Investigación de los impulsores de la antirecompensa en el comportamiento de adicción con métodos de expresión génica unicelular anatómicamente específicos
4 de agosto de 2022
La combinación de microdisección de captura láser y RT-qPCR microfluídica proporciona especificidad anatómica y biotecnológica en la medición del transcriptoma en neuronas individuales y glía. La aplicación de métodos creativos con el enfoque biológico de un sistema para la enfermedad psiquiátrica puede conducir a avances en la comprensión y el tratamiento, como la hipótesis de la neuroinflamación antirecompensa en la adicción.
El protocolo es altamente sensible y permite la captura de alto rendimiento del perfil de expresión génica a una resolución de una sola célula. La técnica proporciona especificidad anatómica espacial y molecular a una resolución de una sola célula. Después de cosechar el cerebro, seleccionar las células individuales y preparar el ARNm, inyecte líquido de la línea de control en el chip qPCR para el cebado.
Inserte el chip qPCR en el dispositivo de mezcla microfluídica. Seleccione el script Prime y ejecute el programa. Después de completar el programa, retire el chip qPCR cebado y pipete seis microlitros de la reacción de la placa de muestra de PCR en el pocillo de muestra correspondiente en el chip qPCR cebado.
Ahora, pipetear seis microlitros de la reacción de la placa de ensayo de PCR en el pocillo de ensayo correspondiente en el chip qPCR cebado. Luego inserte el chip en el dispositivo de mezcla microfluídica. Seleccione el script Load Mix y ejecute el programa.
Encienda la plataforma RT-qPCR microfluídica y caliente la bombilla. Retire el chip qPCR del dispositivo de mezcla microfluídica y despegue la etiqueta protectora de la parte inferior del chip. Abra la plataforma RT-qPCR microfluídica y cargue el chip qPCR en la plataforma.
Inicie el software de recopilación de datos haciendo clic en Iniciar una nueva ejecución. Verifique el código de barras del chip y el tipo de chip. Luego haga clic en siguiente.
Seleccione el archivo de ejecución de chip y busque la ubicación del archivo para el almacenamiento de recopilación de datos. Luego haga clic en Tipo de aplicación y seleccione Expresión génica. Seleccione ROX para una referencia pasiva, una sola sonda y EVAGreen para el tipo de sonda.
Haga clic para seleccionar el programa de ciclo térmico y seleccione Biomark HD GE: Fast 96x96 PCR + Melt v2. PCL. Descargue el software de análisis de datos.
Inicie el software para analizar el experimento RT-qPCR microfluídico. Haga clic en Chip Run y abra el ChipRun. BML creado por el experimentador.
Aparecerá una ventana que muestra los detalles experimentales, incluida la referencia pasiva, la sonda y el programa térmico de PCR. En la pestaña Explorador de chips, haga clic en Configuración de placa de muestra y cree una nueva plantilla de placa de muestra. Copie y pegue las etiquetas de muestra en la hoja de cálculo del software según el diseño experimental.
Introduzca el nombre de la muestra y la concentración de ARN utilizada para las muestras estándar. Ahora, asigne la configuración de ejemplo haciendo clic en mapa en el menú de tareas y seleccionando SBS96-Left.dsp. A continuación, seleccione Vistas detalladas para actualizar estos cambios en el archivo y haga clic en Analizar.
Seleccione Configuración de la placa del detector y cree una nueva placa de ensayo. Seleccione el tipo y formato de contenedor adecuado. Pegue los nombres de los ensayos según el diseño experimental y haga clic en Analizar.
En el panel de configuración de análisis, haga clic en Usuario y establezca el ajuste en automático. Ahora, revise manualmente cada reacción en el chip 96x96. Visualice las curvas de amplificación y fusión para determinar si cada reacción siguió el patrón de qPCR esperado.
Si la curva de amplificación o fusión no coincide con lo que se espera, falla esa reacción. Después de QC, exporte los datos seleccionando archivo, haciendo clic en exportar y guardando el conjunto de datos como un archivo csv. Como el archivo csv exportado tiene una matriz de error de paso y una matriz con valores CT sin procesar, use la matriz de error de paso para reemplazar las celdas fallidas del conjunto de datos con NA. Descargue la versión reciente del software de código abierto R y, a continuación, descargue la aplicación R Studio.
Para el centrado de la mediana, use el software R para calcular el valor medio de TC calculado a partir de todos los valores de TC para una muestra individual y luego reste todos los valores individuales de TC de este valor mediano para obtener un valor de TC menos delta. Para la normalización de genes de limpieza, calcule la expresión promedio de los genes de limpieza para cada muestra y use este valor para restar los valores individuales de TC. Para generar un valor menos delta delta CT, ejecute el código en el software R.
Cargue el conjunto de datos normalizado en R y analice los datos mediante la función de escala, genere los datos a escala y, a continuación, utilice la función de mapa de calor de R o software independiente para generar un mapa de calor. Para organizar el conjunto de datos para otras funcionalidades, calcule las correlaciones de Pearson entre cada gen seguido de la función de fusión. Exporte y cargue estos datos en un software de red de correlación de genes.
Las neuronas mostraron una expresión elevada de NeuN y las muestras microgliales mostraron una expresión significativa de los marcadores microgliales Cd34 y Cx3xr1. Las muestras Th+neuronales demostraron una expresión significativamente elevada de Th en comparación con las muestras Th-neuronales y microglia. Las neuronas Th mostraron una expresión significativa de Gcg, lo que sugiere que las muestras neuronales Th están enriquecidas con neuronas que usan Glp1 como neurotransmisor.
El análisis de discriminación lineal mostró que estos tres tipos de células tenían diferentes perfiles de expresión génica en los 65 genes. Los subfenotipos celulares de muestras de neuronas enriquecidas con Glp1 a través de una serie de tiempo de abstinencia de alcohol se representaron utilizando mapas de calor. El subfenotipo A, que expresa altamente el grupo de genes inflamatorios uno, aumenta en proporción en el punto de tiempo de retiro de ocho horas y alcanza un máximo a las 32 horas de retiro.
El subfenotipo inflamatorio se normaliza para controlar la retirada de 176 horas. El subfenotipo B, que expresa altamente el grupo dos de genes del receptor GABA, demuestra una supresión general en la expresión de este grupo de genes por la condición de abstinencia de 176 horas. La expresión génica de muestras individuales se combinó en promedios para que la expresión de grupos de genes y la ubicación de proteínas de esa transcripción génica pudieran visualizarse a lo largo de la serie temporal.
Esta técnica se puede aplicar a cualquier sistema biológico o tejido para comprender la respuesta celular a una enfermedad o una perturbación. Eso es descifrar la respuesta molecular a resolución de una sola célula relacionada con la arquitectura espacial y anatómica del tejido.
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Descripción general
Este estudio utiliza la microdisección por captura láser y la RT-qPCR en microfluido para analizar los transcriptomas en neuronas y células gliales individuales. Se destaca la alta sensibilidad y especificidad del método, lo que puede mejorar nuestra comprensión de las enfermedades psiquiátricas asociadas con la neuroinflamación, particularmente en el contexto de la adicción.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Análisis Transcripcional
- Trastornos Psiquiátricos
Antecedentes
- Comprender los patrones de expresión de ARN en neuronas y células gliales es fundamental para elucidar las enfermedades psiquiátricas.
- Los métodos anteriores carecían tanto de especificidad espacial anatómica como molecular.
- Se ha implicado a la neuroinflamación en la hipótesis de anti-recompensa de la adicción.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método sensible para capturar perfiles de expresión génica con resolución a nivel de célula individual.
- Analizar cómo estos cambios moleculares se relacionan con las respuestas conductuales en condiciones psiquiátricas.
- Evaluar el papel de la neuroinflamación en los mecanismos relacionados con la adicción.
Métodos Utilizados
- Se empleó RT-qPCR microfluídico, lo que permitió la recolección de datos de alto rendimiento a partir de células individuales.
- Se aislaron células individuales del tejido cerebral tras la extracción, para la preparación y análisis de ARNm.
- Se implementaron protocolos detallados para el cebado del chip, recolección de datos y análisis.
- Los datos de expresión génica se validaron y analizaron utilizando software estadístico.
Resultados principales
- Las neuronas exhibieron una expresión elevada de NeuN, mientras que las microglías mostraron una expresión significativa de Cd34 y Cx3xr1.
- Se identificaron diferentes subtipos según los perfiles de expresión génica, notablemente en respuesta a la abstinencia y la neuroinflamación.
- Se extrajeron conclusiones clave sobre los grupos génicos y su regulación durante el estrés por abstinencia a partir de los análisis de mapas de calor.
Conclusiones
- El estudio demuestra que combinar estas metodologías permite obtener una comprensión más completa de las respuestas específicas por tipo celular a la neuroinflamación.
- Los conocimientos obtenidos podrían ayudar en el desarrollo de enfoques terapéuticos dirigidos para trastornos psiquiátricos que implican adicción.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El perfilado de expresión génica a nivel de célula individual con especificidad anatómica permite la reducción mecanicista de riesgos en el descubrimiento de dianas neuropsiquiátricas, particularmente en las vías de adicción y de anti-recompensa. Este enfoque proporciona una visión de alta resolución sobre los factores impulsores de la neuroinflamación, fortaleciendo la confianza predictiva en la intersección entre la patología molecular y los fenotipos conductuales. La integración de estos métodos en las fases iniciales de descubrimiento mejora la selección de carteras y la continuidad traslacional en el desarrollo de fármacos para el sistema nervioso central.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la evaluación de hipótesis neuroinflamatorias y de desrecompensa con resolución a nivel de célula individual.
- Apoya la validación funcional de dianas al vincular la expresión génica con especificidad anatómica y fenotípica.
- Facilita la reducción mecanicista de riesgos para dianas del SNC implicadas en adicción y abstinencia.
- Mejora la confianza predictiva para el avance de dianas neuropsiquiátricas.
Desarrollo de ensayos y cribado
- Prepara sistemas celulares validados para cribados transcriptómicos y fenotípicos posteriores.
- Proporciona resultados cuantitativos y reproducibles de expresión génica para la estandarización de ensayos.
- Permite el análisis de alto rendimiento de redes génicas en tipos celulares definidos.
- Apoya la evaluación confiable de los efectos de compuestos en vías neuroinflamatorias.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Relaciona hallazgos moleculares con sistemas neuroanatómicos relevantes para la enfermedad en modelos de adicción.
- Proporciona continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica de biomarcadores de neuroinflamación.
- Informa decisiones de avance ajustadas al riesgo para programas terapéuticos del sistema nervioso central.
- Mejora el desarrollo de biomarcadores traslacionales mediante la correlación de la expresión génica con fenotipos de abstinencia.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
Este método conecta el descubrimiento inicial y la investigación preclínica al permitir un análisis de expresión génica de alto rendimiento y anatómicamente preciso en tejidos del SNC.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías en mecanismos de neuroinflamación y antirecompensa.
- Tamizaje: Proporciona datos cuantitativos reproductibles de expresión génica para el desarrollo de ensayos y el tamizaje de compuestos.
- Análisis: Genera conjuntos de datos escalables para análisis de redes, mapas de calor y comparaciones estadísticas de fenotipos celulares.
- Investigación Traducional: Conecta firmas moleculares con estados de abstinencia relevantes para enfermedades y alineación de biomarcadores.
- Reutilización Empresarial: Ofrece una plataforma reutilizable para la transcriptómica de célula única en diversos modelos del SNC y de enfermedades.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en la validación de dianas en el sistema nervioso central.
- Valor operativo: Proporciona flujos de trabajo estandarizados, escalables y reproducibles de expresión génica a nivel de célula individual.
- Valor estratégico: Permite tomar decisiones informadas de avance o interrupción del desarrollo y una gestión eficiente del capital en la investigación y desarrollo de fármacos neuropsiquiátricos.
- Impacto en la cartera: Facilita la priorización y el avance ajustados al riesgo de candidatos terapéuticos para el sistema nervioso central.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en microdisección por captura láser y plataformas de RT-qPCR microfluídicas.
- Exige una infraestructura analítica robusta para el procesamiento de datos de alto rendimiento y análisis de redes.
- Necesita la estandarización entre equipos de los protocolos de preparación de muestras y normalización de datos.
- Adaptable a diversos tejidos del sistema nervioso central y modelos de enfermedad con una optimización adecuada.
- Depende del acceso a instrumentación especializada y apoyo en bioinformática.
