Un método biológico semiautomatizado y reproducible para cuantificar la deposición de calcio in vitro

Nuestro método permite medir la propensión a la calcificación de muestras de pacientes utilizando células del músculo liso vascular humano. Esto ayudará a impulsar la investigación sobre los trastornos de calcificación vascular, ayudando en el desarrollo de nuevas terapias. Esta técnica utiliza una detección basada en fluorescentes, que aumenta la sensibilidad y permite medir muestras a lo largo del tiempo, reduciendo así la necesidad de réplicas y aumentando la robustez.

Para comenzar, cultive células de músculo liso vascular humano en matraces de cultivo celular no recubiertos a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono. Dividir las células al alcanzar 70 a 90% de confluencia. Para dividir, lave los HVSMC dos veces con PBS.

Agregue tripsina e incube durante 2 a 5 minutos a 37 grados centígrados. Inhibir la reacción de tripsina añadiendo un medio que contenga suero. Centrifugar las células durante 4 minutos a 350 RCF y resuspender el pellet en un medio de mantenimiento.

Después de preparar las células para una división como se demuestra, cuente y siembre las células en una placa de 48 pocillos para comenzar el experimento de calcificación. Después de la incubación nocturna a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono, lave suavemente las células dos veces con PBS, aspirando cuidadosamente todo el PBS restante después del segundo lavado. Agregue suavemente el medio de calcificación y luego incube a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono.

Verifique diariamente con un microscopio óptico hasta que se produzca la calcificación. Para detectar la calcificación mediante imágenes, abra el software y seleccione Protocolos y Crear nuevo. Seleccione Procedimiento y haga clic en Establecer temperatura.

Establezca la temperatura en 37 grados centígrados y el gradiente en 1 grado centígrado en la ventana emergente y haga clic en Aceptar. Seleccione el tipo de placa de su elección en el menú desplegable. Agregue el paso de imagen haciendo clic en Imagen. Seleccione el generador de imágenes invertido y haga clic en Aceptar. Agregue tres canales de imágenes y configúrelos en DAPI, RFP y Bright Field.

Marque la casilla Montaje y establezca el número y la ubicación deseados de las imágenes. Cambie la superposición para representar una mejor cobertura de cada pozo. Seleccione qué pozos se van a fotografiar.

Se abrirá una nueva ventana donde se pueden seleccionar los pozos de interés. Haga clic en Opciones de enfoque para establecer el modo de enfoque. Se abrirá una nueva ventana.

Establezca cada canal individualmente. Comúnmente, los pozos se enfocan automáticamente en el canal DAPI. Establezca todos los demás canales en Altura focal fija desde el primer canal y configúrelos haciendo clic en Aceptar. Cierre la ventana.

Inicie los pasos de reducción de datos preestablecidos haciendo clic en Reducción de datos y seleccione Preprocesamiento de imágenes. Acepte la configuración predeterminada seleccionando Aceptar. Configure un paso para contar las celdas seleccionando Análisis celular. Seleccione TsF DAPI Images (Imágenes DAPI de TsF) en el menú desplegable del canal.

Establezca más detalles después de que se hayan realizado las imágenes. Prepare el análisis de la señal RFP seleccionando Estadísticas en el paso Etiqueta de la ventana emergente y seleccione RFP de TsF como canal de entrada. Marque las casillas Valor superior y Valor inferior.

Marque la casilla Área total en la lista inferior. Seleccione Ninguno en la columna Efecto de color. En la ventana emergente, haga clic en Personalizado y marque la casilla Fondo.

Pulse OK. Para una lectura justa, normalice la señal RFP por celda presionando Ratio en el lado izquierdo. En la ventana emergente, seleccione RFP Quantification Total Area (Área total de cuantificación de RFP). Para Data Input 1 (Entrada de datos 1) en el menú desplegable (Recuento de celdas como entrada de datos 2).

Finalmente, seleccione un Nuevo nombre de conjunto de datos y presione OK dos veces. Seleccione Efecto de color como se demostró anteriormente y haga clic OK.In la esquina superior izquierda, seleccione Archivo y guarde el archivo como un tipo de archivo de protocolo. Registre las observaciones para cada punto de tiempo después de que ocurra la primera instancia de calcificación.

Presione Leer ahora en el software de inicio y haga clic en Protocolo existente. Seleccione el protocolo creado en el paso anterior. El programa le pedirá que guarde el experimento.

Esto se puede hacer en esta etapa o más tarde manualmente haciendo clic en el botón Guardar en la parte superior izquierda. Una ventana emergente le pedirá que espere a que el sistema se caliente. Encienda el controlador de gas de dióxido de carbono y configúrelo al 5%Una vez que el sistema haya alcanzado la temperatura establecida, aparecerá un mensaje para insertar una placa y leer.

Presione Cancelar. Transporte la placa desde la incubadora hasta el generador de imágenes en una caja fuerte para evitar roturas y derrames y está en línea con las normas locales de bioseguridad para el transporte de células vivas en caso de accidente. Coloque la placa en el lector de placas.

Haga clic en Procedimiento. En la ventana emergente, seleccione Paso de imágenes preestablecidas. Ajuste primero el enfoque y la exposición en el canal DAPI.

Desmarque la casilla Exposición automática en todos los canales y, a continuación, haga clic en el icono del microscopio situado junto al canal DAPI. Se abrirá una nueva ventana. Seleccione el pozo para dirigir el enfoque.

Si una señal ya está visible, primero haga clic en Enfoque automático y, a continuación, en Exposición automática. Si no es así, primero, aumente la exposición y repita el enfoque automático y la exposición automática. La exposición se puede ajustar manualmente seleccionando el menú desplegable Exposición.

Verifique la configuración en varios pozos y luego guarde la configuración. Ajuste la exposición de la misma manera para todos los canales. Para el canal RFP, asegúrese de comenzar con un pozo con calcificación media a alta.

Cierre la ventana de procedimiento y seleccione el botón verde Leer ahora en la barra de tareas superior. Guarde el experimento como indica el software. Repita este proceso para cada punto de tiempo.

Mientras el sistema lee la placa, todas las imágenes se procesan automáticamente en segundo plano. Ajuste la configuración del recuento de celdas seleccionando las imágenes DAPI de TsF para mostrar. Seleccione el pozo de su elección haciendo doble clic.

Aparecerá una nueva ventana. Seleccione una de las imágenes. Seleccione la pestaña Análisis en la ventana emergente.

Seleccione Recuento de células de análisis celular y haga clic en Aceptar. Anule la selección de los canales RFP y Bright Field. Marque la casilla Resaltar objetos. Haga clic en Opciones para abrir el menú.

Ajuste el umbral de tamaño e intensidad para incluir todos los núcleos, pero excluya los residuos y, a continuación, haga clic en Aceptar. Haga clic en Aplicar cambios en la parte inferior izquierda para aplicar la configuración a todas las imágenes. Del mismo modo, seleccione una imagen de fondo con una cantidad media a alta de calcificación. Para ajustar mejor la relación señal-ruido, haga clic en la ficha Análisis del menú Tarea.

Seleccione Estadísticas de imagen. Anule la selección del canal DAPI y Bright Field. Haga clic en Opciones para abrir el menú.

Marque la casilla Valores atípicos de umbral. Para establecer el valor de umbral no subjetivo para la señal sobre el fondo, seleccione la herramienta Línea en la barra de tareas. Aparecerá una ventana.

Dibuja una línea a través de un parche de señal mientras incluyes un área del fondo. Ajuste los umbrales superior e inferior valores. Solo cuente la señal sobre el fondo y excluya si hay escombros o artefactos.

Haga clic en Aceptar y aplique los cambios para transferir la configuración a todos los demás pozos. Confirme que el umbral se selecciona con precisión en los otros pozos. Una vez establecidos los umbrales de recuento de celdas y RFP, exporte los datos.

Haga clic en el botón Excel junto al menú desplegable para exportar los datos directamente a una hoja de cálculo. Se detectaron y analizaron diferentes etapas de calcificación que van de baja a alta. La calcificación se detectó como manchas negras utilizando microscopía óptica, que fueron útiles para la evaluación primaria y la determinación de cuándo comenzar la obtención de imágenes.

Para mejorar la relación señal-ruido, se analizaron las imágenes RFP procesadas para cuantificar la calcificación. Los datos se obtuvieron comparando dos o más condiciones en el mismo punto de tiempo. Los datos se normalizaron al recuento de células como área de calcificación por célula.

Los datos también se representaron como una serie de tiempo que muestra la misma condición en varios puntos de tiempo. Es importante que los resultados después de la reducción y el análisis de datos aún reflejen lo que se puede ver antes de la transformación de la imagen y el umbral.