Name: Aislamiento de células del linaje monocito-macrófago de huesos de rata por método de adherencia secundaria (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 19 s
Description: Aprenda a aislar células del linaje monocito-macrófago de médula ósea de ratas mediante el método de adherencia secundaria. Esta técnica permite obtener un modelo celular estable para estudiar la diferenciación de osteoclastos in vitro y avanzar en la investigación de la osteoporosis.

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Este trabajo fue apoyado por la Fundación de Ciencias Naturales de la provincia de Zhejiang (subvención no. LY19H060001) y el Proyecto del Plan de Ciencia y Tecnología de Medicina Tradicional China de Zhejiang (no. 2022ZB093).

Todos los experimentos en este estudio se llevaron a cabo de acuerdo con las pautas de experimentación con animales del Centro de Investigación de Animales de Laboratorio de la Universidad Médica China de Zhejiang (Número de aprobación: IACUC-20181029-11).
1. Extracción celular
<ol><li>Coloque a las ratas Sprague-Dawley (ratas SD, de 1 a 10 días de edad, macho o hembra) en las jaulas de eutanasia llenas de CO2 a una tasa equilibrada de 30% -70% de volumen / minuto del contenedor. Después de que las ratas pierden el conocimiento (20-60 min), eutanasia a la rata por dislocación cervical para asegurar una muerte indolora.</li>
	<li>Sumergir a las ratas en alcohol al 75% durante 10 min para su desinfección.</li>
	<li>Retire cuidadosamente todas las extremidades de la rata con tijeras y fórceps, aspire con PBS usando una pipeta y enjuague la sangre adherida a las extremidades.</li>
	<li>Agregue 5 ml de solución de penicilina/estreptomicina en 500 ml de DMEM y mezcle bien. Tome un tubo de centrífuga estéril de 50 ml, agregue 5 ml de FBS y 45 ml de medio DMEM, y mezcle bien para obtener una solución de DMEM de FBS al 10% que contenga una solución de penicilina / estreptomicina al 1%. Agregue 2 ml del medio de cultivo anterior en un tubo de 5 ml.</li>
	<li>Transfiera los huesos de las extremidades al tubo de 5 ml. Use tijeras para cortar los huesos de las extremidades en el tubo en trozos pequeños (1-3 mm) y mezcle el homogeneizado para volver a suspender las células de la médula ósea en el medio de cultivo. Párese durante 5 minutos hasta que los fragmentos de tejido se asienten en la parte inferior del tubo.</li>
	<li>Agregue 10 ml de DMEM fbs al 10% en un plato de cultivo de 100 mm y luego transfiera el sobrenadante al plato de cultivo. Al aspirar el sobrenadante, evite transferir los restos de tejido a la placa de cultivo.</li>
	<li>Incubar a 37 °C y 5% de CO2 durante aproximadamente 24 h. Después de este tiempo de incubación, la mayoría de las células madre mesenquimales se adherirán a la pared del plato de cultivo y crecerán lentamente, mientras que la mayoría de losBM aún estarán suspendidos en el medio de cultivo.</li>
	<li>Transfiera la suspensión celular en el plato de cultivo de 100 mm a un nuevo matrazde 25 cm 2 y continúe cultivando las células a 37 °C y 5% de CO2 durante 24 h adicionales. LosBMM se adherirán a la pared del matraz a las 24-48 h de cultivo. Retire el medio viejo con cuidado y reemplácelo con medio fresco después de que losBM se hayan adherido a la pared del matraz.</li>
	<li>Subcultivo cuando las células en el matraz alcanzaron una confluencia del 80%-90%. NOTA: Todas las células se cultivaron a 37 °C y 5% de CO2. Durante el cultivo, la morfología celular se unificó gradualmente. Las células eran grandes, de forma irregular, crecían radialmente y se unían al matraz en forma de disco, donde se podían observar múltiples núcleos.</li>
</ol>2. Tinción FACS de la célula
<ol><li>La tripsina digiere utilizando 1-2 ml de tripsina comercial a 37 °C y 5% de CO2 durante 5 min y cuenta las células adherentes secundarias para asegurar un recuento final de células de 100.000/muestra (cuenta las células con hemocitómetro neubauer).</li>
	<li>Divida las células en tres grupos (500 μL de PBS contiene 100.000 células): (1) el grupo de control en blanco que contiene células no teñidas; (2) el grupo de control de isotipos; y (3) el grupo experimental (tinción CD11b/c).</li>
	<li>Incubar anticuerpos primarios (sin anticuerpo para el grupo de control en blanco; control de isotipo anti-CD11 para el grupo de control de isotipo, 0,6 μL de anticuerpo/muestra, 1 μg/muestra; anti-CD11b/c para el grupo experimental, 1 μL de anticuerpo/muestra, 1 μg/muestra) en hielo durante 30 min.</li>
	<li>Centrifugar a 300-350 x g durante 5 min, desechar el sobrenadante y volver a suspender las células con 500 μL de PBS. Repita el procedimiento anterior una vez para asegurarse de que los anticuerpos primarios no unidos se eliminen.</li>
	<li>Incubar el anticuerpo secundario correspondiente (sin anticuerpo para el grupo de control en blanco; IgG anti-conejo de cabra para el control de isotipos y los grupos experimentales, anticuerpo/muestra de 0,25 μL, 1:2.000) en hielo en la oscuridad durante 30 min.</li>
	<li>Centrifugar a 300-350 x g durante 5 min, desechar el sobrenadante y volver a suspender las células con 500 μL de PBS. Repita el procedimiento anterior una vez para asegurarse de que los segundos anticuerpos no unidos se eliminen.</li>
	<li>Detecte las células CD11b/c positivas mediante citometría de flujo (10.000 células/muestra) y analice los datos por software (por ejemplo, FlowJo 7.5). NOTA: Para obtener el porcentaje final de células CD11b/c+, se utilizó la siguiente fórmula: Porcentaje de células CD11b/c+ en el grupo experimental - el porcentaje de células CD11+ en el grupo control de isotipos.</li>
</ol>3. Tinción wright-giemsa
<ol><li>Sembrar las células secundarias adherentes que han sido pasadas tres veces sobre láminas trepadoras de 35 mm2 células (1 × 106 células/pozo) y cultivar a 37 °C y 5% CO2 durante 24 h.</li>
	<li>Deseche el medio de cultivo y lave tres veces con PBS.</li>
	<li>Añadir la solución de colorante Wright-Giemsa (0,5 mL-0,8 mL) a la lámina de escalada celular durante 1 min.</li>
	<li>Mezcle el tinte con agua destilada (0.5 mL-0.8 mL) con un hisopo de algodón y descanse durante 10 min.</li>
	<li>Lave la solución de tinte con agua destilada y luego séquela durante 1-3 min. Observar bajo un microscopio.</li>
</ol>4. Tinción TRAP
<ol><li>Sembrar las células secundarias adherentes que han sido pasadas tres veces sobre láminas trepadoras de 35 mm2 células (1 × 106 células/pozo) y cultivar a 37 °C y 5% CO2 durante 24 h.</li>
	<li>Reemplace el medio antiguo con el DMEM FBS al 10% o el medio de inducción de osteoclastos suplementado con 50 ng / ml activador del receptor del ligando del factor nuclear κB (RANKL) y 30 ng / ml de factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF), y cultive a 37 ° C y 5% de CO2 durante 7 días adicionales.</li>
	<li>Manche las células con el kit de tinción TRAP de acuerdo con el protocolo del fabricante y observe bajo un microscopio. NOTA: Las células TRAP-positivas se definieron como osteoclastos, que eran de color púrpura bajo un microscopio de luz. El número de células TRAP-positivas se midió utilizando el software ImageJ.</li>
</ol>5. Western blot
<ol><li>Sembrar las células secundarias adherentes que han sido pasadas tres veces en láminas trepadoras de 35 mm2 células (1 × 106 células/pozo) y cultivo durante 24 h.</li>
	<li>Reemplace el medio antiguo con DMEM de FBS fresco al 10% o medio de inducción de osteoclastos (50 ng / ml de RANKL y 30 ng / ml de M-CSF) y cultive durante 7 días adicionales a 37 ° C y 5% de CO2.</li>
	<li>Extraer proteínas celulares totales con tampón RIPA, separadas por 10% SDS-PAGE, y transferir a membranas de fluoruro de polivinilideno18,19.</li>
	<li>Bloquee con polvo de leche desnatada al 5% (25 ml) durante 2 h y lave tres veces, durante 10 minutos cada vez, con TBS-Tween 20 (TBST).</li>
	<li>Incubar anticuerpos primarios a 4 °C durante la noche (anti-β-actina, anti-TRAP y anti-catepsina K; todos los anticuerpos primarios se diluyeron 1:1.000, 10 ml de anticuerpos/banda diluidos), y lavar tres veces con TBST.</li>
	<li>Incubar el anticuerpo secundario (IgG anti-conejo de cabra, dilución 1:2.000, anticuerpo/banda diluida de 10 ml) a temperatura ambiente durante 2 h, y lavar tres veces con TBST. Visualice las bandas de proteínas utilizando una solución en desarrollo. NOTA: Los niveles de expresión de las proteínas anteriores se normalizaron a β-actina.</li>
</ol>

<ol><li>Jakubzick, C. V., Randolph, G. J., Henson, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte+differentiation+and+antigen-presenting+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Monocyte differentiation and antigen-presenting functions.</a> Nature Reviews. Immunology. 17 (6), 349-362 (2017).</li>
<li>Locati, M., Curtale, G., Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity%2C+mechanisms%2C+and+significance+of+macrophage+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Diversity, mechanisms, and significance of macrophage plasticity.</a> Annual Review of Pathology. 15 (1), 123-147 (2020).</li>
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<li>Zhou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt%2F%C3%9F-catenin-mediated+p53+suppression+is+indispensable+for+osteogenesis+of+mesenchymal+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">Wnt/ß-catenin-mediated p53 suppression is indispensable for osteogenesis of mesenchymal progenitor cells.</a> Cell Death & Disease. 12 (6), 521-534 (2021).</li>
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<li>Li, Z., MacDougald, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+models+for+investigating+how+bone+marrow+adipocytes+influence+bone+and+hematopoietic+cellularity%5BTitle%5D)+AND+%22Best+Practice+%26+Research.+Clinical+Endocrinology+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Preclinical models for investigating how bone marrow adipocytes influence bone and hematopoietic cellularity.</a> Best Practice & Research. Clinical Endocrinology & Metabolism. 35 (4), 101547-101560 (2021).</li>
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<li>Schyns, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-classical+tissue+monocytes+and+two+functionally+distinct+populations+of+interstitial+macrophages+populate+the+mouse+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Non-classical tissue monocytes and two functionally distinct populations of interstitial macrophages populate the mouse lung.</a> Nature Communications. 10 (1), 3964-3980 (2019).</li>
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<li>Yu, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+of+myeloid+cells+in+human+blood%2C+bronchoalveolar+lavage%2C+and+lung+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis of myeloid cells in human blood, bronchoalveolar lavage, and lung tissues.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 54 (1), 13-24 (2016).</li>
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<li>Jacquin, C., Gran, D. E., Lee, S. K., Lorenzo, J. A., Aguila, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+multiple+osteoclast+precursor+populations+in+murine+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Identification of multiple osteoclast precursor populations in murine bone marrow.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 21 (1), 67-77 (2006).</li>
<li>Gibbings, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+unique+interstitial+macrophages+in+the+murine+lung+at+steady+state%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Three unique interstitial macrophages in the murine lung at steady state.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 57 (1), 66-76 (2017).</li>
<li>Higashi, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-high-speed+western+blot+using+immunoreaction+enhancing+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Ultra-high-speed western blot using immunoreaction enhancing technology.</a> Journal of Visualized Experiments. (163), e61657(2020).</li>
<li>Gallagher, S., Chakavarti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoblot+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Immunoblot analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. 20 (16), 759(2008).</li>
<li>Yin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycyrrhizic+acid+suppresses+osteoclast+differentiation+and+postmenopausal+osteoporosis+by+modulating+the+NF-%CE%BAB%2C+ERK%2C+and+JNK+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmocology%22%5BJournal%5D)">Glycyrrhizic acid suppresses osteoclast differentiation and postmenopausal osteoporosis by modulating the NF-κB, ERK, and JNK signaling pathways.</a> European Journal of Pharmocology. 859, 172550(2019).</li>
<li>Liu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LRRc17+controls+BMSC+senescence+via+mitophagy+and+inhibits+the+therapeutic+effect+of+BMSCs+on+ovariectomy-induced+bone+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biology%22%5BJournal%5D)">LRRc17 controls BMSC senescence via mitophagy and inhibits the therapeutic effect of BMSCs on ovariectomy-induced bone loss.</a> Redox Biology. , (2021).</li>
<li>Jin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thioacetamide+promotes+osteoclast+transformation+of+bone+marrow+macrophages+by+influencing+PI3K%2FAKT+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopedic+Surgery+and+Research%22%5BJournal%5D)">Thioacetamide promotes osteoclast transformation of bone marrow macrophages by influencing PI3K/AKT pathways.</a> Journal of Orthopedic Surgery and Research. 17 (1), 53-63 (2022).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses contrapuestos.

Los osteoclastos son uno de los tipos celulares más importantes involucrados en la aparición y desarrollo de enfermedades óseas, así como uno de los principales objetos de investigación de enfermedades óseas20. Los monocitos/macrófagos pueden diferenciarse en osteoclastos. Dado que los macrófagos mononucleares (células RAW264.7) son demasiado caros de comprar y se activan fácilmente durante el cultivo, es difícil realizar experimentos de diferenciación in vitro utilizando esta línea celul...

Se ha informado que las células del linaje monocitos-macrófagos existentes en la médula ósea pueden diferenciarse en monocitos sanguíneos y macrófagos tisulares 1,2. Las células anteriores, que pueden diferenciarse en osteoclastos para equilibrar el crecimiento y desarrollo óseo, se utilizan comúnmente como modelo celular para inducir osteoclastos in vivo 3,4. La médula ósea es un tejido especial que contiene varios tipos diferentes de células, que incluyen, entre otras, células madre mesenquimales de la médula ósea, células de monocitos-macrófagos (BMM) de la médula ósea, células madre hematopoyéticas, células endoteliales y células inmunes. De hecho, varios estudios previos sugirieron que las células adherentes que salían precipitadas de la cavidad de la médula ósea del hueso largo podrían diferenciarse en osteoblastos, osteoclastos, condrocitos o adipocitos 5,6,7,8. Aunque se han utilizado diferentes métodos de aislamiento y cultivo para producir diferentes poblaciones celulares homogéneas, todavía existen grandes desafíos para aislar y cultivar BMM de una variedad de tipos de células diferentes.
Se han desarrollado varios métodos para extraer macrófagos mononucleares de médula ósea (BMSC). Sin embargo, la mayoría de estos métodos son complejos 9,10,11. Por ejemplo, la centrifugación por gradiente de densidad requiere un kit especializado y la operación requiere mucho tiempo y es engorrosa. Este método es adecuado para el aislamiento de BMM a partir de muestras de sangre de alto volumen, pero no de muestras de médula ósea 9,12,13. Además, la extracción de muestras de tejido mediante la digestión de la colagenasa es un procedimiento complejo y lento; este método no se recomienda para el aislamiento de BMM a partir de muestras de médula ósea14,15. Además, aunque la separación de flujo puede resultar en poblaciones de monocitos/macrófagos altamente purificadas, requiere tamaños de muestra muy grandes y altos requisitos de instrumentos y equipos10,16. Además, el método de enriquecimiento de microperlas es extremadamente costoso y no es factible en un laboratorio general17.
Por lo tanto, en el estudio actual se propuso un método conveniente, rápido y barato para el aislamiento de macrófagos mononucleares de la médula ósea. Las células de la médula ósea adheridas durante diferentes puntos de tiempo se utilizaron para aislar BMM utilizando un método de adherencia secundaria. Los BMM extraídos con el método anterior podrían inducir la formación de osteoclastos in vitro, proporcionando así un modelo celular simple y conveniente para el futuro estudio de la osteoporosis in vitro.

<table><tbody><tr><td>35 mm2 rodajas trepadoras de células</td><td>NEST Biotechnology</td><td>80102</td><td></td></tr><tr><td>Anti-catepsina K</td><td>Abcam</td><td>ab19027</td><td>1:1.000</td></tr><tr><td>Control de isotipo anti-CD11</td><td>Abcam</td><td>ab172730</td><td>1 &mu; g/prueba,1.675 mg/Ml</td></tr><tr><td>Anti-CD11b/c</td><td>Absin</td><td>abs124232</td><td>&nbsp; 1&mu; g/prueba, 1 mg/mL</td></tr><tr><td>Anti-TRAP</td><td></td><td>Abcam ab191406</td><td>1:1.000</td></tr><tr><td>Anti-&beta;-actina</td><td>Beyotime</td><td>&nbsp; AF5003</td><td>1:1.000</td></tr><tr><td>Lonchas trepadoras de células</td><td>NEST Biotechnology</td><td>80102</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultivo celular</td><td>corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>Matraz de cultivo celular</td><td>corning</td><td>430168</td><td></td></tr> medio <tr><td>de águila modificado de Dulbecco (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>C11995500BT</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>Gibco</td><td>10099141C</td><td></td></tr><tr><td>IgG anticonejo de cabra Abcam</td><td></td><td>ab150077</td><td>para IF, 1:2.000</td></tr><tr><td>anti-conejo de cabra IgG</td><td>Abcam</td><td>ab6721</td><td>para WB, 1:2.000</td></tr><tr><td>M-CSF</td><td>Pepro tech</td><td>400-28</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Biosharp</td><td>BL302A</td><td></td></tr><tr><td>RANKL</td><td>Pepro tech</td><td>400-30</td><td></td></tr><tr><td>SD rata</td><td>Shanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd</td><td></td><td>1-10 días de edad</td></tr><tr><td>SDS-PAGE kit de preparación de gel</td><td>Solarbio</td><td>P1200</td><td></td></tr><tr><td>TRAP/ALP kit de tinción</td><td>Wako</td><td>294-67001</td><td></td></tr><tr><td>Solución de tripsina-EDTA</td><td>Biosharp</td><td>BL512A</td><td></td></tr><tr><td>solución Wright-Giemsa</td><td>Keygen Biotech</td><td>KGA225-1</td><td></td></tr></tbody></table>

aislamiento de células del linaje monocito-macrófago de huesos de rata por método de adherencia secundaria

Isolation of Monocyte-Macrophage Lineage Cells from Rat Bones by Secondary Adherence Method

Con una disminución de la densidad mineral ósea, los huesos tienen más probabilidades de fracturarse, lo que afecta negativamente la calidad de vida de un paciente. El crecimiento y desarrollo de los huesos están regulados principalmente por osteoblastos y osteoclastos. Se ha aceptado ampliamente que los osteoclastos se derivan de las células de monocitos-macrófagos de la médula ósea (BMM). LosBMm y otras células madre hematopoyéticas se encuentran en la cavidad de la médula ósea. Por lo tanto, aislar BMM estables individuales de poblaciones celulares diferentes y heterogéneas es un gran desafío. Aquí presentamos un protocolo para el aislamiento de BMM de ratas SD, llamado método de adherencia secundaria. Se recogieron células adherentes cultivadas durante 24-48 h en cultivo primario. El análisis citométrico de flujo mostró que aproximadamente el 37,94% de las células eran CD11b/c+ (antígeno de superficie monocito-macrófago). La tinción de fosfatasa ácida resistente al tartrato (TRAP) y el análisis de western blot demostraron que losBMM podían diferenciarse en osteoclastos in vitro. Los hallazgos anteriores sugirieron que las células de adherencia secundaria podrían considerarse como un modelo celular adecuado para la investigación de la diferenciación de osteoclastos.

La población secundaria de células adherentes fue estable y uniforme. Con la proliferación celular continua, la mayoría de las células se hicieron más grandes, con forma irregular y crecieron en un disco adherente radial (Figura 2C, D). La citometría de flujo mostró que el porcentaje de células que expresan CD11b/c, un marcador molecular en la superficie de las células del linaje monocito-macrófago, fue de aproximadamente el 37,94% (<strong c...

Aquí presentamos un protocolo para el aislamiento de BMM de ratas SD, llamado método de adherencia secundaria.

Aislamiento de células del linaje monocito-macrófago de huesos de rata por método de adherencia secundaria

With a decrease of bone mineral density, bones are more likely to fracture, thus negatively affecting a patient's quality of life. The growth and ...

En este protocolo, las células de monocitos-macrófagos de la médula ósea se extraen por el método de adherencia secundaria. Las células de monocitos-macrófagos de la médula ósea pueden diferenciarse con éxito en osteoclastos, lo que proporciona un modelo celular estable para el estudio de los osteoclastos in vitro. Este método es adecuado para pequeñas muestras de médula ósea y puede extraer células de monocitos-macrófagos de médula ósea de la médula ósea de manera simple y rápida sin requerir equipos de laboratorio de alta tecnología.El aumento de osteoclastos puede ser la patogénesis potencial de la osteoporosis. Las células de monocitos-macrófagos de la médula ósea tienen cierto valor de investigación como células precursoras de osteoclastos. Para comenzar, sumerja a las ratas sacrificadas en alcohol al 75% durante 10 minutos para la desinfección.Después de extraer cuidadosamente todas las extremidades de la rata con tijeras y fórceps, aspire con PBS usando una pipeta y enjuague la sangre adherida a las extremidades. Luego, a dos mililitros del 10% FBS DMEM en un tubo de cinco mililitros. Después de transferir los huesos de las extremidades al tubo de cinco mililitros, use tijeras para cortar los huesos de las extremidades en el tubo en trozos pequeños y mezcle el homogeneizado para resuspendir las células de la médula ósea en el medio de cultivo.Párese durante cinco minutos hasta que los fragmentos de tejido se asienten en la parte inferior del tubo. A continuación, agregue 10 mililitros de 10% FBS DMEM en un plato de cultivo de 100 milímetros y luego transfiera el sobrenadante al plato de cultivo. Incubar a 37 grados Centígrados en 5% de dióxido de carbono durante aproximadamente 24 horas.Después de este tiempo de incubación, la mayoría de las células madre mesenquimales se adherirán a la pared del plato de cultivo y crecerán lentamente, mientras que la mayoría de las células de monocitos-macrófagos de la médula ósea aún estarán suspendidas en el medio de cultivo. Transfiera la suspensión celular en el plato de cultivo de 100 milímetros a un nuevo matraz cuadrado de 25 centímetros y continúe cultivando las células a 37 grados Celsius en 5% de dióxido de carbono durante 24 horas adicionales. Después de retirar el medio viejo con cuidado, reemplácelo con medio fresco después de que las células de monocitos-macrófagos de la médula ósea se hayan adherido a la pared del matraz.La citometría de flujo mostró que el porcentaje de células que expresan CD11b y c, un marcador molecular en la superficie de las células del linaje de monocitos-macrófagos fue de aproximadamente el 37,94%Con la proliferación celular continua, la mayoría de las células se hicieron más grandes dentro de forma irregular y se convirtieron en un disco adherente radial. Los resultados de la tinción TRAP mostraron que, en comparación con el grupo de control, el número de gránulos rojos púrpura intracelulares aumentó significativamente en las células inducidas con el activador del receptor del ligando kappa B del factor nuclear y el factor estimulante de colonias de macrófagos. El análisis de Western blot demostró que los niveles de expresión de las proteínas específicas de osteoclasto TRAP y catepsina K aumentaron significativamente en las células tratadas en comparación con el grupo de control.Lo más importante en este procedimiento es el tiempo para recolectar células adherentes secundarias en 24 a 48 horas de cultivo primario, las células de monocitos-macrófagos de la médula ósea comienzan a adherirse por completo. Las células de monocitos-macrófagos de la médula ósea aisladas por este método pueden ser inducidas en osteoclastos in vitro, proporcionando un modelo celular estable para el estudio de la osteoporosis.

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Un nuevo método para obtener los macrófagos de los cultivos primarios de células de hígado de rata se describe. Este método utiliza la proliferación de los macrófagos en la cultura, seguida de temblor en frascos de cultivo y la purificación por el apego selectivo para platos de plástico. Esta técnica proporciona de manera eficiente los macrófagos del hígado sin necesidad de equipo y habilidades complejas.

Un método simple y eficaz para aislar los macrófagos de la Mezcla de cultivos primarios de células de hígado en adultos

Se presenta un protocolo simple y eficiente para la generación de macrófagos humanos. Buffy abrigos son procesados ​​por doble centrifugación en gradiente de densidad y monocitos aislados se diferencian a continuación, a los macrófagos en bolsas de cultivo de células de teflón. Esto maximiza el rendimiento de los macrófagos y facilita la recolección de células para los experimentos posteriores.

Aislamiento de monocitos humanos por doble centrifugación en gradiente y su diferenciación a macrófagos en Bolsos Cultivo Celular recubiertos de teflón

Aquí presentamos un protocolo que genera grandes cantidades de monocitos murinos a partir de médula ósea heterogénea para aplicaciones traslacionales. En comparación con otros, este nuevo método ayuda a reducir el número de animales sacrificados y reduce los costos al evitar métodos costosos como la separación de células magnéticas (MACS) de alto gradiente.

Aislamiento y la inyección intravenosa de murino médula ósea derivados monocitos

Este protocolo describe una técnica de aislamiento para obtener células mesenquimales del estroma residentes de pulmón primarios de ratas, mediante el uso de la digestión enzimática, la separación por gradiente de densidad, la adherencia de plástico y CD146 + selección de perlas magnéticas.

Aislamiento de CD146<sup&gt; +</sup&gt; Las células estromales mesenquimales de pulmón Residente de los pulmones de ratas

Los osteoclastos son policaryones de macrófagos específicos de los tejidos derivados del linaje de monocitos y macrófagos de las células madre hematopoyéticas. Este protocolo describe cómo aislar las células de la médula ósea de manera que se obtengan grandes cantidades de osteoclastos reduciendo el riesgo de accidentes encontrados en los métodos tradicionales.

Aislamiento, purificación y diferenciación de los precursores de osteoclastos de la médula ósea de rata

Este artículo presenta un método que combine la adherencia entera de la médula y el flujo cytometry que clasifica para aislar, cultivar, clasificar, e identificar las células madres mesenquimales de la médula de las mandíbulas de la rata.

Aislamiento Y Cultivo De Células Madre Mesenquimales De Médula Ósea Mandibular En Ratas

Aquí se presenta un protocolo para añadir péptido CD47 (pepCD47) a stents metálicos utilizando la química de polibisfosfonato. La funcionalización de los stents metálicos mediante pepCD47 evita la unión y activación de las células inflamatorias mejorando así su biocompatibilidad.

Mitigación de la fijación de células de flujo sanguíneo a implantes metálicos a través de la inmovilización de péptidos derivados de CD47

El presente protocolo describe el aislamiento y cultivo de macrófagos derivados de la médula ósea de ratones.

Aislamiento y cultivo de macrófagos derivados de la médula ósea a partir de ratones

Esta investigación describe dos técnicas para aislar abundantes trampas extracelulares de neutrófilos (TNE) de la médula ósea de rata. Un método combina un kit comercial de aislamiento de neutrófilos con centrifugación en gradiente de densidad, mientras que el otro emplea solo centrifugación en gradiente de densidad. Ambos enfoques producen TNE funcionales que superan a los de los neutrófilos de sangre periférica.

Enfoque único para aislar neutrófilos de médula ósea de rata con capacidad comparable

Este protocolo describe un método sencillo y no enzimático para aislar células de médula ósea de ratón neonatal de 7-9 días de edad y generar macrófagos diferenciados utilizando un sobrenadante de células L929 como fuente de factor estimulante de colonias de granulocitos (M-CSF). Los macrófagos derivados de la médula ósea se analizaron más a fondo para determinar los antígenos de superficie F4/80, CD206, CD11b y la competencia funcional.

Aislamiento de médula ósea de ratón neonatal y preparación de macrófagos derivados de la médula ósea

Las células madre mesenquimales de la médula ósea de la mandíbula tienen funciones significativas en la diferenciación diversa, la autorrenovación y la modulación inmunitaria. Se han convertido en un reservorio crucial de células precursoras en terapia génica, ingeniería de tejidos y medicina regenerativa. Aquí, presentamos un método único para aislar células madre mesenquimales de médula ósea de la mandíbula en ratas.

Técnica para el aislamiento y cultivo de células madre mesenquimales de médula ósea de mandíbula de rata

Aprenda a aislar células del linaje monocito-macrófago de médula ósea de ratas mediante el método de adherencia secundaria. Esta técnica permite obtener un modelo celular estable para estudiar la diferenciación de osteoclastos in vitro y avanzar en la investigación de la osteoporosis.

Aislamiento de células del linaje monocito-macrófago de huesos de rata por método de adherencia secundaria

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