Name: Un protocolo simple de ensayo de fosa para visualizar y cuantificar la reabsorción osteoclástica in vitro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-16T13:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: Aprende un protocolo simple de ensayo de fosa para visualizar y cuantificar la reabsorción osteoclástica in vitro usando placas de cultivo recubiertas con fosfato de calcio. Este método mejora la visualización simultánea de células y fosas de reabsorción.

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Este trabajo fue parcialmente financiado por el Consejo de Becas de China [CSC No. 201808440394]. W.C. fue financiado por CSC.

El protocolo fue revisado y aprobado por el comité de ética local (número de aprobación 287/2020B02).
1. Preparación de placas de cultivo celular recubiertas de fosfato de calcio
<ol><li>Preparación de solución madre de calcio (25 mM CaCl2·2H2O, 1.37 mM NaCl, 15 mM MgCl2·6H2O en tampón Tris)<ol>
<li>Prepare el tampón Tris de 1.0 M y ajuste el pH a 7.4 usando 1 M HCl.</li>
		<li>Coloque un vaso de precipitados de vidrio en un agitador magnético y agregue 100 ml de tampón Tris de 1.0 M.</li>
		<li>Pesar 0,368 g de CaCl2·2H 2O, 8,0 g de NaCl y 0,305 g de MgCl2·6H2O y disolver en tampón Tris uno por uno.</li>
		<li>Ajuste el pH a 7.4 usando 1 M HCl. Almacene a temperatura ambiente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparación de solución madre de fosfato (11.1 mM Na2HPO4· H2O, 42 mM NaHCO3 en tampón Tris)<ol>
<li>Coloque un vaso de precipitados de vidrio en un agitador magnético y agregue 100 ml de tampón Tris de 1.0 M.</li>
		<li>Pesar 0,158 g de Na2HPO4· H2O y 0,353 g de NaHCO3 y disolver en tampón Tris uno por uno.</li>
		<li>Ajuste el pH a 7.4 usando 1 M HCl. Almacene a temperatura ambiente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Precalcificación de placas de cultivo celular de 96 pocillos<ol>
<li>Preparar 30 ml de solución de trabajo mezclando 15 ml de tampón Tris de 1,0 M, 7,5 ml de solución de caldo de calcio (paso 1.1.4) y 7,5 ml de solución madre de fosfato (paso 1.2.3). Filtre la solución con un filtro de 0,2 μm.</li>
		<li>Prepare una placa de cultivo celular de 96 pocillos con fondo plano. Pipetear 300 μL de solución de fosfato de calcio (paso 1.3.1.) a cada pocillo. Cubra el plato con una tapa e incube el plato a 37 °C durante 3 días.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparación de solución de fosfato de calcio (2.25 mM Na2HPO4· H2O, 4 mM CaCl2·2H2O, 0.14 M NaCl, 50 mM Base Tris en ddH2O)<ol>
<li>Añadir 2 mL de 1 M HCl a 40 mL de agua desionizada en un vaso de precipitados con una cuenta de agitación magnética y disolver 0,016 g de Na2HPO4· H2O, 0,0295 g de CaCl2·2H2O, 0,409 g de NaCl y 0,303 g de base Tris uno por uno.</li>
		<li>Ajuste el pH a 7.4 usando 1 M HCl. Agregue agua desionizada para llenar el volumen a 50 mL. Filtre la solución con un filtro de 0,2 μm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Calcificación de placas de cultivo celular de 96 pocillos<ol>
<li>Aspire la solución de precalcificación de las placas de cultivo celular de 96 pocillos precalcificadas y agregue 300 μL de solución de fosfato de calcio (paso 1.4.2) a cada pocillo. Cubra las placas con una tapa e incube a 37 °C durante 1 día.</li>
		<li>Gire la placa para verter la solución y lave la placa tres veces con agua desionizada a fondo. Seque la placa inmediatamente con un secador de pelo o gas CO2 o N2 comprimido para mantener una superficie uniforme.</li>
		<li>Esterilizar la placa recubierta por radiación UV en un banco limpio durante 1 h. Use la placa recubierta inmediatamente o selle la placa con parafilm y guárdela a temperatura ambiente.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Aislamiento de PBMC de sangre periférica humana
<ol><li>Extraer 15 ml de sangre de la vena después de obtener el consentimiento informado por escrito del donante de sangre (voto ético: 287/2020B02).</li>
	<li>Diluya 15 ml de sangre fresca con un volumen igual de PBS y mezcle invirtiendo el tubo varias veces o extrayendo la mezcla dentro y fuera de una pipeta.</li>
	<li>Prepare un tubo cónico de 50 ml que contenga 15 ml de solución de gradiente de densidad (por ejemplo, Ficoll, Tabla de materiales) por tubo. Incline el tubo y coloque cuidadosamente 30 ml de muestra de sangre diluida sobre la solución de gradiente de densidad de 15 ml (muestra de sangre diluida: solución de gradiente de densidad, relación 1: 0.5-1). NOTA: Al superponer la muestra, preste atención a no mezclar la solución de gradiente de densidad con la muestra de sangre diluida.</li>
	<li>Centrifugar a 810 x g durante 20 min a 20 °C en un rotor de cucharón basculante sin freno.</li>
	<li>Aspirar la capa superior dejando la capa celular mononuclear (linfocitos, monocitos y trombocitos) sin perturbaciones en la interfase.</li>
	<li>Transfiera cuidadosamente la capa de células mononucleares a un nuevo tubo cónico de 50 ml.</li>
	<li>Llene el tubo con PBS, mezcle y centrífique a 300 x g durante 10 min a 20 °C (el freno se puede usar a partir de esta etapa).</li>
	<li>Retire con cuidado el sobrenadante por completo. Resuspendir el pellet celular en 50 mL de PBS y centrifugar a 300 x g durante 10 min a 20 °C. Retire con cuidado el sobrenadante por completo.</li>
	<li>Para la eliminación de plaquetas, resuspender el pellet celular en 50 ml de PBS y centrifugar a 200 x g durante 10 min a 20 °C. Retire con cuidado el sobrenadante por completo.</li>
	<li>Transfiera las células resuspendidas a los matraces de cultivo celular para la expansión de los progenitores de OC.</li>
</ol>3. Expansión de los progenitores de OC
<ol><li>Resuspend PBMC en α-MEM completo (10% FBS, 1% Pen/Strep, 1% anfotericina B) que contienen 20 ng/mL M-CSF. PbMC de semillas a una densidad de 2,5 x 105 células/cm2. Por lo general, las células aisladas de 15-20 ml de sangre fresca se pueden sembrar en un matraz de 75 cm2 (1.5-2 x 107 células).</li>
	<li>Alimente las células con α-MEM completo fresco que contenga 20 ng/ ml de M-CSF cada tres días hasta que las células unidas alcancen la confluencia deseada. Los rendimientos típicos son 1.5-2 x 106 celdas / matraz cuando las células son 95% confluentes. Por lo general, el período de expansión dura 6 días. NOTA: El potencial osteoclastogénico de los precursores puede disminuir con el tiempo de cultivo prolongado.</li>
</ol>4. Inducción de osteoclastogénesis en placas recubiertas de CaP
<ol><li>Para facilitar la adhesión celular, incubar las placas recubiertas de CaP con 50 μL de FBS durante 1 h en una incubadora de 37 °C.</li>
	<li>Para separar los precursores de OC, lave el matraz con PBS dos veces para eliminar las células muertas o no adherentes. Añadir 4 mL de tripsina (Tabla de Materiales) por matraz de 75 cm2 , durante 30 min.<ol>
<li>Agregue 4 ml de α-MEM completo para detener la digestión, separe cuidadosamente las células usando un raspador celular y transfiera las células a un tubo de 50 ml.</li>
		<li>Determine el número total de celdas utilizando una cámara de Neubauer o similar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pellet las células por centrifugación durante 7 min a 350 x g. Resuspend el pellet en suficiente α-MEM completo que contenga 20 ng/mL M-CSF y 20 ng/mL RANKL para obtener una concentración de 1 x 106 células/mL.</li>
	<li>Aspirar la solución FBS de la placa de 96 pocillos recubierta de CaP y pipeta 200 μL de suspensión celular por pocillo (2 x 105 células/pocillo).</li>
	<li>Incubar los precursores de OC durante el período de tiempo deseado o con los reactivos deseados relevantes para el diseño experimental. Por lo general, se puede observar un alto número de AO grandes y multinucleados después de 6 días y cuando se están formando pozos de reabsorción. Células de alimentación con medio α-MEM completo fresco que contiene 20 ng/mL M-CSF y 20 ng/mL RANKL cada tres días.</li>
	<li>Al final de la incubación, lave las células con PBS dos veces, fije con paraformaldehído al 4% durante 10 minutos y lave con PBS nuevamente.</li>
	<li>Utilice los AO fijos directamente para la tinción de fluorescencia o guárdelo a 4 °C.</li>
</ol>5. Tinción por fluorescencia de AO y recubrimiento de CaP
<ol><li>Incubar las células fijas con tampón de permeabilización (0,1% Tritón en PBS) durante 5 min.</li>
	<li>Manche los filamentos de actina con 100 μL de solución de faloidina marcada con AlexaFluor 546 en PBS durante 30 min y aspire la solución de tinción. Añadir 100 μL de solución de tinción Hoechst 33342 (10 μg/mL en PBS) durante 10 min para teñir los núcleos. También se puede utilizar DAPI.</li>
	<li>Recubrimiento de CaP de tinción con 100 μL de calceína de 10 μM en PBS durante 10 min. Lavar tres veces con PBS y tomar imágenes.</li>
	<li>Después de las imágenes de fluorescencia, las mismas placas se pueden usar para cuantificar el área del pozo de reabsorción mediante tinción de Von Kossa. Para hacerlo, lave las placas con agua desionizada dos veces.</li>
</ol>6. Cuantificación del área total del pozo de reabsorción
<ol><li>Para teñir el recubrimiento de CaP con tinción de Von Kossa, incubar con 50 μL de AgNO3 al 5% en agua desionizada por pozo bajo radiación UV durante 1 h, hasta que el recubrimiento en el fondo de los pozos se haya vuelto marrón.</li>
	<li>Lave el plato tres veces con agua desionizada y tome imágenes de campo brillante. Un objetivo con poca ampliación, como un objetivo de 1,25x, se puede utilizar para capturar todo el pozo en una imagen. Esto facilita el análisis posterior de la imagen. Se pueden aplicar métodos alternativos para capturar toda el área del pozo.</li>
	<li>Abrir un archivo de imagen con ImageJ: File | Abrir | Imagen | Tipo | 8 bits. Verifique la unidad de escala en la esquina inferior derecha de la imagen utilizando línea recta | Analizar | Establecer escala. Introduzca la longitud en la manta de "distancia conocida", introduzca la nueva unidad de escala en Unidad de longitud y marque la casilla Global.</li>
	<li>Enumerar los parámetros de medición a analizar: Analizar | Establecer medidas. En la ventana Establecer medidas, marque las casillas Área y Límite al umbral.</li>
	<li>Medir el área de pozos: Imagen | Ajustar | Umbral. En la ventana Umbral, marque la casilla Fondo oscuro y haga clic en Automático. El área de los pozos se vuelve roja. Cierre la ventana Umbral y seleccione Analizar | Medida. Guarde el archivo de resultados: archivo | Guardar como.</li>
</ol>7. Cuantificación del número y tamaño de OC, y área normalizada del pozo de reabsorción
<ol><li>Abra una imagen de fluorescencia de osteoclastos con ImageJ y verifique la unidad de escala (consulte el paso 6.3).</li>
	<li>Enumerar los parámetros de medición a analizar: Analizar | Establecer medidas. En la ventana Establecer medidas, marque la casilla Área .</li>
	<li>Describa los OC mediante las selecciones de ROI Manager y Polygon: Analice | Herramientas | Gestor de ROI. Haga clic en Selecciones de polígono en el conjunto de herramientas, delinee un OC (celdas con anillo de actina y ≥ tres núcleos) y haga clic en Agregar [t] en la ventana de ROI Manager. Repita el esquema hasta que se incluyan todos los AO.</li>
	<li>Medir el número y el tamaño de los OC: seleccione todos los elementos en ROI Manager y haga clic en Medir. Guarde el archivo de resultados: archivo | Guardar como (Figura 3E).</li>
	<li>Mida el área del pozo de las imágenes de fluorescencia. Abra la imagen fluorescente del recubrimiento correlacionado con la imagen en el paso 7.3 y verifique la unidad de escala (consulte el paso 6.3).<ol>
<li>Enumere los parámetros de medición que se van a analizar (consulte el paso 6.4). Seleccione | de imagen Ajustar | Umbral. En la ventana Umbral, desactive todas las casillas y haga clic en Automático. El área de los pozos se vuelve roja. Cierre la ventana Umbral y seleccione Analizar | Medida. Guarde el archivo de resultados.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Calcule el área de pozo normalizada por número OC.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Aquí describimos un método simple y confiable para un ensayo de reabsorción osteoclástica utilizando AO derivados y expandidos in vitro de PBMC. Las placas de cultivo celular recubiertas de CaP utilizadas se pueden preparar y visualizar fácilmente utilizando materiales disponibles en el laboratorio. Además de los PBMC no clasificados adoptados en este protocolo, los AO generados a partir de células monocíticas murinas21 y células macrófagos de médula ósea17 también...

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Erratum: A Simple Pit Assay Protocol to Visualize and Quantify Osteoclastic Resorption In Vitro

Los osteoclastos (AO) son macrófagos específicos del tejido derivados de células madre hematopoyéticas (HSC), que desempeñan un papel fundamental en la remodelación ósea junto con los osteoblastos1. Los trastornos óseos inducidos por hormonas sexuales, inmunológicos y malignos que destruyen el hueso sistémica o localmente se deben al exceso de actividad osteoclástica, incluida la osteoporosis relacionada con la menopausia2, la artritis reumatoide3, la enfermedad periodontal4, la enfermedad ósea mieloma5 y la metástasis ósea osteolítica6. Por el contrario, los defectos en la formación y función de LA OC también pueden causar osteopetrosis7. Las HSC se diferencian en progenitores de OC bajo la estimulación del factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF, símbolo genético ACP5). En presencia tanto de M-CSF como del activador del receptor del ligando NF-κB (RANKL, símbolo del gen TNFSF11), los progenitores de OC se diferencian aún más en AO mononucleares y posteriormente se fusionan para convertirse en AO multinucleados 8,9,10. Ambas citoquinas M-CSF y RANKL son indispensables y suficientes para la inducción de marcadores osteoclásticos como el receptor de calcitonina (CT), el activador del receptor del factor nuclear κ B (RANK), la bomba de protones V-ATPasa, la subunidad alfa del canal de cloruro 7 (CIC-7), la integrina β3, la fosfatasa ácida resistente al tartrato (TRAP, símbolo de gen ACP5), la cisteína lisosomal proteasa catepsina K (CTSK) y la metalopeptidasa de matriz 9 (MMP9). Los AO activados forman una zona de sellado en la superficie ósea a través de la formación de un anillo de actina con un borde erizado11,12. Dentro de la zona de sellado, los AO median la reabsorción a través de la secreción de protones a través de la bomba de protones V-ATPasa 12,13, MMP914 y CTSK15, lo que lleva a la formación de lagunas.
Para experimentos in vitro, los progenitores de OC se pueden obtener mediante la expansión de macrófagos de médula ósea del fémur y la tibia de ratones 16,17, así como mediante el aislamiento de células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) a partir de muestras de sangre y capas buffy 18,19,20, o por diferenciación de las células monocíticas murinas inmortalizadas RAW 264.7 21,22.
En el presente protocolo, describimos un ensayo de reabsorción osteoclástica en placas de cultivo celular recubiertas de CaP utilizando AO derivados de PBMC primarios. El método de placas de cultivo celular recubiertas de CaP utilizado aquí se adopta y refina a partir del método descrito anteriormente por Patntirapong et al.17 y Maria et al.21. Para obtener precursores de OC, los PBMC se aíslan por centrifugación por gradiente de densidad y se expanden como se describió anteriormente20.

<table><tbody><tr><td>AgNO3</td><td>SERVA Electroforesis GmbH</td><td>35110</td><td>Nitrato de plata</td></tr><tr><td>a-MEM</td><td>Gibco</td><td>32561-029</td><td>MEM alpha, GlutaMAX, sin nucleósidos</td></tr><tr><td>anfotericina B</td><td>Biochrom</td><td>03-028-1B Solución de</td><td>anfotericina B</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21097-50G</td><td>Cloruro de calcio dihidratado</td></tr><tr><td>Calceína</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0875</td><td>Calceína</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7524</td><td>suero fetal bovino</td></tr><tr><td>Ficoll</td><td>Cytiva 17144002</td><td></td><td>Ficoll Paque Plus</td></tr><tr><td>Tampón de fijación</td><td>Biolegend</td><td>420801</td><td>Paraformaldehído</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Merk</td><td>1.09057.1000</td><td>Ácido clorhídrico</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Promokine</td><td>PK-CA707-40046</td><td>Hoechst 33342</td></tr><tr><td>M-CSF</td><td>PeproTech</td><td>300-25</td><td>M-CSF humano recombinante</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7791-18-6</td><td>Cloruro de magnesio</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A2943,0250</td><td>di- Hidrogenofosfato de sodio anhidro</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Merk</td><td>S7653-250G</td><td>cloruro de sodio</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Merk</td><td></td><td>K15322429 Bicarbonato de sodio</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Lonza</td><td>17-512F</td><td>Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (1X), DBPS sin calcio y magnesio</td></tr><tr><td>Pen-Strep Lonza</td><td></td><td>DE17-602E</td><td>Mezcla de penicilina y estreptomicina</td></tr><tr><td>Faloidina-Alexa Fluor 546</td><td>Invitrogen</td><td>A22283</td><td>Alexa Fluor 546 Faloidina</td></tr><tr><td>RANKL</td><td>PeproTech</td><td>310-01</td><td>Ligando sRANK humano recombinante (derivado de E. coli)</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93362</td><td>Tris(hidroximetil)aminometano</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Alquil fenil polietilenglicol</td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Gibco</td><td>12605010</td><td>Enzimas recombinantes de disociación celular</td></tr></tbody></table>

un protocolo simple de ensayo de fosa para visualizar y cuantificar la reabsorción osteoclástica in vitro

A Simple Pit Assay Protocol to Visualize and Quantify Osteoclastic Resorption In Vitro

Los osteoclastos maduros son células multinucleadas que pueden degradar el hueso a través de la secreción de ácidos y enzimas. Desempeñan un papel crucial en diversas enfermedades (por ejemplo, osteoporosis y cáncer de hueso) y, por lo tanto, son importantes objetos de investigación. In vitro, su actividad puede ser analizada por la formación de pozos de reabsorción. En este protocolo, describimos un método simple de ensayo de fosa utilizando placas de cultivo celular recubiertas de fosfato de calcio (CaP), que se pueden visualizar y cuantificar fácilmente. Los precursores de osteoclastos derivados de células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) se cultivaron en las placas recubiertas en presencia de estímulos osteoclastogénicos. Después de 9 días de incubación, los osteoclastos se fijaron y teñeron para obtener imágenes de fluorescencia, mientras que el recubrimiento de CaP se contrateñió con calceína. Para cuantificar el área reabsorbida, el recubrimiento de CaP en las placas se tiñó con 5% de AgNO3 y se visualizó mediante imágenes de campo brillante. El área del pozo de reabsorción se cuantificó utilizando ImageJ.

El recubrimiento de fosfato de calcio en la parte inferior de las placas de cultivo celular se realizó en dos pasos de recubrimiento que comprenden una precalcificación de 3 días y una etapa de calcificación de 1 día. Como se muestra en la Figura 1, se obtuvo fosfato de calcio distribuido uniformemente en la parte inferior de las placas de 96 pocillos. El recubrimiento se adhirió muy bien al fondo después de los pasos de lavado realizados.
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Aquí, presentamos un procedimiento de ensayo simple y efectivo para ensayos de fosas de reabsorción utilizando placas de cultivo celular recubiertas de fosfato de calcio.

Un protocolo simple de ensayo de fosa para visualizar y cuantificar la reabsorción osteoclástica in vitro

Mature osteoclasts are multinucleated cells that can degrade bone through the secretion of acids and enzymes. They play a crucial role in various diseases ...

Nuestro protocolo describe un método simple y confiable para un ensayo de reabsorción osteoclástica. El uso de placas de cultivo celular recubiertas de fosfato de calcio se puede preparar y visualizar fácilmente utilizando materiales disponibles en el laboratorio. A diferencia de las rodajas opacas de hueso o dentina, el recubrimiento de fosfato de calcio permite la visualización de las fosas de reabsorción y las células al mismo tiempo.En este protocolo, utilizamos PBMC para la diferenciación de osteoclastos. Sin embargo, también se puede aplicar a otros tipos de células como los monocitos derivados de la médula ósea o las células Raw 264.7. Primero tome una placa de cultivo celular de fondo plano de 96 pocillos y pipetee 300 microlitros de solución de fosfato de calcio previamente preparada en cada pozo.Luego, cubra el plato con la tapa e incube el plato a 37 grados centígrados durante tres días. Después de tres días, aspire la solución de precalcificación de las placas de cultivo celular de 96 pocillos precalcificadas y agregue 300 microlitros de solución de fosfato de calcio a cada pocillo. Cubra las placas con una tapa e incube a 37 grados centígrados durante un día.Luego invierta la placa para verter la solución y lave bien la placa tres veces con agua desionizada. Seque inmediatamente la placa con un secador de pelo o dióxido de carbono comprimido o gas nitrógeno para mantener una superficie uniforme. Ahora, irradia la placa recubierta en un banco limpio con rayos ultravioleta durante una hora.Use la placa recubierta inmediatamente o selle la placa con Parafilm y guárdela a temperatura ambiente. Diluya 15 mililitros de sangre fresca con un volumen igual de PBS y mézclelos invirtiendo o pipeteando varias veces. Luego tome 15 mililitros de solución de gradiente de densidad en un tubo cónico de 50 mililitros, incline el tubo y coloque cuidadosamente 30 mililitros de muestra de sangre diluida en los 15 mililitros de solución de gradiente de densidad.Más tarde, centrifugue el tubo en un rotor de cucharón oscilante sin romperse a 810 veces G durante 20 minutos a 20 grados centígrados. Luego aspire la capa superior dejando la capa de células mononucleares sin perturbar en la interfaz. Transfiera cuidadosamente la capa de células mononucleares a un nuevo tubo cónico de 50 mililitros.Llene el tubo con PBS, mezcle y centrífique a 300 veces G durante 10 minutos a 20 grados centígrados. Vuelva a suspender PBMC en un alfa-MEM completo que contenga 20 nanogramos por mililitros de factor estimulante de colonias de macrófagos, y siembre de 2,5 veces 10 a la quinta célula por centímetro cuadrado de PBMC en un matraz. Incubar las placas recubiertas de fosfato de calcio con 50 microlitros de suero fetal bovino a 37 grados centígrados durante una hora.A continuación, lave el matraz dos veces con PBS para separar los precursores de osteoclastos de las células muertas o no adherentes, luego agregue cuatro mililitros de tripsina por matraz de 75 centímetros cuadrados. Después de 30 minutos, detenga la digestión agregando cuatro mililitros de alfa-MEM completo, luego separe cuidadosamente las células con un raspador celular. Transfiera las células a un tubo de 50 mililitros y cuente el número total de células utilizando una cámara de conteo.Centrifugar el tubo a 350 veces G durante siete minutos para granular las células y volver a gastar el gránulo y completar alfa MEM que contiene M-CSF y RANKL para obtener una vez 10 a las seis células por mililitro. Aspirar el suero fetal bovino a partir de la placa recubierta de fosfato de calcio, y pipetear 200 microlitros de suspensión celular por pozo. Después de la incubación, lave las células dos veces con PBS.Fije las células con 4% de paraformaldehído durante 10 minutos y lave de nuevo con PBS. Para la tinción, agregue un tampón de permeabilización a las células fijas e incube durante cinco minutos. Para teñir los filamentos de actina, incube las células con 100 microlitros de solución de faloidina marcada con Alexa Fluor 546 en PBS durante 30 minutos, luego aspire la solución de tinción y manche los núcleos usando 100 microlitros de Hoechst durante 10 minutos.Tiñe el recubrimiento de fosfato de calcio con 100 microlitros de 10 calceína micromolar y PBS durante 10 minutos. Después de lavar tres veces con PBS, capture imágenes. Para la tinción Von Kossa del recubrimiento de fosfato de calcio, agregue 50 microlitros de nitrato de plata al 5% y agua desionizada a cada pozo, e incube la placa bajo radiación ultravioleta durante una hora hasta que el recubrimiento en el fondo de los pozos se haya vuelto marrón.El recubrimiento de fosfato de calcio en la parte inferior de las placas de 96 pozos parecía ser uniforme y bien adherido. Después de nueve días de cultivo en M-CSF y RANKL en las placas recubiertas de fosfato de calcio, los precursores de osteoclastos formaron fosas de reabsorción y osteoclastos grandes. Los osteoclastos multinucleados ubicados en los pozos expresaron altos niveles de TRAP.Los osteoclastos maduros mostraron la presencia de tres o más núcleos y el anillo de actina distinto. El recubrimiento de fosfato de calcio verde mostró la presencia de fosas de reabsorción negras. Las imágenes de fluorescencia del área del pozo se midieron utilizando la herramienta de umbral de la imagen J.El número y el tamaño de los osteoclastos se calcularon utilizando el gestor de ROI y la herramienta de selección de polígonos de la imagen J.Los precursores de los osteoclastos cultivados en ausencia de RANKL no pudieron formar pozos de reabsorción, sin embargo, M-CSF y RANKL facilitaron la formación de hoyos osteoclastogénicos.Y el área del pozo se cuantificó utilizando la imagen J.El secado inmediato de la placa recubierta con flujo de aire ayuda a hacer un recubrimiento uniforme de fosfato de calcio. De lo contrario, es propenso a formar una capa más gruesa en el medio del pozo.

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Investigación

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Medicina

Este video muestra la técnica de tinción de fosfatasa ácida resistente al tartrato para detectar la presencia de gránulos que contienen TRAP dentro de los osteoclastos. La técnica forma depósitos de gránulos de colorante de color magenta en el citoplasma de los osteoclastos, haciéndolos visibles bajo un microscopio invertido.

Tinción con fosfatasa ácida resistente al tartrato: una técnica in vitro para detectar osteoclastos cultivados que contienen la enzima TRAP

En este video, describimos un ensayo de reabsorción osteoclástica in vitro en placas de cultivo celular recubiertas de fosfato de calcio cultivadas con osteoclastos derivados de células mononucleares de sangre periférica humana. Los osteoclastos forman un anillo de actina característico en la matriz recubierta de fosfato de calcio de la placa de cultivo celular y degradan la matriz dentro de la región del anillo de actina para liberar iones de calcio y fosfato, lo que resulta en la formación de...

Ensayo de fosa de resorción: una técnica in vitro para cuantificar la actividad de resorción de calcio de osteoclastos maduros utilizando placas de cultivo recubiertas de fosfato de calcio

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Ensayo de mineralización in vitro: un método colorimétrico para cuantificar los depósitos de calcio osteoblásticos en el sustituto de injerto óseo mediante tinción y extracción de rojo de alizarina S

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Un protocolo simple de ensayo de fosa para visualizar y cuantificar la reabsorción osteoclástica in vitro

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