Un protocolo simple de ensayo de fosa para visualizar y cuantificar la reabsorción osteoclástica in vitro

Nuestro protocolo describe un método simple y confiable para un ensayo de reabsorción osteoclástica. El uso de placas de cultivo celular recubiertas de fosfato de calcio se puede preparar y visualizar fácilmente utilizando materiales disponibles en el laboratorio. A diferencia de las rodajas opacas de hueso o dentina, el recubrimiento de fosfato de calcio permite la visualización de las fosas de reabsorción y las células al mismo tiempo.

En este protocolo, utilizamos PBMC para la diferenciación de osteoclastos. Sin embargo, también se puede aplicar a otros tipos de células como los monocitos derivados de la médula ósea o las células Raw 264.7. Primero tome una placa de cultivo celular de fondo plano de 96 pocillos y pipetee 300 microlitros de solución de fosfato de calcio previamente preparada en cada pozo.

Luego, cubra el plato con la tapa e incube el plato a 37 grados centígrados durante tres días. Después de tres días, aspire la solución de precalcificación de las placas de cultivo celular de 96 pocillos precalcificadas y agregue 300 microlitros de solución de fosfato de calcio a cada pocillo. Cubra las placas con una tapa e incube a 37 grados centígrados durante un día.

Luego invierta la placa para verter la solución y lave bien la placa tres veces con agua desionizada. Seque inmediatamente la placa con un secador de pelo o dióxido de carbono comprimido o gas nitrógeno para mantener una superficie uniforme. Ahora, irradia la placa recubierta en un banco limpio con rayos ultravioleta durante una hora.

Use la placa recubierta inmediatamente o selle la placa con Parafilm y guárdela a temperatura ambiente. Diluya 15 mililitros de sangre fresca con un volumen igual de PBS y mézclelos invirtiendo o pipeteando varias veces. Luego tome 15 mililitros de solución de gradiente de densidad en un tubo cónico de 50 mililitros, incline el tubo y coloque cuidadosamente 30 mililitros de muestra de sangre diluida en los 15 mililitros de solución de gradiente de densidad.

Más tarde, centrifugue el tubo en un rotor de cucharón oscilante sin romperse a 810 veces G durante 20 minutos a 20 grados centígrados. Luego aspire la capa superior dejando la capa de células mononucleares sin perturbar en la interfaz. Transfiera cuidadosamente la capa de células mononucleares a un nuevo tubo cónico de 50 mililitros.

Llene el tubo con PBS, mezcle y centrífique a 300 veces G durante 10 minutos a 20 grados centígrados. Vuelva a suspender PBMC en un alfa-MEM completo que contenga 20 nanogramos por mililitros de factor estimulante de colonias de macrófagos, y siembre de 2,5 veces 10 a la quinta célula por centímetro cuadrado de PBMC en un matraz. Incubar las placas recubiertas de fosfato de calcio con 50 microlitros de suero fetal bovino a 37 grados centígrados durante una hora.

A continuación, lave el matraz dos veces con PBS para separar los precursores de osteoclastos de las células muertas o no adherentes, luego agregue cuatro mililitros de tripsina por matraz de 75 centímetros cuadrados. Después de 30 minutos, detenga la digestión agregando cuatro mililitros de alfa-MEM completo, luego separe cuidadosamente las células con un raspador celular. Transfiera las células a un tubo de 50 mililitros y cuente el número total de células utilizando una cámara de conteo.

Centrifugar el tubo a 350 veces G durante siete minutos para granular las células y volver a gastar el gránulo y completar alfa MEM que contiene M-CSF y RANKL para obtener una vez 10 a las seis células por mililitro. Aspirar el suero fetal bovino a partir de la placa recubierta de fosfato de calcio, y pipetear 200 microlitros de suspensión celular por pozo. Después de la incubación, lave las células dos veces con PBS.

Fije las células con 4% de paraformaldehído durante 10 minutos y lave de nuevo con PBS. Para la tinción, agregue un tampón de permeabilización a las células fijas e incube durante cinco minutos. Para teñir los filamentos de actina, incube las células con 100 microlitros de solución de faloidina marcada con Alexa Fluor 546 en PBS durante 30 minutos, luego aspire la solución de tinción y manche los núcleos usando 100 microlitros de Hoechst durante 10 minutos.

Tiñe el recubrimiento de fosfato de calcio con 100 microlitros de 10 calceína micromolar y PBS durante 10 minutos. Después de lavar tres veces con PBS, capture imágenes. Para la tinción Von Kossa del recubrimiento de fosfato de calcio, agregue 50 microlitros de nitrato de plata al 5% y agua desionizada a cada pozo, e incube la placa bajo radiación ultravioleta durante una hora hasta que el recubrimiento en el fondo de los pozos se haya vuelto marrón.

El recubrimiento de fosfato de calcio en la parte inferior de las placas de 96 pozos parecía ser uniforme y bien adherido. Después de nueve días de cultivo en M-CSF y RANKL en las placas recubiertas de fosfato de calcio, los precursores de osteoclastos formaron fosas de reabsorción y osteoclastos grandes. Los osteoclastos multinucleados ubicados en los pozos expresaron altos niveles de TRAP.

Los osteoclastos maduros mostraron la presencia de tres o más núcleos y el anillo de actina distinto. El recubrimiento de fosfato de calcio verde mostró la presencia de fosas de reabsorción negras. Las imágenes de fluorescencia del área del pozo se midieron utilizando la herramienta de umbral de la imagen J.El número y el tamaño de los osteoclastos se calcularon utilizando el gestor de ROI y la herramienta de selección de polígonos de la imagen J.Los precursores de los osteoclastos cultivados en ausencia de RANKL no pudieron formar pozos de reabsorción, sin embargo, M-CSF y RANKL facilitaron la formación de hoyos osteoclastogénicos.

Y el área del pozo se cuantificó utilizando la imagen J.El secado inmediato de la placa recubierta con flujo de aire ayuda a hacer un recubrimiento uniforme de fosfato de calcio. De lo contrario, es propenso a formar una capa más gruesa en el medio del pozo.