3D]) o consumen mucho tiempo y recursos (monocapas bidimensionales [2D]). Estos métodos a menudo requieren pasos adicionales, como la microinyección, para que el modelo se vuelva fisiológicamente traducible. Aquí, describimos un protocolo fisiológicamente relevante y económico para estudiar NEC in vitro invirtiendo la polaridad enteroide, lo que resulta en la superficie apical hacia afuera (apical-out). También se proporciona un protocolo de tinción inmunofluorescente para examinar la integridad de la barrera enteroide y la expresión de proteínas de unión después de la exposición al factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) o lipopolisacárido (LPS) en condiciones normóxicas o hipóxicas. También se evalúa la viabilidad de enteroides apicales 3D expuestos a LPS normóxico o hipóxico o TNF-α durante 24 h. Los enteroides expuestos a LPS o TNF-α, en combinación con hipoxia, exhibieron una interrupción de la arquitectura epitelial, una pérdida de la expresión de proteínas de unión adherentes y una reducción en la viabilidad celular. Este protocolo describe un nuevo modelo apical-out NEC-in-a-dish que presenta una plataforma fisiológicamente relevante y rentable para identificar posibles objetivos epiteliales para terapias NEC y estudiar la respuesta intestinal prematura a la terapéutica.

El uso de enteroides para modelar la inflamación intestinal, incluso en el contexto de la enterocolitis necrosante, es ahora común. Sin embargo, la mayoría de los métodos utilizados actualmente carecen de acceso a la superficie apical de los enteroides, negando la relevancia fisiológica de los compuestos destinados a su uso eventual como terapéutica oral, o son técnicamente difíciles y requieren mucho tiempo, como con las monocapas derivadas de enteroides. Para aumentar la utilidad de los modelos enteroides in vitro<...

Este protocolo describe un modelo apical-out necrotizante enterocolitis (ECN) en un plato que utiliza enteroides del intestino delgado con polaridad invertida, lo que permite el acceso a la superficie apical. Proporcionamos un protocolo de tinción inmunofluorescente para detectar la disrupción epitelial relacionada con NEC y un método para determinar la viabilidad de enteroides apicales sometidos al protocolo NEC en un plato.

In vitro Modelo enteroide apical de enterocolitis necrosante

Necrotizing enterocolitis (NEC) is a devastating disease affecting preterm infants, characterized by intestinal inflammation and necrosis. Enteroids have ...

Este protocolo describe el primer modelo apical-out in-a-dish y es una mejora crítica sobre los modelos basales laterales enteroides en una placa al establecer el modelado in vitro de posibles terapias destinadas a la administración oral. Este método permite el acceso a la superficie apical de los enteroides. Los compuestos se pueden agregar a los medios celulares y los compuestos se absorben apicalmente como lo harían in vivo.Los investigadores interesados en establecer un sistema in vitro de inflamación intestinal para probar posibles terapias orales pueden encontrar esta técnica especialmente útil. El tejido procedente de diferentes edades y especies puede requerir una mayor estandarización. Por lo tanto, los pacientes pueden ser necesarios al establecer tiempos de inversión de polaridad.Para invertir la polaridad de los enteroides 3D, aspira medios de cada pocillo de una placa de 24 pocillos de enteroides basolaterales 3D establecidos. Agregue 500 microlitros de cinco milimolares helados, EDTA o PBS a cada pocillo de una placa de 24 pocillos e interrumpa mecánicamente suavemente el extracto de la membrana basal o la cúpula de la matriz extracelular pipeteando hacia arriba y hacia abajo de cinco a seis veces con una pipeta P 200. Transfiera el contenido de cuatro pocillos a un tubo cronometrado de 15 mililitros.Luego agregue ocho mililitros de EDTA helado que cortan PBS al tubo. Transfiera los 20 pozos restantes de la misma manera. Incubar los tubos a cuatro grados centígrados durante una hora en una plataforma giratoria o agitador a 330 RPM.Después de la incubación, centrifugar los tubos y desechar el sobrenadante de cada tubo. Combine y lave los gránulos con cinco mililitros de DMEM F12. Luego centrifugar la suspensión celular y retirar el sobrenadante antes de añadir 12 mililitros de medio libre de antibióticos al tubo asegurándose de que los gránulos celulares se resuspendan.Pipepet 500 microlitros de la suspensión enteroide en cada pocillo de una placa de fijación ultra baja de 24 pocillos. Incubar la placa a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante dos a cinco días o hasta que los enteroides hayan invertido la polaridad. En el primer día de abstención, transfiera el contenido de cuatro pocillos de una placa de 24 pocillos a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros.Repita para todos los pozos deseados con cada tratamiento en un tubo separado. Centrifugar los tubos y resuspender el pellet en 300 microlitros de fijador de aldehído al 4% a temperatura ambiente. Después de 30 minutos lavar los pellets con 500 microlitros de PBS.Agregue 500 microlitros de 0.1% Triton X 100 a los tubos. Incubar los tubos durante una hora a temperatura ambiente. Luego, coloque los tubos en un rotador o agitador a 200 RPM durante 15 minutos a dos a ocho grados centígrados.Después de la última incubación, agregue 500 microlitros de 10% NDS en PBS T e incube a temperatura ambiente durante 45 minutos. Durante la incubación, prepare la solución primaria de anticuerpos. Al día siguiente, agregue de 250 a 500 microlitros PBS T a los tubos dependiendo del tamaño del pellet, y colóquelos en el rotador o agitador a 200 RPM durante una hora a dos a ocho grados centígrados.Agregue 200 microlitros de la solución de anticuerpos secundarios e incube los tubos a dos a ocho grados centígrados en la oscuridad. Al día siguiente, proceda a montar enteroides apicales teñidos girando los tubos y retirando 100 microlitros de sobrenadante. Resuspender las células en los 100 microlitros restantes de sobrenadante y transferir la suspensión celular a tubos de 500 microlitros.Centrifugar los tubos en una mini centrífuga durante 20 segundos. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender los gránulos en 100 microlitros de tinción de ácido nucleico rojo lejano a temperatura ambiente. Después de 20 minutos de incubación, centrifugar las células y resuspender los gránulos en 100 microlitros de PBS.Después del segundo lavado y centrifugación, retire 70 microlitros del sobrenadante y vuelva a suspender los gránulos en el volumen restante de PBS. Luego transfiera la suspensión celular a un cubreobjetos etiquetado de 24 por 60 milímetros. Aplique 75 microlitros de montante directamente sobre la muestra y elimine cualquier burbuja con una punta de pipeta.Después de curar durante la noche en la oscuridad, aplique una capa delgada de glicerol a los resbalones de la cubierta, luego monte los deslizamientos de la cubierta en el portaobjetos de vidrio y presiónelo suavemente en su lugar. Toque para eliminar cualquier burbuja entre la cubierta y la corredera. Permita que la cubierta se fije a temperatura ambiente en la oscuridad durante dos horas antes de obtener imágenes de los enteroides con un aumento de 20 veces con un microscopio confocal.Para los tratamientos enteroides, establecer una enterocolitis necrotizante apical en un modelo de plato durante 24 horas como se describe en el manuscrito de texto. Antes de realizar el ensayo, retire 100 microlitros de medios de cada pocillo dejando los 400 microlitros restantes. Agregue 400 microlitros de reactivo de ensayo de viabilidad celular a cada pocillo.Mezcle vigorosamente el contenido en un agitador de placas durante cinco minutos a 200 RPM para inducir la lisis celular. A continuación, transfiera 200 microlitros a un solo pocillo de una placa de fondo transparente de 96 pozos. Repita para los 600 microlitros restantes creando cuatro réplicas técnicas por pozo.Utilizando un lector de placas capaz de luminiscencia, registre los valores a 0,25 milisegundos de integración y compare los valores relativos entre los tratamientos. La tinción de inmunofluorescencia representativa del control confirmó la localización apical de los núcleos hacia el lumen y la detección de villano en el borde exterior del epitelio. En comparación con el control, la exposición a lipopolisacáridos, necrosis tumoral alfa o hipoxia sola no indujo cambios manifiestos en la morfología de las células macroscópicas E-cadherina o localización de villanos o intensidad fluorescente.El tratamiento con lipopolisacárido o necrosis tumoral alfa en combinación con hipoxia interrumpió la arquitectura epitelial y demostró una pérdida significativa de la unión de adherencia y la expresión de proteínas del borde en cepillo revelada por la pérdida de audición ECA y tinción de villanos. La viabilidad celular apical se determinó en condiciones normóxicas o hipóxicas. En condiciones normóxicas en comparación con el lipopolisacárido control o la necrosis tumoral alfa no afectó significativamente la viabilidad celular de los enteroides.Sin embargo, se observaron reducciones significativas en la viabilidad en lipopolisacáridos o necrosis tumoral alfa en combinación con hipoxia en comparación con hipoxia sola. Mientras se establece el modelo apical en un plato. Recuerde mantener el EDTA en la suspensión celular helada.Esto mejorará la inversión de la polaridad y asegurará que toda la ECM se licúe y elimine correctamente. Otras aplicaciones posteriores como QPCR, RNA-seq, western blot o evaluaciones funcionales de la permeabilidad de la barrera se pueden realizar más para caracterizar la respuesta a la señalización inflamatoria en hipoxia.

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Este video demuestra el desarrollo de la enfermedad de enterocolitis necrotizante en un modelo de enteroide neonatal derivado de humanos inducido por el tratamiento con lipopolisacáridos. Este modelo ayuda a estudiar la fisiopatología intestinal.

Inducción de enterocolitis necrotizante en modelo enteroide epitelial humano

Enteroids se perfila como un modelo novedoso en el estudio de las enfermedades humanas. El protocolo describe cómo simular un modelo enteroide de enterocolitis necrosante humana tratamiento de lipopolisacárido (LPS) de enteroids generados a partir de tejido neonatal. Enteroids recogidos demuestran cambios inflamatorios similares a los observados en humana enterocolitis necrotizante.

Un modelo de enteroide epitelial humano novedoso de Enterocolitis necrosante

La enterocolitis necrosante (ECN) es la enfermedad gastrointestinal (GI) más grave que a menudo ocurre en bebés prematuros, especialmente en bebés de muy bajo peso al nacer, con alta mortalidad y patogénesis poco clara. La causa de la NEC puede estar relacionada con anomalías inflamatorias del sistema regulador inmunitario. Un modelo animal NEC es una herramienta indispensable para la investigación inmune de la enfermedad NEC. Los modelos animales NEC generalmente usan ratones neonatales C57BL...

Un modelo de ratón BALB/c neonatal de enterocolitis necrosante

Este protocolo describe un método para establecer y realizar un ensayo de herida por rasguño en monocapas bidimensionales (2D) derivadas de enteroides tridimensionales (3D) aislados del íleon de primates no humanos.

Efecto del ácido hialurónico 35 kDa en un modelo in vitro de lesión prematura del intestino delgado y curación utilizando monocapas derivadas de enteroides

Este protocolo detalla el establecimiento de enteroides, un modelo intestinal tridimensional, a partir del tejido intestinal fetal. Se utilizaron imágenes inmunofluorescentes de biomarcadores epiteliales para la caracterización del modelo. La exposición apical de lipopolisacáridos, una endotoxina bacteriana, mediante la técnica de microinyección indujo la permeabilidad epitelial de una manera dependiente de la dosis medida por la fuga de dextrano fluorescente.

Prueba de permeabilidad epitelial en enteroides derivados de tejido fetal

El presente protocolo describe un método que utiliza lucifer amarillo en un modelo enteroide apical-out para determinar la permeabilidad intestinal. Este método se puede utilizar para determinar la permeabilidad paracelular en enteroides que modelan enfermedades inflamatorias intestinales como la enterocolitis necrosante.

Determinación de la permeabilidad intestinal usando amarillo de lucifer en un modelo enteroide apical-out

Escherichia coli causa sepsis en neonatos que ingieren la bacteria alrededor del momento del nacimiento. El proceso involucrado en la capacidad de E. coli para viajar desde el tracto entérico al torrente sanguíneo es poco conocido. Este modelo in vitro evalúa la capacidad de las cepas de E. coli para viajar a través de las células epiteliales intestinales.

Evaluación de la transcitosis intestinal de aislados de bacteriemia neonatal por Escherichia coli

Este protocolo describe un modelo in vitro de enterocolitis necrotizante (ECN), que puede utilizarse para estudios mecanicistas de patogénesis de la enfermedad. Cuenta con un chip microfluídico sembrado con enteroides intestinales derivados del intestino neonatal humano, células endoteliales y el microbioma intestinal de un neonato con ECN grave.

Modelo microfluídico de enterocolitis necrotizante que incorpora enteroides, enteroides, intestinos neonatales humanos y un microbioma disbiótico

Este protocolo describe un modelo de ratón neonatal de enterocolitis necrotizante (ECN) y el posterior aislamiento de células inmunitarias de la lámina propia del intestino delgado murino neonatal.

Un modelo de ratón neonatal de enterocolitis necrotizante y aislamiento de lámina propia para el perfil de células inmunitarias

Trasplante de células madre en un In vitro Simulación de isquemia / reperfusión modelo

Aprenda a desarrollar un modelo enteroide apical-out para estudiar enterocolitis necrosante in vitro. Este método permite evaluar terapéuticas orales accediendo a la superficie apical de los enteroides.

In vitro Modelo enteroide apical de enterocolitis necrosante

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